高通量电生理学在药物发现中的作用Role of High-Throughput Electrophysiology in Drug Discovery — Current Protocols — 2019 — 实验方法库_Protocol 库_生物实验指南 — 衍因科技官网

摘要

由于离子通道具有重要的生理功能，它们是多种疾病的关键治疗靶点。然而，对离子通道活性的电生理评估在技术上具有挑战性，并且一直是发现调节通道功能药物的瓶颈。为解决此问题，已开发出自动化膜片钳平台，其通量更高、应用更广。本文概述了高通量电生理学的现状及其在药物发现中的应用。© 2019 作者。

引言

离子通道是控制离子跨质膜和细胞器膜流动的大分子复合物（Hille, 2001）。离子传导通道孔的开放和关闭可受电压、温度、渗透压、机械力和/或化学配体结合所调控。由离子通道活动介导的电信号对从认知、感觉、肌肉收缩、体积调节到细胞信号传导等多样生理功能至关重要。离子通道的遗传性功能障碍可导致多种疾病（即通道病），如癫痫、心律失常和肌强直（Ptacek, 2015; Ryan & Ptacek, 2010）。许多离子通道已被作为关键治疗靶点（Wickenden, Priest, & Erdemli, 2012）。事实上，离子通道是美国食品药品监督管理局批准的药物中仅次于G蛋白偶联受体的第二大靶点类别（Overington, Al-Lazikani, & Hopkins, 2006）。药物对离子通道的意外作用会产生显著毒性风险，可能危及生命。例如，意外阻断hERG钾通道可导致QT间期延长、室性心律失常和心源性猝死。近年来，高通量电生理学应运而生，以满足评估离子通道功能日益增长的需求。本文概述了高通量电生理学的现状、实际考量及应用。

手动膜片钳

离子通道功能的生物物理特性通常通过手动膜片钳进行研究，这是1970年代Neher和Sakmann（1976）开发的一种电生理技术，他们后来因此革命性发明获得诺贝尔奖。典型手动膜片钳实验始于制作尖端细玻璃微电极作为记录电极。将电极尖端置于细胞表面（图1A），当施加轻柔反向吸力时，电极尖端与细胞膜之间形成电阻达数吉欧（GΩ）的紧密封接。这种紧密封接对于降低跨膜生物电流记录的背景噪声至关重要。为获得对细胞内部的电学通路，通过短暂负压或电脉冲击破电极尖端内的小片膜，或通过在记录电极中加入成孔抗生素（如制霉菌素）使膜穿孔。由此形成的“全细胞”结构可精确控制跨膜电压（即电压钳），并根据通透离子的电化学梯度，记录整个质膜对跨膜电压阶跃变化的响应电流。除全细胞电压钳结构外，还可以通过内面向外或外面向外结构记录膜片上的单通道电流。尽管膜片钳被认为是高保真分析离子通道功能的金标准，但它需要大量培训且以劳动密集著称。一位熟练的电生理学家通常每天只能产生15到30个数据点，而典型化合物库含有数百万种化合物，通量极低。

图1. 常规手动膜片钳与自动化电生理学的比较。（A）全细胞结构下手动膜片钳记录示意图（左图）。使用玻璃记录电极记录单个细胞。化合物可施加于细胞外液（蓝色），而人工细胞内液（绿色）包含在电极中。右图：电压脉冲方案和代表性的Nav1.7通道瞬时内向电流。（B）基于平面阵列的自动化电生理学实验示意图。通过包含384个孔的芯片（右上）的单个孔（左上）内的微孔记录单个细胞。细胞外液（蓝色）和细胞内液（绿色）均可通过灌流更换。下图：一次Syncropatch运行的代表性结果。根据封接电阻对孔进行颜色编码。电阻、细胞：绿色 >0.5 GΩ (350/384); 蓝色 100–500 MΩ (30/384); 白色 <100 MΩ (4/384)。每个孔内的电流迹线已自动缩放以最大显示。

自动化电生理学平台

鉴于手动膜片钳的低通量和技术挑战，人们已付出大量努力实现该技术的自动化。自1990年代以来，已发明了多种自动化膜片钳平台（Dunlop, Bowlby, Peri, Vasilyev, & Arias, 2008）。总体而言，这些平台可使用玻璃电极或平面阵列。

基于玻璃电极的自动化膜片钳平台基于与手动膜片钳相同的物理原理，但自动化了电极操作、形成紧密封接、实现全细胞记录结构和化合物施加的过程。不同平台在细胞捕获和GΩ封接形成方面存在重大差异。例如，半自动的Apatchi-1（Asmild et al., 2003）和全自动的Robopatch（Vasilyev, Merrill, Iwanow, Dunlop, & Bowlby, 2006）使用机器人模拟常规膜片钳操作。记录电极随机接触细胞，并在溶液或气液界面中进行膜片钳记录。相比之下，Flyscreen则将细胞悬液冲洗到玻璃电极内部，以实现电极尖端单个细胞的GΩ封接（Lepple-Wienhues, Ferlinz, Seeger, & Schafer, 2003）。这些基于玻璃电极的平台降低了技术难度，同时保持了高质量的离子电流记录。一些平台可并行记录多个细胞。例如，Patchserver系统（德国Multichannel Systems Inc.）能够同时记录多达四个细胞。由于这些系统相比手动膜片钳仅适度提高了通量，因此不足以进行大规模药物筛选。

基于平面阵列的自动化膜片钳平台包括多种市售仪器（Dunlop et al., 2008）。基于平面阵列的平台不是使用玻璃电极记录电流，而是利用包含多个微孔的平面芯片捕获分配到芯片上的细胞（图1B）。通过施加负压将悬浮细胞拉向微孔，以促进电封接的形成。通过进一步施加负压或将膜暴露于穿孔试剂，破坏微孔界定的膜区域，形成全细胞记录结构。由于在同一板/芯片上的多个孔中并行记录，基于平面阵列的自动化膜片钳平台通常可实现更高的通量。IonWorks HT是第一个允许从384孔板格式收集数据的系统（Molecular Devices）（Schroeder, Neagle, Trezise, & Worley, 2003）。后续型号如IonWorks Quattro和Barracuda采用了穿孔膜片钳方法，提高了记录稳定性。尽管所有这些平台都提高了通量，但由于封接电阻不理想（<200 MΩ），其数据质量低于常规膜片钳方法。

其他几种平面阵列自动化膜片钳格式能够形成GΩ封接并相应提高记录质量。这些设备的通量范围从低（Port-a-Patch, Nanion Technologies）到中等（PatchXpress, Molecular Devices; Patchliner, Nanion Technologies; QPatch, Sophion Bioscience）到高（Syncropatch 384/768PE, Nanion Technologies; Qube, Sophion Bioscience），如表1所示（Bell & Dallas, 2018; Li & Chen, 2018）。这些设备实现基于GΩ封接的记录是通过使用精确控制的负压以及在内部溶液中使用氟离子实现的。对于Patchliner和Syncropatch等平台，会添加含有高浓度Ca²⁺（10至40 mM）的“封接增强剂”溶液以促进GΩ封接形成，随后在开始电流记录前洗去。Port-a-Patch、Patchliner、QPatch和Qube采用微流控设计，可实现相对快速的溶液切换（例如<50 ms）。此特性对于快速脱敏的配体门控离子通道（如α7烟碱型乙酰胆碱受体）很重要（Dunlop et al., 2007; Friis, Mathes, Sunesen, Bowlby, & Dunlop, 2009; 参见Current Protocols文章：Obergrussberger et al., 2014）。微流控设计还可精确控制并在单个细胞上测试多种化合物浓度。Syncropatch平台使用辅助仪器（如Biomek, Beckman Coulter Life Sciences）进行液体处理，并使用移液器添加和吸出溶液。

表1. GΩ封接平面自动化膜片钳平台特征a

a 某些平台可能已不再销售；详情请咨询供应商。

b PPC (群体膜片钳) 是对2至36个细胞的集合电流进行记录。

c 由于缺乏流通设计，溶液交换不完全。

除了更高的通量，基于平面阵列的自动化膜片钳平台还提供了手动电生理记录技术难以实现的若干功能。包括：

1. 群体膜片钳记录：在此构型下，单个孔包含多个微孔，可同时记录一群细胞的电流。在某些平台中，每个孔记录的细胞数量可定制（Ionflux为20个细胞；Syncropatch为4或8个细胞；Qube为2、6、10、16和36个细胞）。群体膜片钳显著提高了整个芯片板上的成功率和数据一致性（Dale, Townsend, Hollands, & Trezise, 2007; Finkel et al., 2006）。然而，这种方法可能降低分辨率和记录稳定性。
2. 内部溶液更换：手动膜片钳很难更换内部溶液，因为需要更换记录电极小容积内包含的内部溶液且空间受限。相比之下，基于平面阵列的平台更容易灌流和更换内部溶液。例如，已使用Syncropatch分析了细胞内pH对TREK-1通道的影响（Sauter, Sorensen, Rapedius, Bruggemann, & Novak, 2016）。
3. 稀有样品测试：自动化平台通常只需少量溶液体积（例如50 µl），而手动电生理实验则需要几毫升。此功能便于分析仅有限量可得的样品，如肽类毒素。
4. 温度控制：大多数自动化膜片钳平台提供温度控制选项，这在生理温度下进行化合物筛选以及研究温度敏感型离子通道时非常有用（Papakosta et al., 2011）。

实际考量

实施自动化电生理学平台并非易事。除了初始仪器投资，耗材成本也相当可观，应予以考虑。为成功运行实验，应优化硬件设置、电压方案、溶液方案、膜条件及靶标表达水平。通常需要投入大量精力优化条件和排除故障。此外，自动化膜片钳实验的结果应通过不同平台和常规电生理学进行验证。因此，自动化膜片钳确实需要技术专长和高度培训的人员。鉴于这些考量，许多公司选择依赖合同研究组织满足其电生理学需求。以下章节我们重点介绍自动化膜片钳实验的技术方面。

细胞系与表达系统

由于典型的自动化膜片钳实验需要数千万个细胞，最常用的是稳定表达目标离子通道的细胞系。通常考虑的因素包括宿主细胞背景、辅助亚基的存在、背景电流污染（由组成型表达的离子通道引起）、电流密度和均一性。通常需要多轮克隆选择来开发高质量的稳定细胞系，而自动化电生理学尤其适用于大规模测试。例如，使用Syncropatch（一种384孔格式的自动化膜片钳系统），可以同时测试24个克隆，每个克隆16个细胞。除稳定细胞系外，瞬时转染的细胞也已用于自动化电生理学（Vanoye et al., 2018），尽管有时会出现通道/受体表达水平变化的问题。理论上，杆状病毒表达系统也可能适用于自动化电生理学。

在常规电生理学实验中，细胞会经过肉眼检查，选择“最佳”细胞进行研究。相反，在自动化电生理学实验中，细胞是从大池中随机捕获的，因此使用均一的高质量细胞至关重要。根据我们的经验，使用温和的细胞分离方案、去除细胞碎片、将细胞保持在较低温度以及调整细胞密度是改善细胞整体状态的有效方法（Li et al., 2017）。

质量控制

应在多个层面实施自动化膜片钳实验的质量控制。首先，应优化若干电生理参数，包括初始细胞捕获电阻（>10 MΩ）、封接电阻（>500 MΩ）、电流幅度（>200 pA），并通过监测细胞电容变化（<2倍）和串联电阻变化（<1.7倍）来评估记录稳定性（Li et al., 2017）。此优化在实验开发阶段通过探索硬件设置、真空压力、电压方案、溶液成分和洗涤条件等参数来完成。另一个重要的质量控制问题是电流稳定性。在无化合物调节的情况下，电流上升（幅度增加）或衰减（幅度降低）是常见问题，应予以监测。例如，电压门控钠通道在10分钟记录期间可能发生20%或更多的衰减。虽然衰减的原因可能包括封接恶化、失活累积和通道周转，但此类数据必须在数据分析过程中加以考虑。实验中应包含适当的阳性和阴性对照以及化合物溶剂的效应。若参考化合物的效价与历史值显著偏离，应重新评估结果。

化合物浓度

许多自动化膜片钳平台使用微流控设计以确保快速溶液切换。例如，Ionflux Mercury在加压溶液流之间切换以缩短溶液交换时间。Patchliner、QPatch和Qube允许快速、低容量更换记录室中的溶液。其他基于平面阵列的系统，如Syncropatch 384/768PE和PatchXpress，直接在记录孔中添加和移除化合物。不同溶液施加方法的影响尚未得到系统研究。此外，芯片的材料可能影响有效化合物浓度。例如，已知亲脂性化合物会粘附于微流控表面，并且据报道被记录孔中多余的细胞吸收（Bridgland-Taylor et al., 2006）。化合物更易粘附于聚二甲基硅氧烷制成的芯片（通过亲脂性分配），而不是玻璃涂层的芯片。由于这些及其他原因，从自动化电生理学实验得出的化合物效价可能被低估。因此，关键发现应通过常规电生理学实验进行验证。

自动化膜片钳应用实例

配体发现

离子通道药物发现的主要挑战之一是鉴定可行的先导化合物。这通常通过高通量筛选和先导化合物优化实现。在高通量筛选阶段，会针对目标靶点筛选数十万至数百万种化合物。对于离子通道，高通量筛选通常使用放射性配体结合或等于荧光检测。然而，自动化电生理学在验证高通量筛选结果、命中化合物确认、先导化合物优化和机制研究方面发挥着越来越重要的作用（图2）。在最近一项旨在鉴定Nav1.7选择性阻断剂的研究中，使用Syncropatch进行的电生理学实验揭示，常规的荧光膜电位检测偏向于仅检测孔道阻断剂。鉴于这一局限性，我们设计了一种使用突变型Nav1.7通道的检测方法，该通道保持对电压传感器结构域4阻断剂的敏感性，同时丧失了对孔道阻断剂的敏感性（Chernov-Rogan et al., 2018）。通过将该突变通道与其激活剂1KαPMTX（一种黄蜂毒素衍生物）结合使用，我们设计了一种有利于鉴定具有非孔道阻断机制化合物的膜电位检测方法。在高通量筛选之后，我们利用高通量电生理学在各种Nav亚型上测试了数千个已鉴定的命中化合物，以确定效力和亚型选择性。此外，通过在含有孔道、VSD4和其他结构域靶向突变的通道上测试化合物，我们获得了有关药物结合位点和作用机制的信息。

图2. 自动化电生理学应用实例。APC，自动化膜片钳。

作用机制研究

自动化电生理学已被证明对作用机制研究很有价值。例如，对N-甲基-D-天冬氨酸受体（一种神经系统疾病靶点）的详细动力学特性进行了表征，以响应超过100种GluN2A亚型选择性正向别构调节剂（Volgraf et al., 2016）。这些正向别构调节剂是含有噻唑并嘧啶酮的化合物，其正向调节主要通过延长去活化动力学实现。使用IonFlux HT，研究了GluN2A效应增强与去活化动力学之间的相关性。该研究基于不同的芳香族右手基团对化合物进行分类，并指导了化合物的理性设计。

结构-功能研究

高通量电生理学已应用于结构-功能研究。我们研究了Protoxin-II（ProTx2）对Nav1.7的抑制，ProTx2是一种从秘鲁绿色天鹅绒狼蛛中分离出的30个残基的胱氨酸结肽类毒素（Xu et al., 2019）。结构研究表明，ProTx2在通道的激活态和失活态下均与VSD2形成复合物。为了探究ProTx2的受体位点，我们使用Syncropatch测试了超过50种突变通道和18种毒素变体。结果揭示，ProTx2通过静电相互作用调节Nav1.7，并且该机制对于其他相关毒素是保守的，从而为设计新型Nav1.7选择性化合物提供了模板和依据。

疾病突变表征

离子通道的突变是许多人类疾病的基础（Ptacek, 2015）。基因检测的进步导致鉴定出的离子通道基因变体数量增加。随着高通量电生理学的出现，现在可以确定这些变体的潜在致病性。使用Syncropatch对30个已知的KCNQ1变体进行了表征，并显示出Syncropatch与历史数据之间的强一致性（Vanoye et al., 2018）。接着，在12周的时间内对48个新变体进行了表征，约70%的变体基于功能数据进行了分类。所有变体均通过电穿孔进行瞬时表达。因此，瞬时转染与高通量电生理学的结合使得对疾病相关变体进行高通量表征成为可能。

原代细胞记录

由于其脆弱的表面膜和不规则的形状，对原代细胞进行手动电生理学记录可能具有挑战性。尽管如此，使用自动化膜片钳平台进行原代细胞研究已取得进展。Patchliner已成功应用于记录源自血管、关节炎关节以及免疫和神经系统的原代细胞（Milligan et al., 2009）。Patchliner也已用于评估源自多能干细胞的 人心肌细胞（Becker et al., 2013; Rajamohan et al., 2016）。为了记录大鼠原代T淋巴细胞，我们在Syncropatch上测试了各种参数，并优化了条件以获得最佳结果（两次1000毫秒、200mBar的抽吸脉冲，以及10MΩ高电阻芯片）。在这些条件下，约10%的原代T细胞能够成功记录（Li et al., 2017）。

展望

过去15年见证了自动化膜片钳平台的巨大进步和演变。这些技术已成功整合到离子通道药物发现项目中，从配体发现到先导化合物优化和机制研究。据估计，近年来发现的大多数离子通道临床候选药物都通过自动化膜片钳进行了表征。此外，自动化膜片钳已广泛应用于针对hERG、Nav1.5和其他离子通道的药物安全测试，从而产生了更安全的药物。尽管取得了这些进展，但当前的自动化膜片钳平台仍不具备足够的通量用作高通量筛选的主要工具，并且仪器和耗材的成本仍然很高。与手动膜片钳相比，自动化膜片钳已将技术挑战降至最低，但仍需要高度培训的人员。质量控制和大容量数据分析仍然具有挑战性。因此，预计这些领域将持续改进。自动化膜片钳技术的进步，以及光学电生理学等新技术的出现，将有助于未来发现离子通道调节剂的努力。

引用文献

根据CrossRef统计，被引用次数：21。

（以下为引用文献列表，因格式要求已去除网络链接）

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• Carlos G. Vanoye... (2021).
• Anke Sambeth... (2021).
• Janna Bednenko... (2021).

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