根据研发阶段设定CAR-T疗法规格标准
监管机构日益强调将规格标准整合到产品的整体控制策略中，而非孤立地评估规格标准。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法为癌症治疗提供了一种个性化方法(1)。然而，由于基于细胞的产品和基因修饰固有的复杂生物学特性，此类疗法需要对基因编辑组件（通常是慢病毒载体(LVVs)或逆转录病毒载体(RVVs)）及其给予患者的修饰人类细胞进行广泛的测试(2)。选择适当的分析测试面板和产品规格标准并非千篇一律的过程。相反，该方法必须针对特定产品进行定制。在开发的早期阶段，制造工艺和分析方法仍在完善中，规格标准通常较为宽泛，侧重于确保产品安全性。随着疗法进入后期临床阶段并迈向商业化，策略必须进行调整，以确保制造一致性以及最终产品的安全性和有效性(3)。产品知识和监管期望的演变塑造了产品生命周期中的质量控制(QC)流程。
CAR-T生物学基础
理解CAR-T功能的生物学机制对确保产品安全性和有效性以及开发相关效力检测方法至关重要。CAR-T疗法涉及对人类T淋巴细胞进行基因修饰，使其表达合成受体，从而能够特异性识别抗原并细胞毒杀肿瘤细胞(4)。CAR-T细胞可来源于自体（来自患者）或异体（来自健康供体）产品。这两种方法在制造和监管方面均面临独特挑战。尽管最终产品放行检测对自体和异体CAR-T产品通常标准化，但供体资格标准存在显著差异。来自健康供体的细胞需要进行广泛的外源因子和传染性疾病筛查，以确保患者安全(5)。
在收集和初步鉴定后，T细胞经过体外激活、扩增和基因修饰以表达CARs。在目前获批的CAR-T疗法中，基因转移通过稳定基因表达实现。非病毒递送平台（如Sleeping Beauty转座子系统）正被研究作为安全、具有成本效益的替代方案(6)。CAR结构包含胞外抗原结合域（通常源自单链可变片段scFv）、跨膜域和胞内信号域，后者在抗原结合后驱动T细胞激活和细胞毒性(7)。随着CAR-T疗法从实验室走向临床，成功取决于设定灵活且科学合理的规格标准，这些标准既能促进制造可扩展性，又能满足监管要求。
CAR-T产品放行规格标准的建立
由于原料、病毒载体组件和制造过程中引入的工艺波动导致的固有产品变异性，为CAR-T产品定义放行测试规格标准颇具挑战。监管机构要求提供充分论证且有意义的规格标准，并为关键临床试验的启动设定数值接受标准(8)。理想的规格标准能够在适应生物产品固有变异性的同时，维持严格的安全性和有效性标准。本文重点讨论使用病毒载体进行基因修饰的CAR-T产品的放行测试。尽管病毒载体本身的放行测试是整体控制策略的关键组成部分，但它超出了本文讨论范围，值得单独撰写专文。
为CAR-T产品设定适当规格标准涉及为以下几项关键质量属性(CQAs)定义接受标准：
• 基本特性 — 评估外观、颜色和pH值等基本物理参数，有助于确保产品一致性并检测明显异常
• 鉴别 — 验证细胞身份和CAR表达，通常使用流式细胞术检测表面标志物或基于聚合酶链反应(PCR)的方法
• 纯度 — 评估产品细胞组成，包括靶向T细胞亚群比例及工艺相关和产品相关杂质的存在；此类评估通常通过流式细胞术、定量PCR(qPCR)、酶联免疫吸附试验(ELISAs)或液相色谱(LC)进行
• 效力 — 确定CAR-T细胞的生物活性，以确保治疗功能；效力检测通常涉及基于细胞的方法，通过流式细胞术、ELISA、发光测定或分光光度法测量细胞因子分泌、靶细胞杀伤或增殖
• 安全性 — 确认产品不含细菌内毒素、支原体和具有复制能力的病毒等有害污染物；病毒载体组件（如质粒DNA、宿主细胞蛋白）的残留水平必须量化并控制在可接受限值内
为每个类别开发规格标准需要战略性、基于科学和风险的方法，始于对适用监管指南、制造工艺和产品固有生物学变异性的深入理解(5)。这些因素共同指导适当接受标准的设计，以确保整个开发过程中产品质量的一致性。
设定阶段适用的规格标准
建立规格标准需要关键职能团队（包括技术专家、统计学家、监管人员和临床事务专业人员）的协作，以确保接受标准科学合理、临床相关且符合监管标准。建立科学严谨且符合监管要求的规格标准需要综合考虑以下因素：
• 对检测方法性能特征（准确性、精密度、线性和稳健性）的深入理解
• 对历史批次数据和制造工艺能力的评估
• 适用的监管指南和行业基准
• 临床数据、安全/有效性结果及其与化学、制造和控制(CMC)数据的相关性考量
• 起始材料和最终CAR-T产品固有的生物学变异性
该策略必须根据疗法的开发阶段进行调整，规格标准随着产品开发生命周期的推进而演变，以反映对制造一致性、临床可预测性和监管审查日益增长的需求(8)。
分析检测方法性能评估
规格标准设定的基本方面是检测方法的工作范围，由方法的定量下限(LLoQ)和定量上限(ULoQ)定义，并以其分析变异性为特征。分析变异性指检测精密度，通常通过方法内（重复性）和方法间（重现性）变异性研究进行评估(9)。建立LLoQ尤为关键，因为它定义了可使用可接受准确度和精密度量化的最低分析物浓度。在经过验证的工作范围内设定接受标准可确保检测可靠地生成定量结果。
例如，如果细胞纯度检测的验证工作范围为0-70%（70%为ULoQ），则接受标准不能超过70%。任何高于ULoQ的值都将超出合格工作范围，无法报告为精确数值。在此类示例中，接受标准只能设定为≤70%以确保符合检测限制。应优化分析方法，确保在常规样品中通常观察到的范围内可靠运行，从而允许准确报告数值并进行统计分析。
如果历史数据高于ULoQ，则统计评估将变得困难甚至不可能进行。尽管在开发早期定义分析目标概况(ATP)有助于指导方法设计以匹配产品特性，但CAR-T和其他细胞和基因治疗(CGT)产品可能需要对分析方法进行迭代优化，以确保在预期产品变异性范围内进行准确量化。
批次数据与工艺趋势分析
规格标准设定的关键方面是利用历史批次数据和制造经验建立科学合理且有意义的接受标准。申办方必须深入理解工艺性能和一致性，以确保规格标准反映实际制造能力并支持预期产品质量。
为罕见疾病产品定义规格标准带来了重大挑战，这是由于此类开发项目的固有限制。小型临床试验样本量、有限的生产批次数量和加速时间表都增加了规格标准设定的难度。这些因素导致统计能力低、工艺理解不足以及建立稳健控制策略的能力有限，而高工艺变异性可能使情况进一步复杂化。
监管指南与行业基准
为CAR-T产品设定放行规格标准必须从全面理解适用监管指南开始，同时借鉴行业实践。美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)和国际人用药品注册技术协调会(ICH)等监管机构提供高层次指南，概述生物制品和基因修饰细胞疗法的一般期望(8,10-12)。此类指南包括定义关键质量属性(CQAs)、设定有意义的数值接受标准以及确保批间一致性的要求。监管机构认识到基于细胞疗法的独特变异性，支持规格标准设定的生命周期方法，在早期开发中鼓励基于风险的宽泛限值，并随着产品和工艺理解的成熟逐步收紧。
行业基准（如FDA批准基础摘要(SBRA)文件中公开披露的规格标准）为定义效力、鉴别、纯度和载体拷贝数的范围提供了有用的参考点(13,14)。然而，对基准的依赖必须与产品特定证据相平衡，因为不同开发者的细胞来源、CAR结构和制造平台各不相同。
在缺乏完善的行业标准或特定监管指南的情况下，申办方必须采用基于风险和科学驱动的方法来设定规格标准。这种方法需要整合所有可用数据源，包括有限的临床和非临床数据集、作用机制(MoA)理解和平台知识。申办方必须建立科学合理的论证，平衡产品质量、制造可行性和患者安全。当实证证据有限时，可从建模和模拟、类似结构或制造平台的可比性数据以及相关行业基准中获取额外支持。监管机构接受早期阶段规格标准可能较为宽泛，前提是论证透明、数据驱动，并随着获得更多制造经验而持续完善。最终，该策略能够在不确定性中实现理性决策，同时符合全球监管框架中概述的持续改进期望。
临床数据与CMC属性的相关性
规格标准设定中日益关键的要素是将临床结果与CMC数据整合。在CAR-T背景下，放行属性（如细胞活力、转导效率、载体拷贝数和体外效力）可能影响治疗效果和安全性。监管机构强调在关键试验和生物制品许可申请(BLAs)或上市许可申请(MAAs)提交期间，将临床表现与放行规格标准相关联的重要性。这项任务涉及识别与药效学标志物（如细胞因子谱和扩增动力学）、临床终点（如完全缓解率和缓解持续时间）或不良事件（如细胞因子释放综合征CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征ICANS）可能相关的CQAs。例如，体内CAR-T扩增峰值高与CRS相关，这凸显了监测和设定扩增动力学规格标准的必要性(15)。
如果转导效率低或效力低于阈值的产品未能达到临床试验中证明安全有效的批次性能，则可能被排除在商业放行之外。鼓励申办方对临床试验批次进行回顾性分析，以定义涵盖与临床成功相关的属性范围的规格限值，同时排除与次优结果相关的范围(16)。这种基于证据的方法加强了规格标准的科学论证，并增强了监管机构对产品质量和一致性的信心。
供体和患者异质性对产品质量的影响
在传统生物制品开发中，接受标准通常通过分析制造工艺变异性和分析方法变异性来定义。对于CAR-T等细胞疗法，供体被视为变异性的主要来源。在自体疗法中，每位患者都是自己的供体，因此起始材料的生物学变异性直接影响最终产品的质量属性(17)。这种患者来源的变异性可能相当大，估计在某些关键质量属性中可能占总观察变异性的50%。
因此，需要采用细致的、基于风险的方法来设定细胞和基因治疗产品的规格标准。下文将探讨如何系统地将这些重要考量纳入阶段适用的规格标准策略中。
建立稳健且阶段适用的规格标准
设定规格标准的传统数据驱动方法（如计算容忍区间和从批次数据推导统计分布）依赖于足够大且具有代表性的数据集。然而，在早期临床试验中，特别是在罕见疾病背景下，患者来源的批次数量本质上是有限的。这一限制使得难以应用传统统计方法或有信心地定义精确的接受标准(18)。
监管机构认识到这些担忧，并在规格标准设定方面提供阶段适用的灵活性。对于首次人体(FiH)试验，宽泛的接受范围通常适用于低风险属性，而对关键CQAs则保持严格控制(8)。尽管来自健康供体的材料可用于早期方法开发和初始规格标准设定，但它们通常无法捕捉患者来源起始材料的全部变异性，这限制了其对后期和商业规格标准的相关性。申办方可依靠可用批次中观察到的最小值和最大值来定义临时接受标准。某些属性可能仍被指定为"仅报告"，特别是用于探索性或低风险参数，如辅助细胞亚群和探索性效力测量。然而，对于被认为对产品安全性和有效性至关重要的属性——如活力、转导效率和效力——即使在早期开发中也需设定数值接受标准。一旦产品进入关键试验，所有CQAs都需要定量接受限值。这些限值应使用所有可用数据进行统计论证，通常通过容忍区间、源自临床批次的平均值和标准差分析以及（适当时）相关产品的平台和行业知识等方法。
从临床到商业规格标准设定的转变引入了额外复杂性。例如，3期试验中的患者群体可能因优先处方而与初始商业群体显著不同，需要重新评估制造历史和规格标准相关性。肿瘤学领域通常可获得大型临床数据集，因此申办方可利用这些数据指导规格标准开发。相比之下，不断发展的肿瘤免疫学适应症数据集有限，使得数据外推和平台知识更为关键。
随着开发进展，某些特性检测可能被纳入正式放行测试，而其他检测则基于批次分析数据和临床相关性被弃用。效力检测通常在开发早期进行严格评估，同时评估多个候选检测方法以确定最可靠、稳健和具有临床意义的方法。一旦选定主导效力检测方法，就会对其进行验证以用于常规批次放行。随着时间推移，随着一致的制造性能和累积的批次数据证明稳定性和产品质量，申办方也可能证明可以取消与残留污染物或工艺相关杂质相关的检测。此类取消取决于全面的风险评估和历史数据，这些数据一致显示此类杂质水平较低，足以支持常规检测不再必要以确保产品安全性和质量的结论。
监管机构强调严格的工艺控制和输入材料的充分鉴定，以最大限度减少变异性，从而减少对最终产品检测的依赖(19)。根据FDA指南，申办方被鼓励为单采起始材料建立接受标准，如最低活细胞计数和分化簇3(CD3+)T细胞百分比(19)。
除正式的工艺中检测接受标准外，申办方还应建立警戒限和行动限。警戒限标记潜在偏差或新兴趋势，实现工艺变化的早期检测，而行动限则要求采取特定干预措施以维持产品质量(20)。此类阈值的建立取决于是否有足够的代表性制造历史数据，这些数据通常在项目接近商业化阶段时才可获得。
监管沟通
与卫生当局就拟议规格标准进行早期和反复沟通至关重要。讨论通常在临床前测试申请阶段开始，此时申办方概述规格标准设定方法，包括哪些参数可能被指定为"仅报告"以及哪些检测旨在用于放行而非特性分析。
随着开发进展，关键里程碑如1期结束和2期结束会议提供了宝贵机会，可根据不断发展的临床数据、工艺理解和分析性能重新审视和优化规格标准。在开发后期，BLA/MAA前会议作为关键接触点，用于就拟议的商业规格标准达成一致，包括其统计论证和临床相关性。主动解决这些问题有助于确保监管一致性，并支持开发既科学合理又足够稳健的规格标准。
人工智能在CMC数据集分析中的应用
人工智能(AI)在分析复杂、多维数据集以及揭示CQAs、制造参数和临床结果之间有意义的相关性方面展现出巨大潜力。这些能力可增强申办方对产品变异性的理解，帮助识别预测标志物，并为最优规格标准设定做出贡献。然而，缺乏足够大、多样化且信息质量高的数据集限制了AI在CGT中的应用。要充分发挥该技术的潜力，申办方首先必须实施强大的数据管理系统，全面捕获和整合制造、分析检测和临床领域的数据(21)。系统记录和存储此类数据（包括工艺参数、批次记录、检测结果和患者结果）至关重要。平台技术通过允许在相关产品或适应症间汇集数据（假设细胞类型和工艺相当）提供了一条克服数据集限制的途径。建立严格的数据基础设施和协调数据捕获标准对于实现AI支持的规格标准开发、增强工艺控制策略以及改善产品质量和患者结果至关重要。
自信设定规格标准
监管机构日益强调将规格标准整合到产品的整体控制策略中，而非孤立地评估它们。根据ICH Q6B，用于建立接受标准的数据应来自用于非临床和临床研究的批次、证明制造一致性的批次，以及来自开发和稳定性研究的信息(10)。
最终，规格标准设定涉及整体、科学严谨的方法，整合对工艺理解与变异性的全面认识、分析方法性能、历史数据以及临床和非临床有效性与安全性。统计工具应指导而非决定限值，不存在适用于所有场景的通用方法；相反，方法应根据特定产品、CQAs和可用数据集进行调整。行业和监管机构的共识很明确：CAR-T疗法和其他CGT产品的规格标准设定需要在数据驱动的严谨性、监管灵活性、科学论证和以患者为中心的视角之间取得仔细平衡。最终，CGT规格标准设定的历程反映了将尖端科学转化为有意义的临床结果的广泛挑战。它不仅需要技术精确性和监管一致性，还需要对产品、工艺和患者的深刻承诺。
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阿丽恰·费多罗维奇（Alicja Fiedorowicz）是荷兰史基浦1117 CL地区Stationsplein Noord-Oost 438号奥伦策(Allucent)公司CMC部门副董事。
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