文章
收稿日期：2014年4月14日 | 接受日期：2014年7月31日 | 发表日期：2014年9月10日
磁性抗体连接纳米媒介用于治疗性细胞靶向
Ke Cheng1,2,3，Deliang Shen4，M. Taylor Hensley2，Ryan Middleton1，Baiming Sun1，Weixin Liu1，Geoffrey De Couto1 & Eduardo Marbán1
干细胞移植是治疗性心脏再生的有前景策略，但目前疗法因潜在有益细胞（无论是外源移植还是内源募集）与受损组织之间的相互作用效率低下而受到限制。在此，我们应用靶向纳米医学，在不进行细胞移植的情况下实现体内细胞介导的组织修复、成像和局部富集。将铁纳米颗粒与两种抗体（一种针对治疗细胞上的抗原，另一种针对受损细胞）结合，产生磁性双功能细胞连接器（MagBICE）。抗体将治疗细胞与受损细胞连接，而MagBICE的铁核则实现物理富集和成像。我们通过将外源骨髓来源干细胞（表达CD45）或内源CD34阳性细胞靶向至受损心肌细胞（表达肌球蛋白轻链）来治疗急性心肌梗死。靶向可通过磁吸引进一步增强，从而增强功能效益。MagBICE代表了一种可推广的再生医学平台技术。
DOI: 10.1038/ncomms5880 开放获取
1Cedars-Sinai心脏研究所，8700 Beverly Boulevard，洛杉矶，加利福尼亚90048，美国。
2分子生物医学科学系，比较医学与转化研究中心，兽医学院，1060 William Moore Drive，北卡罗来纳州立大学，罗利，北卡罗来纳27607，美国。
3生物医学工程联合系，北卡罗来纳大学教堂山分校与北卡罗来纳州立大学，罗利，北卡罗来纳27607，美国。
4心内科，郑州大学第一附属医院，郑州，河南450052，中国。
通讯作者及材料索取请与K.C.（邮箱：ke_cheng@ncsu.edu）或E.M.（邮箱：Eduardo.Marban@csmc.edu）联系。
自然通讯 | 5:4880 | DOI: 10.1038/ncomms5880 | www.nature.com/naturecommunications
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引言
细胞疗法在实现再生方面具有巨大潜力1-6，但疗效受限于需要将足够数量的治疗细胞递送至受损组织7,8。无论细胞类型和给药途径如何，递送至心脏的细胞在数小时后的保留率通常低于10%。这至少部分解释了急性心肌梗死（MI）骨髓来源干细胞临床试验中治疗益处微小且不一致的原因。因此，需要新方法来集中再生细胞（无论是外源还是内源）至其靶点，并使它们与病变组织结合。
在此，我们应用靶向纳米医学，在不进行细胞移植的情况下实现体内细胞介导的组织修复、成像和局部富集。将铁纳米颗粒与两种抗体（一种针对治疗细胞上的抗原，另一种针对受损细胞）结合，产生磁性双功能细胞连接器（MagBICE）。抗体将治疗细胞与受损细胞连接，而MagBICE的铁核则实现物理富集和成像。我们通过将外源骨髓来源干细胞（表达CD45）或内源CD34阳性细胞靶向至受损心肌细胞（表达肌球蛋白轻链，MLC）来治疗急性MI。体外实验中，MagBICE表现出最小的细胞毒性，并特异性结合骨髓来源干细胞和受损心肌细胞，将两者连接。在MI大鼠模型中，静脉输注的MagBICE集中于受损心肌，可通过磁共振成像（MRI）观察到。此外，MagBICE捕获循环中的骨髓来源干细胞或内源性CD34阳性细胞，并将这些细胞集中在受损心脏组织中，减少疤痕形成并改善泵功能。靶向可通过磁吸引进一步增强，从而增强功能效益。因此，我们通过一种新型静脉输注纳米颗粒实现了显著的治疗效果，可与传统细胞疗法相媲美。磁性纳米媒介概念可推广至多种疾病靶点。
结果
MagBICE的合成及理化性质。MagBICE的概念示意图如图1a所示。Ferumoxytol（商品名：Feraheme（FH））9是一种铁纳米颗粒，包被有羧化葡聚糖聚合物，可通过激活羧基（COOH）基团与水溶性碳二亚胺1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDAC）试剂共价结合抗体。生成的活性酯与目标抗体上的伯胺反应。这里测试的第一个MagBICE颗粒（MagBICE1）是通过将抗CD45和抗MLC抗体与FH结合产生的。通过冷冻透射电子显微镜（图1b）观察未偶联FH和MagBICE1，清晰识别出铁核以及MagBICE1上结合的抗体。两种抗体的结合进一步通过免疫荧光二抗针对MagBICE1上的一抗得到证实（图1c）。偶联后溶液中抗体浓度（通过SDS PAGE和A280测量）的降低证实了偶联效率（图1d,e）。与FH相比，MagBICE1的尺寸略大（均值±标准差：95.7±14.5 nm对比25.2±5.0 nm；图1f和补充图1），但Zeta电位相似（均值±标准差：−9.6±1.5 mV对比−5.2±4.2 mV；图1g）。抗体连接子的添加并未显著改变FH的轻微负Zeta电位，这通常适用于静脉注射应用10,11。
体外结合与连接活性。MagBICE1特异性结合干细胞和受损心肌细胞并将两者连接的能力通过体外实验在大鼠骨髓单个核细胞（BMC）和新生大鼠心肌细胞（NRCM）上进行了研究。共聚焦成像（图1h）、流式细胞术（图1i）和普鲁士蓝铁染色（图1j）证实MagBICE1有效结合大鼠BMC，而未偶联FH则不能。抗体剥离方案排除了BMC对MagBICE1的任何显著内吞作用（补充图2）。对NRCM进行轻度透化处理以模拟缺血性损伤引起的膜破坏；此操作暴露了通常局限于细胞内的MLC。MagBICE1结合受损NRCM，而未偶联FH则不能（均值±标准差：69.5±14.0%对比1.5±2.3% FITC阳性NRCM，图1k）。结合特异性针对受损细胞，因为MagBICE1不结合健康NRCM（补充图3a）。为了证明连接作用，将大鼠BMC与受损NRCM共培养，在MagBICE1或FH存在下进行。MagBICE1（而非FH）增加了附着于受损心肌细胞的BMC数量（均值±标准差：9.0±1.7对比1.8±1.9个DiD标记BMC/高倍视野（HPF），图1l）。使用MagBICEnull（FH与兔和小鼠IgG同型对照抗体偶联）的对照实验既不结合受损NRCM，也不与BMC连接，表明MagBICE1的结合/连接作用是特异性的（补充图3b）。MagBICE1的存在不影响NRCM活力（均值±标准差：6.8±3.2%对比7.0±2.5% EthD阳性死细胞，补充图4）、BMC增殖（补充图5）或BMC迁移（补充图6），表明细胞毒性极小。
体内结合与连接活性。为了测试MagBICE1的损伤靶向和细胞连接能力，通过缺血/再灌注损伤在大鼠中建立MI（图2a）。心脏MRI显示，静脉输注的MagBICE1有效靶向受损心肌，在T2*加权MRI图像中产生信号空洞（黄色箭头，图2b）。未偶联FH产生的“低信号”远小于MagBICE，但略大于对照组。免疫组化进一步证实MagBICE1（而非FH）与梗死区域结合（图2c）。这里我们使用山羊FITC偶联抗兔二抗检测MagBICE1上的兔抗CD45抗体。在MagBICE1处理动物的梗死区域观察到特异性FITC荧光。高倍镜显示MagBICE1的球状形态（通过荧光团偶联二抗（绿色，图2c）检测）及其在心肌细胞（红色，图2c）表面的存在。通过普鲁士蓝染色观察MagBICE1的铁核（补充图7）。在非梗死（远端）心肌中未发现MagBICE1，证实了结合特异性。MagBICE1输注导致梗死区域CD45阳性细胞增加（均值±标准差：11.7±3.6对比1.9±1.9个细胞/HPF，图2d）。MagBICE1并未加剧MI后心脏的炎症：三个实验组中CD68阳性巨噬细胞（品红色，图2e）的数量相似。大多数MagBICE1（绿色，图2e）结合在心肌细胞上，尽管有一些被巨噬细胞内吞，表现为FITC（MagBICE1）/CD68双阳性细胞。体外实验中，MagBICE1被分离的大鼠巨噬细胞内吞的量极小，与设计用于内吞的较大铁珠（阳性对照）相比（补充图8）。没有铁过载迹象：MagBICE1输注未升高血清转铁蛋白或铁蛋白水平（补充图9和10），肝脏中也没有过多游离铁（补充图11）。
MagBICE1用于BMC治疗的功能效益。MagBICE1输注是否能够实现治疗性细胞靶向和受损组织再生？为回答这个问题，在急性MI大鼠中静脉输注MagBICE1或FH（图3a,b）。20分钟后，输注200万个同基因DiI标记BMC以产生循环标记干细胞。MagBICE1增加了BMC（红色DiI信号）对心脏的靶向，同时降低了肺部的非靶向荧光（图3c），组织学证实MagBICE1增加了梗死区域的BMC数量（均值±标准差：33.1±14.7对比3.7±1.7个细胞/HPF，图3d）。被MagBICE1包裹的BMC（红色）通常与梗死区域中的受损心肌细胞（绿色）共定位。尽管死亡BMC残留的荧光分子可能被周围细胞摄取，但DiI荧光仍应代表最初募集的BMC数量（24小时时无论死活）。
通过MagBICE1实现的工程化干细胞靶向和细胞-细胞连接带来了治疗益处。Masson三色染色区分存活组织（红色）和疤痕（蓝色，图3e）。与对照组相比，疤痕质量减少（均值±标准差：23.6±7.2 mg对比43.9±6.2 mg），疤痕大小也减少（均值±标准差：16.3±4.9%对比35.1±10.4%；表示为占左心室（LV）总质量的百分比）。同时，梗死壁厚度增加（即保存更好）在MagBICE1+BMC输注组（均值±标准差：0.85±0.22 mm对比0.41±0.13 mm）。通过LV射血分数（LVEF）评估的整体泵功能在所有三组基线（MI后24小时）时无差异，表明损伤程度相似（图3f；左侧，白色柱）。四周后，MagBICE1+BMC输注动物的LVEF高于盐水输注组（均值±标准差：41.6±6.7%对比26.7±2.8%，图3f；左侧，黑色柱）。实际上，盐水输注产生负治疗效应，LVEF随时间下降，而MagBICE1+BMC有力地保护了心脏功能（右侧，图3f）。未偶联FH+BMC输注在所有指标上与盐水输注无差异，表明细胞靶向至损伤区域对治疗益处至关重要。组织学显示，MagBICE1以下是接续的翻译内容，从结果部分「MagBICE2 联合磁靶向的功能益处」开始，至文章末尾，包含讨论、方法、作者贡献等，最后以【全文结束】标识。
结果（续）
MagBICE2 联合磁靶向的功能益处
我们接下来探讨两个新问题：(i) MagBICE 能否将内源性干细胞富集到梗死区域并发挥类似于细胞移植的治疗益处？(ii) MagBICE 的铁核是否不仅可用于成像，还可通过施加外部磁场进行物理富集？为回答这些问题，我们制备了另一种 MagBICE（MagBICE2），通过将抗 CD34 和抗 MLC 抗体与 FH 结合。MagBICE2 在体外特异性结合受损心肌细胞（补充图 13）。当静脉输注给 MI 后的大鼠时（图 4a），MagBICE2 归巢至受损心肌，表现为局部 MRI 信号空洞（图 4b，MagBICE2 组）。施加局部磁场进一步增强了靶向效果（图 4b，MagBICE2 + M 组）。输注 MagBICE2 后 24 小时分离外周血单个核细胞（PBMC）；部分 PBMC 结合了纳米颗粒，并通过磁激活细胞分选进一步富集（补充图 14）。流式细胞术显示这些细胞主要为 CD34 阳性。MagBICE2 治疗后 4 周，心脏中的内源性 CD34 细胞被富集（7.8 ± 2.6 个细胞/HPF，而盐水对照组为 3.6 ± 1.8，FH 输注组为 3.1 ± 1.6）。磁靶向进一步增强了这种结合（增至 15.4 ± 5.1 个细胞/HPF，图 4c）。MagBICE2 联合磁靶向给药在风险区域保留了最多的存活组织（图 4d），并在 4 周时获得了最高的心功能（LVEF；图 4e）。尽管单独使用 MagBICE2 治疗也改善了结果，但明确的物理吸引力显著增强了疗效。
讨论
目前，美国食品药品监督管理局批准了约 430 种抗体疗法14，其中包括 10 种重磅药物。大多数用于癌症治疗，例如设计用于将细胞毒性 T 细胞募集到癌细胞的抗体。后一原理利用了更简单的双特异性 T 细胞衔接器实体15，它由融合的单克隆抗体片段组成，没有磁性核心。MagBICE 和双特异性 T 细胞衔接器的相似之处在于两者都利用连接抗体实现分子共定位。双特异性蛋白和抗体也被用于增强干细胞靶向和组织再生16-19。然而，MagBICE 与双特异性抗体有根本不同：其铁核可通过 MRI 实现组织定位的可视化，并通过局部磁场增强靶向效率。这些特征可能克服传统细胞疗法的某些局限性，包括生物分布的不确定性和细胞保留率低，即使是局部递送也是如此20。通过静脉输注进行全身递送是微创的，但归巢到靶器官的效果很差21。两种 MagBICE 原型将全身递送的干细胞或内源性干细胞靶向到受损心脏组织，产生了与直接 BMC 移植的临床前模型相当的治疗效果22,23。与之前使用双特异性抗体武装 BMC 的报道相比24，我们的技术是质的进步。首先，操作剂不需要与 BMC 在体外预武装；相反，MagBICE 可以在体内捕获内源性 BMC，正如我们使用 MagBICE2 所展示的那样。此外，铁纳米核心实现了 MRI 检测和物理（磁性）富集。我们的研究也存在若干局限性。第一，铁引起的低增强可能在输注后初期扭曲 MR 图像质量。随着时间的推移，铁的降解和吸收应能缓解此问题。第二，单独使用 MagBICE2 仅产生边际功能益处，进一步强调了协同磁靶向的效用。可能是循环中可供 MagBICE 捕获的 CD34+ 细胞数量不足，限制了治疗效果。我们尚未测试辅助性骨髓刺激剂（如粒细胞集落刺激因子）是否能增强 MagBICE 疗效，但这值得未来研究。第三，在我们的研究中，MagBICE 是在再灌注后立即输注的。在许多临床场景中，较晚的给药时间点可能更现实，但我们尚未研究延迟给药的效果。最后，我们在动物研究中未包含 MagBICEnull 组。MagBICE 在体内的非特异性结合效应有待进一步研究。
总之，磁性抗体连接的纳米媒介实现了分子靶向、物理富集和无创成像，所有这些都集成在一个易于合成的颗粒中。通过改变抗体和/或在铁核上加载药物有效载荷，该策略具有广泛的通用性。此外，鉴于铁纳米核心和重组人抗体在临床上均已广泛使用，其向患者的转化应该是直接的。
方法
MagBICE 的制备与表征。MagBICE1 通过将兔抗 CD45 抗体（Abcam）和小鼠抗 MLC 抗体（Abcam）与 FH 颗粒结合生成。MagBICE2 通过将抗 CD45 和山羊抗 CD34 抗体（LifeSpan Biosciences）与 FH 颗粒结合生成，使用基于 EDAC 的 PolyLink 偶联试剂盒（Bangs Laboratories）。简要地，将 50 µl FH 颗粒、100 µg 抗 CD45 抗体（或抗 CD34 抗体）、100 µg 抗 MLC 抗体和 40 µl EDAC 在 Protein Link Buffer 中混合，室温下轻轻摇晃孵育 4 小时。之后，将全部内容物以 13,000 rpm 离心 10 分钟。移除上清液，得到的 MagBICE 颗粒用 Protein Wash/Storage Buffer 洗涤两次，并储存在 4°C 的同一缓冲液中。使用 Cryo-TEM 进行可视化25。偶联的抗体用醋酸铀酰进行负染，复合物中的氧化铁核心未染色。为了准备网格，将 3 µl 样品放在 Quantifoil 2/1 多孔碳膜网格上，用滤纸吸干，并迅速浸入液态乙烷中。图像使用 FEI TF20 冷冻电子显微镜在 200 kV 下记录。为了确认一抗的存在，将 MagBICE 与山羊抗小鼠（Texas-Red，2 mg/ml，1:400 稀释；Abcam）和山羊抗兔（FITC，2 mg/ml，1:400 稀释；Abcam）二抗孵育，离心后使用 Nikon EclipseTE2000-U 落射荧光显微镜观察。通过 SDS-PAGE 和 NanoDrop ND-100 分光光度计（Thermo Scientific）测量 280 nm 吸光度（A280）蛋白浓度进一步评估偶联效率。使用 Zetasizer Nano ZS90（Malvern Instruments）测量水动力尺寸和 Zeta 电位。
体外细胞结合与连接研究。大鼠 BMC 来自 Wistar-Kyoto 大鼠的股骨和胫骨骨髓冲洗物，并通过梯度离心分离26。大鼠 NRCM 按照先前描述的方法分离和培养27。简要地，从 1 至 2 日龄新生大鼠中分离 NRCM，并作为单层培养。培养基基于 M199（Life Technologies），包含以下成分：10 mM HEPES、0.1 mM 非必需氨基酸、3.5 mg/ml 葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、4 µg/ml 维生素 B12、100 U/ml 青霉素和 10%（培养前 2 天）或 2%（培养 2 天后）的胎牛血清。将大鼠 BMC 与 MagBICE1 或未偶联 FH 在 37°C 下孵育 15 分钟。洗涤后，细胞进一步与山羊抗兔 FITC 抗体在 37°C 下孵育 15 分钟。使用 Leica TCS SP5 X 共聚焦显微镜系统和带有 Summit Software 的 Cyan 流式细胞仪检查结合效率。进行普鲁士蓝染色13以可视化 BMC 上的铁，并使用抗体剥离方案28排除 BMC 对铁的内吞作用。为了在体外创建受损心肌细胞，将 NRCM 在 4°C 下用 BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液进行短暂透化处理 5 分钟。洗涤后，受损细胞与 MagBICE1 或未偶联 FH 在 37°C 下孵育 1 小时，然后与荧光二抗在 37°C 下再孵育 1 小时。细胞随后在 Leica TCS SP5 X 共聚焦显微镜系统下观察。为了证明连接作用，用荧光染料 DiD（Invitrogen）标记大鼠 BMC，并与受损 NRCM 共培养 1 小时，在 MagBICE1 或 FH 存在下进行。充分洗涤后，定量附着于受损 NRCM 的 BMC。
体外细胞毒性研究。对于心肌细胞活力测定，将大鼠 NRCM 与 60 µg 铁/ml 的 MagBICE1 或未偶联 FH 在 37°C 下孵育 24 小时。然后洗涤细胞培养物，并用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒（Invitrogen）染色29，该试剂盒通过同时染色绿色荧光 calcein-AM（活）和红色荧光 ethidium homodimer-1（EthD；死）来快速区分活细胞和死细胞。使用 Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo Molecular Technologies）评估 MagBICE1 或 FH 存在下的大鼠 BMC 增殖30。使用 transwell 细胞迁移测定板（BD Biosciences）评估 MagBICE1 或 FH 存在下的 BMC 迁移31。
体内结合研究。所有动物程序均符合 Cedars-Sinai 机构动物护理和使用委员会的规定。在 8 至 12 周龄雌性 Wistar-Kyoto 大鼠中通过 3 小时缺血和 20 分钟再灌注30 建立 MI。通过尾静脉静脉输注盐水（400 µl PBS）、未偶联 FH（10 mg 铁/kg 体重，溶于 400 µl PBS）或 MagBICE（10 mg 铁/kg 体重，溶于 400 µl PBS）。输注后 24 小时，使用 Bruker Biospec 9.4T 小动物 MRI 系统通过梯度回波序列进行心脏 MRI 以产生 T2* 加权图像。使用 60 mm 直径线性发射/接收线圈（Bruker, T10325V3）进行激发，使用专为大鼠心脏成像设计的 4 通道阵列线圈（Bruker, T10324V3）进行信号采集以提高信噪比。脉冲序列细节为：重复时间（TR）：5.1 ms；回波时间（TE）：2.4 ms；翻转角（FA）：8.0°。使用 Bruker IntraGate 软件（Bruker）进行回顾性门控，为每个切片生成十幅电影图像。此外，采集一幅冠状电影图像，该图像解剖心脏以确认铁颗粒的存在。使用 NIH ImageJ 软件从横断面图像量化铁信号强度，并归一化至邻近组织。成像结束后处死动物，使用切片机制备 8 µm 厚的心脏冷冻切片。为了观察 MagBICE1 颗粒在心脏中的保留及其与心肌细胞的共定位，用 4% 多聚甲醛固定切片，用含有 1% 皂苷（Sigma）的 Protein Block Solution（DAKO）透化/封闭，并用 FITC 偶联二抗（用于检测 MagBICE1 上的一抗）和 α-肌小节肌动蛋白（Abcam；通过 Texas-Red 偶联二抗检测）进行染色。使用 Leica TCS SP5 X 共聚焦显微镜系统拍摄图像。MagBICE1 的靶向效率通过同一视野的 FITC 信号强度归一化至 Texas-Red 信号强度来量化，使用 Leica LAS AF Software。通过组织普鲁士蓝染色进一步确认铁的存在30。切片也用 FITC 偶联抗 CD45（Abcam）或 Cy5 偶联抗 CD68 抗体（Abcam）染色，以评估 MagBICE1 是否靶向内源性细胞和/或加剧 MI 后心脏的炎症。为了检查内源性干细胞是否被输注的 MagBICE2（CD34-Fe-MLC）捕获，在治疗后 24 小时，从 FH 和 MagBICE2 输注的动物中通过 Ficoll 密度梯度离心分离 PBMC。对 PBMC 进行磁分选以分离结合铁（MagBICE 或 FH）的细胞。通过流式细胞术分析阳性群体的 CD34 表达。
铁过载研究。在 MagBICE1 或 FH 输注后第 3 天，从部分动物中取血进行铁过载研究。使用市售 ELISA 试剂盒（大鼠转铁蛋白和大鼠铁蛋白，Immunology Consultants Laboratory Inc.，目录号 E-25TX 和 E-25F）测量血清转铁蛋白和铁蛋白水平28。通过普鲁士蓝染色进行肝脏组织学检查以评估过量游离铁沉积情况30。
治疗功效研究。在类似的大鼠缺血/再灌注损伤模型中，将 MagBICE1 或未偶联 FH 静脉输注给 6 至 8 周龄雌性 Wistar-Kyoto 大鼠。此外，在纳米颗粒输注后 20 分钟，静脉输注 200 万个 DiI 标记 BMC（来自雄性大鼠）。包含一个仅盐水组作为对照。纳米颗粒/细胞输注后 24 小时，每组部分动物被处死。取出心脏/肺/肝脏，用盐水洗涤，并使用 IVIS 200（Xenogen）系统进行离体荧光成像以测量 DiI 荧光。如先前所述13 量化荧光信号（总通量（p/s））。通过计数 DiI 阳性细胞对心脏冷冻切片中的 BMC 进行量化。使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行复染，并使用 FITC 偶联的山羊抗兔二抗观察 MagBICE1。大鼠在 MI 后 24 小时（基线）和 4 周时使用 Vevo 770 成像系统（VisualSonics）进行超声心动图检查32。在最大 LV 直径水平的长轴视图中对心脏进行二维成像。使用 VisualSonics V1.3.8 软件从穿过梗死区域的视图测量 LVEF。4 周超声心动图检查结束后，处死所有动物进行组织学研究。按照制造商说明（HT15 三色染色（Masson）试剂盒；Sigma）进行 Masson 三色染色。使用 PathScan Enabler IV 玻片扫描仪（Advanced Imaging Concepts）获取图像。从 Masson 三色染色图像中，使用 NIH ImageJ 软件13 测量梗死壁厚度，并进行存活质量、疤痕质量和疤痕大小的体积分析33。为了量化梗死区域的血管生成水平，用抗平滑肌肌动蛋白抗体染色玻片，并计数平滑肌肌动蛋白阳性的小动脉结构。
磁富集实验。将 MagBICE2（10 mg 铁/kg 体重，溶于 400 µl PBS）通过尾静脉静脉输注给健康 Wistar-Kyoto 大鼠，在输注期间及输注后持续 10 分钟，将一个 1.3 T 圆形钕磁铁置于左侧胸部区域上方30。之后，使用 Bruker Biospec 9.4T 小动物 MRI 系统对动物进行成像，以追踪输注的 MagBICE 颗粒的分布。
统计分析。结果以均值±标准差表示，除非另有说明。两组之间的比较使用双尾非配对 Student’s t 检验。三组或以上组之间的比较使用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Bonferroni 事后检验。当 P < 0.05 时认为差异具有统计学意义。
参考文献
（因篇幅限制，此处省略参考文献列表，具体见原文）
作者贡献
K.C. 和 E.M.：概念与设计、手稿撰写与资金支持、最终批准手稿；K.C., D.S., M.T.H., B.S., G.D.C. 和 R.M.：数据收集和/或整理、数据分析与解释。
附加信息
补充信息：随本文可在 获取。
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