摘要
VOWST（VOWST口服孢子，VOS；活菌粪便微生物孢子，原SER-109）是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的口服纯化厚壁菌门孢子制剂，用于预防复发性艰难梭菌感染（CDI）。尽管在一项开放标签的1b期研究中，86.7%（26/30）的复发性CDI患者在8周内未出现再次复发，但随后的双盲2期研究（NCT02437487）并未显示出比安慰剂有显著益处（8周时SER-109组与安慰剂组的复发率分别为44.1%与53.3%）。这些不一致的结果被假设是由于剂量不足所致。这一假设在一项关键的3期试验（NCT03183128）中得到了验证，该试验使用了约高十倍的剂量。在3期试验中，VOS治疗组患者在8周内仅有12%复发，而安慰剂组为40%（相对风险0.32，P<0.001）。本项后续事后分析通过跨试验比较证实，3期试验中具有疗效的高剂量与改善的药代动力学相关，通过VOS定植来评估（可获得样本的患者：1b期：28例，2期：79例，3期：170例）。3期试验的深入分析显示，VOS显著改变了微生物组成，显著增加了厚壁菌门物种的多样性和丰度，并减少了艰难梭菌和机会性病原体（如肠杆菌科物种）的流行率和丰度。与这些分类学变化一致，观察到关键生物活性代谢物的显著变化，包括结合和非结合初级胆汁酸的减少、次级胆汁酸的增加以及短链和中链脂肪酸的增加。体外实验中，VOS批次产生了这些抑制艰难梭菌的代谢物。这些关于VOS药理学的发现强调了在复发性CDI患者中快速恢复微生物组关键保护功能的重要性，以实现持久预防复发，正如3期研究中所观察到的；同时也突显了将微生物组纳入CDI临床管理的必要性。
主要内容
艰难梭菌感染（CDI）引起的致残性腹泻是由细菌毒素产生导致的炎症性结肠炎。艰难梭菌是一种独特的病原体，20-30%的患者尽管接受了抗生素治疗，仍会出现复发性感染，这是由于微生物组持续受到破坏。因此，仅使用抗生素管理复发性CDI（rCDI）历史上导致了高复发率，增加了住院和死亡风险。尽管胃肠道微生物群落在预防艰难梭菌复发中的作用复杂，但已有两种主要机制被假定可抑制艰难梭菌致病性。微生物介导的结合初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化可抑制艰难梭菌孢子萌发和生长。此外，微生物产生的短链或中链脂肪酸可能抑制艰难梭菌生长，抑制结肠炎症并维持上皮屏障完整性。然而，在rCDI患者中，胃肠道微生物组的特征是抗生素介导的共生细菌耗竭、细菌丰富度降低，从而导致次级胆汁酸和短链脂肪酸浓度降低。尽管有人提出粪便微生物移植（FMT）产品需要恢复抑制艰难梭菌的微生物组功能，但厚壁菌门（现更名为芽孢杆菌门）成员产生的孢子足以恢复艰难梭菌定植抗性。
粪便微生物孢子，活菌制剂（VOWST，原SER-109，以下简称VOS）是首个获得FDA批准的口服微生物组基础活体生物治疗产品。VOS由纯化的厚壁菌门细菌孢子组成，通过用乙醇处理严格筛选的健康供体的粪便物质制造，以杀死非孢子生物，随后进行过滤步骤以去除固体和残留乙醇。与FMT相比，VOS孢子纯化去除了许多粪便成分，包括营养态的变形菌门细胞。VOS制造步骤先前已证明可灭活细菌病原体、真菌、寄生虫和病毒，包括模型冠状病毒，从而降低了已知和新发传染病原体传播的风险。在一项针对有rCDI病史患者的3期双盲、安慰剂对照随机试验中，VOS在预防8周内复发方面优于安慰剂，并且耐受性良好。大多数CDI复发发生在抗生素停用后4周内，这突显了快速恢复与预防rCDI相关的微生物组功能的必要性。
VOS开发中的关键决策是通过评估药代动力学和药效学来指导的。定植（即药代动力学）被定义为胃肠道中新出现的VOS剂量物种数量，药效学是由此产生的微生物群和微生物相关代谢物的变化。一项开放标签、剂量范围的调查员发起的1b期研究显示低复发率，并且在不同剂量水平下VOS定植相似，导致随后进行了一项随机、安慰剂对照的2b期研究，使用较低的固定剂量（NCT02437487）。该2b期研究未能达到其主要疗效终点。后续药理学评估导致假设这些明显不一致的结果是由于VOS剂量滴度和频率的差异，导致定植减少和次级胆汁酸浓度降低。在3期试验（NCT03183128）中，给予约高10倍的剂量，持续3天，该试验证明VOS在预防rCDI方面优于安慰剂。鉴于成功的3期研究，我们将3期试验的药代动力学与1b期和2期试验进行了比较，以解决VOS临床开发计划中不同剂量方案导致不同临床结果的假设。然后，我们对3期试验中社区和功能性微生物组变化进行了深入的事后分析，以深入了解VOS的作用机制。
结果
患者情况
3期试验中随机分配了182名患者（59.9%为女性，平均年龄65.5岁；扩展数据表1）。所有患者至少有三次CDI发作，大多数（73.1%）在符合资格的CDI复发中接受了万古霉素治疗。患者人口统计学和基线特征的详细描述可在Feuerstadt等人和Cohen等人的临床结果报告中获得。1b期和2期研究中的患者人口统计学相似（扩展数据表1）。158份基线粪便样本和459个治疗后时间点样本可用于宏基因组分析（扩展数据图1a）。基线定义为符合资格的CDI发作的抗生素治疗后但在研究治疗前。由于安慰剂组中研究期间CDI复发率显著较高（即8周终点时分别为12%和40%），VOS治疗患者比安慰剂患者有更多可用于宏基因组分析的治疗后样本（扩展数据图1a）。由于样本缺失、方案偏离或测序读取深度低，某些患者样本不可用。排除了暴露于治疗后抗生素的样本，以防止额外抗生素治疗的混淆，这导致新出现剂量物种减少，并且在安慰剂组中更常发生（扩展数据图1b,c）。此外，还获得了1b期试验中28名患者（66.7%女性，平均年龄61.9岁）和2期试验中79名患者（67.4%女性，平均年龄64.5岁）在3期试验共享时间点收集的273份样本的宏基因组数据（补充表1）。
三期临床试验中不同剂量方案下VOS治疗的药代动力学
如前所述，1期和2期研究中的剂量被归类为"高剂量"和"低剂量"方案。两个试验中观察到的临床结果和不同程度的定植导致结论认为2期试验中使用的剂量方案与1b期研究剂量递增组中使用的较高剂量方案相比是次优的（图1a）。基于这些数据，我们假设在3期试验中3天内给予更高剂量的VOS将导致改善的定植，从而显著减少CDI复发。每位患者的定植定义为新出现的VOS剂量物种：治疗后观察到但不在患者基线样本中的剂量物种数量。值得注意的是，3期试验中观察到的定植与1期研究中的高剂量组相似（图1b和扩展数据表2）。3期试验中的定植也高于2期研究中接受固定低剂量方案的患者在所有共享时间点的定植（扩展数据表2；双侧Mann-Whitney U检验，P<0.01）。此外，3期研究中的定植快速且持久，如VOS组患者在接受治疗后立即到24周维持的比安慰剂组显著更多的新出现剂量物种所证明（图1b；Mann-Whitney U检验，P<0.001）。在安慰剂患者中，由于剂量物种是在健康人群中发现的共生体，因此在抗生素停用后预期会出现一些新出现的剂量物种。然而，安慰剂组中新出现的剂量物种数量在给药后立即到24周显著低于VOS组，并在整个研究过程中缓慢增加，反映了在没有VOS的情况下孢子形成厚壁菌门的逐渐恢复。对于本文的其余部分，我们重点分析3期试验中VOS的药代动力学和药效学，以更好地理解VOS在rCDI患者中疗效的机制基础。
VOS定植在按年龄和抗生素分层的亚组中相似
我们将3期试验患者中的剂量物种丰富度（剂量物种数量）与健康个体进行了比较。VOS患者在第1周至第24周的剂量物种丰富度分布与健康队列重叠，并且在统计学上没有差异（扩展数据图2a；Mann-Whitney U检验，P=0.2）。相比之下，在安慰剂组中，它显著较低，并且在第24周之前与健康队列基本不重叠（扩展数据图2a；Mann-Whitney U检验，P<0.001）。
在VOS 3期试验中，患者根据年龄和接受的抗生素进行分层，以治疗他们在VOS或安慰剂治疗前的rCDI发作。基线时的剂量物种丰富度和物种丰富度（细菌物种总数）都很低，在65岁以下和65岁及以上的患者之间，基线时这两个指标在各治疗组之间均无显著差异（图2a和补充图1）。给药后，在两个年龄亚组中，VOS组中新出现的剂量物种显著多于安慰剂组，这种显著差异在24周内保持持久（图2b和扩展数据图3）。
丰富度测量在基线时也低于治疗后样本，无论是在接受万古霉素还是非达霉素治疗的患者中（图2c,d），尽管在基线时，非达霉素与万古霉素相比显示出略高的剂量丰富度和物种丰富度（Mann-Whitney U检验，万古霉素与非达霉素的汇总组P值分别为：0.001和0.07）。无论使用哪种抗生素，剂量物种丰富度在VOS治疗后都从基线显著且快速增加，导致VOS组的定植显著高于安慰剂组；这种显著差异在24周内保持持久（图2c,e）。
使用基于菌株的方法确认VOS定植
为了评估基于物种的VOS定植评估的特异性，我们使用StrainPhlAn将每位患者中新出现的剂量物种分类为剂量菌株或非剂量菌株。约一半的新出现剂量物种无法分配菌株（扩展数据图4）。尽管敏感性降低，但基于菌株的方法显示VOS组中剂量菌株数量显著多于安慰剂组（扩展数据图4；Mann-Whitney U检验，P<0.001）。此外，基于菌株和基于物种的定植测量相关，与安慰剂组相比，VOS组中的关系更强（扩展数据图4c；第1周的R2值：VOS：0.64，安慰剂：0.13）。
VOS治疗与更接近健康个体的广泛组成变化相关
接下来，我们评估了随时间推移细菌群落之间的组成距离，以健康队列作为参考。我们发现基线样本在非度量多维尺度（NMDS）投影中远离健康队列样本聚集（图3），并按标准护理抗生素聚集（补充图3）。VOS治疗后，患者样本迅速从基线簇向健康队列转变（图3；第1周），此后保持稳定（图3；第2、8和24周）。相比之下，接受安慰剂的患者样本逐渐从基线转变，许多在第24周后仍位于健康队列簇之外。在NMDS轴3上观察到最小分离（补充图2）。显示Bray-Curtis距离的箱线图证实了这些趋势，如补充图4-6所示。比较每个时间点内治疗组的位置和簇大小的PERMANOVA和分散测试存在显著差异（图3；P<0.001）。
为了评估这些广泛转变背后的分类学变化，我们首先评估了主导胃肠道相关门的丰度变化。与药物产品物种的定植一致，我们观察到VOS患者治疗后厚壁菌门（剂量和非剂量物种总和）的相对丰度跃升（图4a）以及VOS患者中剂量物种总和相对丰度的增加（扩展数据图2b）。VOS组治疗后剂量物种丰度最初高于健康队列中观察到的丰度（Mann-Whitney U检验，P<0.001），但随时间下降，到第8周达到与健康队列相似的值（扩展数据图2b；Mann-Whitney U检验，P=0.27）。在VOS患者中，从基线到第1周，变形菌门的相对丰度出现相反的快速下降（图4b）。在安慰剂组中也观察到类似的动态，尽管厚壁菌门和变形菌门的变化更为渐进，厚壁菌门直到第24周才接近VOS组的丰度（图4a,b；VOS与安慰剂，Mann-Whitney U检验，第8周前P<0.05）。在两组中，拟杆菌门的相对丰度在24周内逐渐增加（图4c；VOS与安慰剂，Mann-Whitney U检验，第1、2和24周P>0.05）。
当比较VOS和安慰剂在更精细的分类分辨率下的组成差异时，仅发现厚壁菌门属在VOS患者中更普遍（图5）。相反，革兰氏阴性肠杆菌科（例如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）在安慰剂治疗的患者中更普遍（图5和补充图7）。此外，我们观察到安慰剂组中与致病或疾病相关的物种流行率或丰度更高（例如具核梭杆菌、肠球菌属和克雷伯菌属）。与VOS的临床成功一致，我们观察到VOS组中艰难梭菌显著少于安慰剂组（图5和补充图7）。
VOS治疗导致与艰难梭菌生命周期相关的代谢物变化
靶向代谢组学显示，两个治疗组在基线时初级胆汁酸升高而次级胆汁酸降低，正如在此疾病状态中先前观察到的那样（图6a）。给药后，VOS组中胆汁酸浓度的转变比安慰剂组更快。具体而言，初级胆汁酸胆酸和鹅去氧胆酸（CDCA）在基线时最高，并在给药后第2周内保持高于VOS组的安慰剂组（图6a；Mann-Whitney U检验，P≤0.001）。同时，次级胆汁酸脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）在基线时较低，并在VOS组中快速增加，导致第8周内浓度高于安慰剂（Mann-Whitney U检验，P≤0.02）。相比之下，熊去氧胆酸（UDCA）浓度在VOS组中低于安慰剂组（Mann-Whitney U检验，P<0.01）。
我们通过评估使用全局代谢组学检测到的更广泛的胆汁酸集的变化来扩展此分析。与靶向测定一致，胆酸和CDCA在VOS治疗后均显著减少。此外，初级胆汁酸甘氨胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸3-硫酸盐、胆酸硫酸盐和鹅去氧胆酸硫酸盐（2）在VOS治疗患者给药后显著减少，而多样化的次级胆汁酸集在VOS和安慰剂组中均得到富集（扩展数据图5和补充表2）。
靶向脂肪酸代谢组学测定显示，尽管乙酸盐和丙酸盐浓度在各组之间相似，但较长的碳骨架短链和中链脂肪酸丁酸盐、缬草酸盐和己酸盐在VOS组中快速增加，导致第8周内浓度高于安慰剂（图6b；Mann-Whitney U检验，P<0.05）。支链脂肪酸异丁酸盐、异缬草酸盐和2-甲基丁酸盐从基线增加，但在各组之间无显著差异。
尽管胆汁酸对艰难梭菌萌发和生长的影响在文献中已有充分记载，但不同短链脂肪酸和中链脂肪酸对艰难梭菌生长影响的证据更为有限。为了更好地了解这些代谢物对艰难梭菌生长的影响，我们在体外评估了不同浓度的丁酸盐、异缬草酸盐、缬草酸盐和己酸盐的影响。所有测试的脂肪酸都能减缓或抑制体外艰难梭菌生长（扩展数据图6）。尽管抑制受培养基类型中生长底物的影响，但抑制随脂肪酸浓度、培养基酸度和脂肪酸碳骨架长度的增加而增加。抑制的整体模式在测试的三种艰难梭菌核型中保持一致。
粪便来源的孢子组分在体外产生抑制艰难梭菌生长的代谢物
为了进一步评估VOS给药后观察到的代谢物变化，我们检测了3期试验中使用的四位供体的培养剂量材料中DCA、LCA、丁酸盐、缬草酸盐和己酸盐的产生情况。供体A贡献了两个剂量批次，均进行了检测。由于体外培养条件不能反映胃肠道的复杂环境（例如单一培养基、小体积和无宿主相互作用），我们将分析限制为二元结果——产生与非产生代谢物，定义为在至少三个重复培养物之一中培养上清液中检测到的代谢物高于未接种培养基对照和高于测定校准曲线的下限。所有五个批次都显示出预期的胆汁酸和脂肪酸代谢活性（扩展数据图7）。按接收的VOS批次解析3期患者代谢物显示，与安慰剂组相比，每个代谢物的中位浓度在VOS批次中一致更高，尽管批次之间的低且不平衡数量限制了统计测试的效力（扩展数据图8）。
讨论
VOS通过从供体材料中纯化厚壁菌门孢子制造，非孢子粪便物质减少超过200倍，仅由全谱FMT产品中发现的微生物分类群的一小部分组成，使其成为一种独特的产品。据我们所知，VOS是迄今为止唯一在3期随机对照试验中满足其主要疗效终点的活体口服微生物组治疗药物：与安慰剂相比显著减少rCDI。rCDI中微生物组治疗和FMT的疗效估计从44%到91%不等，具体取决于特定治疗剂、给药途径、试验设计和使用的诊断测试。VOS在预防复发方面的疗效达到88%，而安慰剂为60%，需要治疗的人数为四人。在这项关于VOS对胃肠道微生物组影响的分析中，我们证明了通过评估药物药代动力学和药效学来指导微生物组治疗临床开发的重要性。
药物物种的定植是驱动预防rCDI所需药效学变化的关键步骤。VOS临床开发计划的分析证实了我们先前的假设：在2期研究中，VOS剂量不足以驱动足够的定植和随后的rCDI预防。3期试验中剂量的优化导致定植物种显著增加，从而显著降低CDI复发风险。
接受标准护理抗生素后接受VOS治疗的患者的剂量物种定植快速，并在24周随访期间保持升高。相比之下，在接受标准护理抗生素后接受安慰剂的患者中，共生孢子形成细菌的恢复延迟，并且从未达到与VOS相同的水平。安慰剂中孢子形成厚壁菌门的这种逐渐增加与微生物多样性在抗生素停用后反弹的预期一致。安慰剂对照组对于区分VOS剂量在抗生素释放后对厚壁菌门物种增加的程度至关重要。恢复的速度对临床结果至关重要，正如在3期试验安慰剂组中观察到的那样，抗生素停用后4周内迅速发生CDI复发。总体而言，VOS临床开发的这些数据表明，VOS定植和微生物组变化的速度和程度可能对终止CDI复发周期至关重要。
我们进一步使用基于菌株的分析工具StrainPhlAn评估了定植，这加强了基于物种的定植结论。基于菌株的分析比基于物种的方法具有更高的特异性；然而，基于菌株的方法由于灵敏度较低而受到影响，因为区分菌株需要在剂量和患者样本中对生物体进行更高深度的测序。患者样本和VOS包含丰度不同的孢子形成厚壁菌门，导致大量无法进行菌株分配的物种。鉴于我们发现两种方法之间的一致性，并且2期分析和随后的3期设计基于物种，我们专注于更高灵敏度的基于物种的方法，安慰剂组提供了无干预情况下恢复的物种数量的基准。安慰剂组在抗生素停用后观察到的剂量物种和菌株的适度和渐进增加强化了在评估微生物组治疗时安慰剂组的重要性。
我们在先前的临床试验中表明，抗生素对微生物组的调节对基于孢子的产品的定植很重要。2期试验的数据表明残留抗生素可能抑制了早期定植，而FMT荟萃分析发现抗生素和灌肠预处理是定植的最强预测因素之一。VOS定植可能得益于抗生素完成和VOS治疗开始之间服用的泻药。理由是泻药迅速减少胃肠道中残留抗生素的水平，使VOS治疗可以在抗生素后2-4天进行而不会受到抗生素干扰，从而允许VOS物种在反弹的本地物种显著竞争之前定植。请注意，安慰剂患者在给药前也服用泻药。
与安慰剂相比，VOS对按年龄（<65岁或≥65岁）和抗生素分层的患者表现出更高的临床疗效。与这些结果一致，我们在所有亚组中观察到新出现剂量物种的快速增加。年龄是CDI复发的公认风险因素，可能与老年人群中微生物组的衰老有关；然而，在这项研究中，未观察到基于年龄的定植差异。同样，假设非达霉素治疗与万古霉素相比对微生物组的破坏较小，并减少毒素再表达和CDI复发。然而，研究患者在厚壁菌门丰富度方面的基线差异很小，与VOS给药后相比安慰剂的剂量物种增加相比相形见绌。非达霉素相对于万古霉素的任何理论优势并未得到安慰剂患者在任一抗生素后观察到的高复发率的支持。总体而言，这些数据表明，厚壁菌门孢子产品的治疗在预防rCDI方面是有效的，与年龄和抗生素无关。
为了评估VOS的药效学影响，我们首先评估了给药对整个微生物组群落的影响。胃肠道中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在健康人群中差异很大，而变形菌门始终代表一小部分，范围从不到1%到约2%。然而，在rCDI的抗生素治疗后，胃肠道微生物组的特征是革兰氏阴性变形菌门的富集和厚壁菌门及拟杆菌门的耗竭。VOS给药后观察到的孢子形成厚壁菌门丰富度和丰度的快速增加伴随着变形菌门的相反损失。与安慰剂组相比，这些变化导致微生物组特征在VOS给药开始后1周内更类似于健康个体。抗生素完成后，两组中拟杆菌门的相对丰度逐渐增加，这强化了仅使用孢子形成厚壁菌门就足以降低CDI复发风险的观点。
通过测量初级到次级胆汁酸转化的底物和产物，进一步评估了VOS的药效学。这些代谢物在抑制艰难梭菌生长中起重要作用，由有限数量的厚壁菌门组执行，包括瘤胃球菌科、毛螺菌科和消化球菌科，其中包括VOS的成员，因此提供了药效学的针对性测量。相比之下，初级胆汁酸去结合，由胆盐水解酶（BSH）酶执行的胆汁酸转化中由微生物驱动的第一步，在全球范围内分布，包括拟杆菌门和某些变形菌门，因此不期望成为药效学和孢子形成厚壁菌门产品的精确测量。与此一致，我们观察到两组中牛磺胆酸的减少相似，表明尽管减少这种强效艰难梭菌萌发剂的BSH活性可能是必要的，但不足以解释VOS的疗效。值得注意的是，甘氨胆酸在VOS接受者中显著减少，与这两种胆汁酸去结合动力学的潜在差异一致。
在2期研究中，更强的定植与临床结果相关，并且与次级胆汁酸LCA和DCA的丰度高度相关。在2期和3期研究中，VOS治疗与LCA和DCA浓度显著增加以及初级胆汁酸胆酸和CDCA（艰难梭菌孢子的萌发剂）的相反下降相关。VOS患者的UDCA浓度低于安慰剂患者，这与去结合初级胆汁酸被引导通过7α-脱羟基化而不是UDCA途径一致。VE303是一种目前正在3期试验中评估用于rCDI预防的微生物组治疗，通过UDCA途径引导胆汁酸。VE303 3期试验的结果将揭示这种替代策略是否也能导致有效的rCDI治疗。
先前的研究将脂肪酸与抑制艰难梭菌联系起来，但报告的效果因研究而异，精确贡献受到pH值、脂肪酸浓度、生长培养基和艰难梭菌菌株变异性的混杂影响。在本研究中，我们系统地评估了体外丁酸盐、异缬草酸盐、缬草酸盐和己酸盐浓度增加的影响，缓冲培养基在典型的近端、中段和远端结肠pH值下。由于细菌对环境压力源的敏感性取决于不同的代谢途径，我们评估了两种生长底物，一种糖醇和一种氨基酸混合物，两者都在体内被艰难梭菌使用，并通过不同的途径代谢。所有测试的脂肪酸都能抑制艰难梭菌生长，随着碳骨架长度的增加，效力增强。值得注意的是，在3期临床研究中，己酸盐以及缬草酸盐和丁酸盐浓度在基线时较低，并在VOS治疗后显著增加。综合起来，这些结果支持脂肪酸对抑制艰难梭菌的贡献。脂肪酸还被证明可以抑制结肠炎症并支持上皮屏障完整性，这可能有助于在CDI后恢复胃肠道稳态。
与可能针对单一代谢物或酶的传统药物相比，VOS引入了能够执行多种功能的活细菌，从而持久影响多种生理过程。体外培养中剂量材料生成次级胆汁酸和短链脂肪酸提供了强有力的证据，表明VOS细菌直接调节这两类不同的代谢物。结合3期临床结果，这些药效学发现支持胆汁酸和短链脂肪酸在预防CDI复发中的作用。
这些事后微生物组分析对支持作用机制理解的最大优势是，它们来自一项针对毒素证实疾病的双盲、安慰剂对照试验。此外，据我们所知，VOS是唯一一种在rCDI微生物组治疗或rCDI研究性微生物组治疗中证明与安慰剂相比代谢物浓度发生统计学显著变化的产品。其他最近发表的关于rCDI微生物组治疗或rCDI研究性微生物组治疗的研究未包括安慰剂数据，将数据按研究中的临床结果而不是按治疗组划分，或未报告组间统计学显著差异。
本研究的局限性包括VOS组中CDI复发数量有限，无法检查定植或代谢物与临床结果之间的关联。此外，宏基因组测序提供相对丰度测量，因此尚不清楚胃肠道中分类群的绝对丰度是增加还是减少。然而，这是该领域使用的DNA测序方法的固有限制，并非本研究所独有。另一个局限性是VOS 3期研究中使用的供体批次数量较少。
VOS在针对毒素证实疾病的3期安慰剂对照试验中显著降低了rCDI的风险。尽管VOS的作用机制尚未完全阐明，但这些全面的组成和功能评估支持靶向活微生物组治疗（在本例中为VOS）的多方面药理影响，以补充厚壁菌门丰富度和丰度，并驱动随后的细菌衍生代谢物变化，这些变化可能协同作用以阻止CDI复发周期。这些数据支持VOS在抗生素治疗后恢复预防CDI复发所需的微生物相关代谢功能的潜在作用。
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