当药物能以适当的选择性和效力与其靶标结合时，就会产生治疗意义。尽管早期药物发现中使用的许多检测技术都能证明药物正在作用于目标靶标，但这些证据往往是间接的，作用位点和化学计量比未知...
即使像表面等离子共振（SPR）和等温滴定热法（ITC）这样尖锐的技术，也无法提供化合物以预期方式与靶标相互作用的绝对证据。本文将解释如何通过晶体学填补这一空白。
蛋白质与化合物的原子结构不仅确认了靶标结合，还提供了结合位点位置及药物官能团与蛋白质中重要氨基酸之间相互作用的精确信息。这些结果可用于阐明有效抑制的机制，并在药物发现工作流程中提高化合物的效力和特异性。基于结构的药物发现（SBDD）已成为药物化学项目的重要元素，但直到最近仍受限于其低通量性和仅适用于可溶性靶标。
当第一个X射线晶体结构在1950-60年代被解析时，这些结果立即与生理学和药物发现相关联。Max Perutz和John Kendrew通过解析血红蛋白结构理解镰状细胞贫血病，Dorothy Hodgkin解析胰岛素结构后，开始考虑合成胰岛素的治疗设计。但直到1990年代，第一个蛋白-配体复合晶体结构才被提交到蛋白质数据库（PDB）。复合结构数量逐年增加，自千禧年以来，蛋白质晶体学已成为药物发现的标准技术。
获得用于结构测定的蛋白质晶体
进行结晶实验需满足多个条件：需获得数毫克/毫升浓度的稳定、单分散蛋白质溶液。找到生长良好衍射晶体的条件需要大量试错，因此采用筛选方法。为加快流程并减少蛋白质用量，采用96孔板格式的蒸汽扩散法机器人筛选。100-200nL蛋白液滴与等体积沉淀剂混合后，在蒸汽平衡中与含沉淀剂的储液槽共同培养。
当蛋白质分子在过程中组装成周期性晶格时，晶体开始生长。这些含高溶剂含量的晶体尺寸可达10-数百微米但易碎。尽管自动化加速了流程并扩大了结晶条件筛选范围，但生长良好衍射晶体仍是晶体学的主要瓶颈。
蛋白质-配体复合晶体可通过共结晶（在结晶时加入配体）或浸泡（将配体渗入预培养晶体）获得。数据收集前，需在显微镜下手动从结晶液滴中收获晶体，经冷冻保护后浸入液氮。数据收集通常在低温下进行以减少辐射损伤，可选用实验室X射线源（如汉堡DESY）或同步辐射设施（如格勒诺布尔ESRF）。
晶体学在药物发现中的应用
当发现可药靶向蛋白质后，需通过化合物库筛选获得初始命中化合物。分子基于生物检测效力选择，也通过配体核磁、SPR、荧光热移检测和质谱等技术识别靶标-配体复合物。共通活性化合物经迭代优化，改善亲和力、选择性及ADME-Tox等性质。
优化化合物常与靶标共结晶以揭示作用机制。典型案例如甲型流感病毒神经氨酸酶过渡态类似物抑制剂、针对墨西哥利什曼原虫的甘油醛-3-磷酸脱氢酶腺苷抑制剂，以及基于HIV-1蛋白酶结构设计的抑制剂。1995年，罗氏开发的沙奎那韦（Saquinavir）进入临床，显著改善艾滋病患者预期寿命。该药物基于HIV-1蛋白酶切割Tyr-Pro/Phe-Pro序列的特性，通过晶体结构分析将脯氨酸替换为DIQ基团，使抑制常数达到亚纳摩尔级。
片段筛选药物发现（FBDD）
近年晶体学在以下方面取得突破：自动化设备、探测器和软件的发展使数据收集时间从数小时缩短至5分钟内。机器人可自动成像结晶液滴，开发中的浸泡/收获机器人对膜蛋白晶体特别重要。高速数据收集推动高通量晶体学在早期筛选阶段的应用。
片段筛选（FBDD）是成功范例，使用500-4000个低分子量化合物（250-350Da）库，通过将6-10个片段的混合物渗入未结合蛋白质晶体进行筛选。解析晶体结构可同时确定片段命中和结合位点。2011年获批的首个片段药物维莫非尼（Vemurafenib）靶向BRAF突变激酶，从238个初筛化合物中通过100余次共结晶优化获得。其他成功案例如靶向BCL-2的维奈托克（Venetoclax）和靶向Cdk4的瑞博西尼（Ribociclib）。
新药物靶标：膜蛋白
膜蛋白控制细胞营养运输和信号传导，是重要但难于研究的药物靶标。结晶需经去垢剂溶解破坏晶体接触。近年通过脂立方相（LCP）培养法和纳米抗体稳定技术使膜蛋白晶体学取得突破。2012年诺奖得主Kobilka团队通过LCP培养成功解析β2-肾上腺素受体-Gs复合物晶体结构，纳米抗体通过增大亲水表面促进晶体接触。
展望
膜蛋白晶体学将推动更特异性药物开发，Heptares Therapeutics等企业已开展GPCR结构药物设计。此外，金黄色葡萄球菌核糖体原子结构揭示了特异性结合位点，为设计靶向抗生素提供可能。冷冻电镜的"分辨率革命"（如3.6Å的核糖体结构）将与晶体学互补，推动药物发现进程。
作者简介
Sophie Zimmermann：欧洲分子生物学实验室汉堡分部研究员，开发膜蛋白及大型复合物晶体学方法
Sheraz Gul：弗劳恩霍夫研究所药物发现负责人，拥有23年学术与产业经验
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