肠道微生物群是饮食与心血管疾病（CVD）之间的重要联系。通过粪便宏蛋白质组学方法，该方法可以同时捕获人类肠道和微生物蛋白质，我们确定了肠道微生物群、饮食、肠道健康和CVD之间的相互作用。传统的心血管疾病风险因素（年龄、BMI、性别、血压）解释了不到10%的蛋白质组变异。然而，基于人类蛋白质的无监督聚类分析揭示了两个明显的心血管疾病风险集群（低风险和高风险），具有不同的血压（相差9 mmHg）和性别相关的膳食钾和纤维摄入量。在人类蛋白质组中，低风险组的血管紧张素转换酶和与中性粒细胞胞外陷阱形成及自身免疫疾病相关的炎症蛋白较低。在微生物蛋白质组中，低风险组的磷酸乙酰转移酶表达较高，特别是纤维发酵细菌中，该酶可产生短链脂肪酸（SCFAs）。该模型识别了心力衰竭患者中的严重程度，并在一个大型人群队列中预测了长期心血管事件的风险。这些发现强调了可能与CVD风险因素相关的多因素肠道到宿主机制。
【摘要】
肠道微生物群是饮食与心血管疾病（CVD）之间的重要联系。通过粪便宏蛋白质组学方法，该方法可以同时捕获人类肠道和微生物蛋白质，我们确定了肠道微生物群、饮食、肠道健康和CVD之间的相互作用。传统的心血管疾病风险因素（年龄、BMI、性别、血压）解释了不到10%的蛋白质组变异。然而，基于人类蛋白质的无监督聚类分析揭示了两个明显的心血管疾病风险集群（低风险和高风险），具有不同的血压（相差9 mmHg）和性别相关的膳食钾和纤维摄入量。在人类蛋白质组中，低风险组的血管紧张素转换酶和与中性粒细胞胞外陷阱形成及自身免疫疾病相关的炎症蛋白较低。在微生物蛋白质组中，低风险组的磷酸乙酰转移酶表达较高，特别是纤维发酵细菌中，该酶可产生短链脂肪酸（SCFAs）。该模型识别了心力衰竭患者中的严重程度，并在一个大型人群队列中预测了长期心血管事件的风险。这些发现强调了可能与CVD风险因素相关的多因素肠道到宿主机制。
【材料与方法】
本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并获得了澳大利亚墨尔本阿尔弗雷德医院人类研究伦理委员会的批准（批准编号415/16和477/17）。所有参与者提供了知情同意，并于2016年10月至2020年1月期间招募。该研究在澳大利亚新西兰临床试验注册中心注册，注册号为ACTRN12620000958987。招募和纳入/排除标准已在先前的研究中描述过。简而言之，对于VicGut队列，健康参与者年龄为40-70岁，男女不限，BMI为18.5-30 kg/m²，未使用降压药物，在墨尔本和谢珀顿的两个地点招募。这些参与者身体健康，无糖尿病或胃肠道疾病。心力衰竭伴保留射血分数（HFpEF）患者通过右心导管检查确诊，确认静息肺毛细血管楔压（PCWP）≥15 mmHg或运动PCWP≥25 mmHg，左室射血分数（LVEF）>50%，符合公认的HFpEF诊断标准。排除标准包括近6个月内服用抗生素或益生菌。
【结果】
通过K均值聚类分析，我们根据人类和微生物蛋白质表达将样本分为两组。基于PC2和PC3的聚类方法显著区分了样本，p值<0.001（低于PERMANOVA可检测下限），表明两组之间的人类和微生物蛋白质表达存在显著差异。低风险组（Cluster 1）中有25种蛋白质过表达，形成了一个蛋白质-蛋白质网络。关键过表达通路包括胰腺分泌、蛋白质消化和吸收、糖酵解/糖异生以及参与胰岛素信号传导介导的葡萄糖转运蛋白（如YWHAE和YWHAH）。其中，我们鉴定出了与收缩压相关的ATP2A2，其功能障碍通过氧化应激导致血压升高；CELA3B是一种可能参与肠道胆固醇代谢和运输的弹性蛋白；MYO1D是一种维持肠上皮完整性的肌动蛋白。
低风险组中40种蛋白质表达下调，相关通路包括中性粒细胞胞外陷阱形成、血管紧张素原向血管紧张素II的转化以及与自身免疫调节相关的通路（如miRNA在败血症、哮喘、系统性红斑狼疮中的作用）。这些蛋白质形成了紧密的蛋白质-蛋白质相互作用网络。中央网络包括肠炎标志物钙保护蛋白（S100A8）及其相关蛋白S100A12。LCN2可与MUC13相互作用，后者是紧密连接的负调控因子。另一种下调的蛋白质，蛋白聚糖2（PRG2），也称为嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白（MBP），可抑制肠上皮中闭合蛋白的表达，从而破坏肠上皮屏障。这些发现表明，Cluster 2中的肠上皮屏障完整性可能受损。我们还发现了两种血管紧张素转换酶，组织蛋白酶D（CTSD）和组织蛋白酶G（CTSG），它们可能导致高血压中观察到的过度激活的肾素-血管紧张素系统（RAS）。CTSD与心血管风险、更差的CVD结局和促炎因子有关。实际上，CTSD与夜间脉压显著相关。小肠和结肠是CTSD和CTSG表达水平最高的组织之一，提示肠道CTSD在血压调节中的作用。LCN2作为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，之前研究表明它可导致心脏肥大和衰竭，同时也是先天免疫系统的一部分，限制细菌生长并防止肠炎。与LCN2一起，其他关键中性粒细胞相关蛋白质（如ELANE和MPO）也表达下调。
【讨论】
结合与CVD和炎症相关的蛋白质和通路，假设这些簇代表不同的CVD风险组。为了验证这一假设，我们分析了与宏蛋白质组数据中识别的簇相对应的参与者的医疗和人口统计数据。确实，我们发现Cluster 1的夜间收缩压比Cluster 2低约9 mmHg，脉压低约5 mmHg，表明其心血管风险较低。因此，我们将Cluster 1分类为低心血管风险组（以下简称“低风险组”），Cluster 2为高心血管风险组（以下简称“高风险组”）。值得注意的是，两组的饮食模式因性别而异。低风险男性膳食纤维和钾摄入量显著较高。低风险组整体钠摄入量较高，但在调整性别后，高低风险组之间钠摄入量无显著差异。由于饮食对肠道微生物群和CVD的影响，我们进一步评估了两组间常见饮食因素解释的总变异。总体而言，膳食因素解释了两组间差异表达的人类蛋白质约20%的总变异，突显了膳食因素在减轻CVD风险中的重要性，尽管不是唯一决定因素。值得注意的是，高钾摄入在低风险组中显著解释了约5%的变异。
【结论】
传统的心血管风险因素无法明确区分我们数据集中的人类肠道腔蛋白质和肠道微生物蛋白质表达谱。通过引入机器学习模型，我们成功地根据独特的蛋白质表达谱识别出两个具有显著不同心血管风险因素的组。除了揭示与这些低风险和高风险组相关的分子机制外，我们的研究还揭示了一些复杂的相互作用，这些相互作用由饮食、肠道微环境、肠道微生物群和心血管系统共同作用，导致不同的CVD风险，包括长期风险。我们的结果强调了这些相互作用的复杂性，因为宏蛋白质组变化不能仅归因于单一因素。这突显了应用能够捕捉风险因素和表型之间复杂关系的机器学习模型的必要性，而不是传统的统计方法。
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