摘要
遗传性感觉和自主神经病（HSAN）是一组影响外周神经系统（PNS）感觉和自主神经成分的隐性遗传疾病。与躯体感觉功能障碍相比，HSAN中内脏功能障碍的发病机制研究仍不足。本研究探讨了条件性Dystonin（Dst）基因捕获小鼠（一种HSAN VI型（HSAN-VI）动物模型，其中Cre重组酶在选择性神经回路中失活Dst表达）中观察到的心律失常的神经回路机制。使用Advillin-Cre在PNS神经元中失活Dst基因导致感觉和交感神经节神经元退化，同时伴有心律失常，其特征为心率变异性增加和脉搏频率不规律，在异氟烷麻醉下尤为明显，且无蛋白聚集性心肌病。此外，使用Vglut2-Cre选择性失活PNS感觉神经元中的Dst基因也导致类似的心脏节律失调。这些发现表明，Dst突变引起的心律失常源于内脏传入回路的破坏，且这些神经回路可能成为HSAN-VI内脏功能障碍的潜在治疗靶点。
1 引言
遗传性感觉和自主神经病（HSAN）是一组临床和遗传异质性的神经退行性疾病，影响外周神经系统（PNS）（Rotthier et al., 2012）。HSAN患者的感觉和自主神经系统均出现神经退行性变。由于HSAN破坏广泛的神经网络，识别导致特定症状且适合靶向治疗干预的具体回路仍然是一个重大挑战。HSAN VI型（HSAN-VI）由Dystonin（DST）基因的功能丧失突变引起（Edvardson et al., 2012）。在小鼠中，自然发生的dystonia musculorum（dt）突变导致感觉神经元退化和异常运动行为，包括共济失调和肌张力障碍（Duchen et al., 1964；Horie et al., 2016）。自Dst被确定为dt表型的致病基因以来（Brown et al., 1995；Guo et al., 1995），dt小鼠被广泛用于研究HSAN-VI的致病机制和探索潜在治疗策略（Ferrier et al., 2014）。为了解析Dst在特定神经回路中的作用，我们先前生成了一个多用途的Dst等位基因，通过翻转切除（FLEX）技术实现细胞类型或神经回路选择性的失活和恢复（Schnütgen et al., 2005；Horie et al., 2014；Hossain et al., 2018）。利用这一遗传工具，我们证明了背根神经节（DRG）中本体感觉神经元的退化是dt小鼠运动障碍的病因（Horie et al., 2020；Yoshioka et al., 2024）。
除了躯体感觉功能障碍，HSAN-VI患者还表现出各种内脏异常，包括心血管反射受损、性功能障碍、瞳孔异常和胃肠动力障碍（Manganelli et al., 2017）。然而，其潜在的神经回路机制仍知之甚少。有研究表明，dt小鼠胃肠动力降低可能与迷走神经退化有关（Lynch-Godrei et al., 2020）。迷走神经包含副交感传出纤维和内脏传入纤维（Waise et al., 2018）。值得注意的是，在dt小鼠的迷走神经节（包含内脏感觉神经元）中已报告有神经退行性变迹象（Ichikawa et al., 2006；Lynch-Godrei et al., 2020）。这些观察结果提出了一种可能性，即内脏传入回路的破坏可能导致HSAN-VI的内脏功能障碍。
Dst基因编码组织特异性异构体，包括DST-a、DST-b和DST-e，分别主要在神经、肌肉和皮肤组织中表达（Künzli et al., 2016；Horie et al., 2017；Yoshioka, 2024）。这些主要DST异构体被认为通过充当细胞骨架连接蛋白在维持各自组织完整性中发挥重要作用。我们先前报道，异构体特异性Dst-b突变小鼠出现晚发性蛋白聚集相关心肌病和心律失常，提示心肌细胞自主缺陷可导致心脏功能失调（Yoshioka et al., 2022）。该观察随后得到临床报告的支持，该报告确定DST-b特异性突变是人类患者先天性肌病和心肌病的病因（Jacob et al., 2025）。尽管如此，尚不清楚HSAN-VI患者观察到的心血管失调主要源于神经回路异常还是心肌细胞内在缺陷。为了解决这个问题，我们进行了感觉和/或自主神经系统中Dst基因的条件性失活，以阐明PNS神经回路对HSAN-VI中心脏节律调节的各自贡献。
2 材料与方法
2.1 动物
我们使用了DstGt小鼠（MGI: 3917429，Horie et al., 2014），其来源于GGTC（ID: E182H05）的ES克隆，以及Dst-bE2610Ter小鼠（Dstem1Htak，MGI:7423674，Yoshioka et al., 2022）。将DstGt小鼠与几种Cre驱动小鼠杂交，包括PNS神经元选择性Advillin（Avil）-Cre小鼠（Aviltm2(cre)Fawa；MGI:4459942，Hasegawa et al., 2007；Zhou et al., 2010）和谷氨酸能神经元选择性Vglut2-Cre小鼠（Slc17a6tm2(cre)Lowl/J；MGI: 5300532，Vong et al., 2011）。将Ai14报告小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J；MGI:3813512，Madisen et al., 2010）与Avil-Cre小鼠或Vglut2-Cre小鼠杂交。功能性DstGt-inv等位基因由DstGt等位基因通过FLP重组酶反转，突变型DstGt-DO等位基因由DstGt-inv等位基因通过Cre重组酶反转（Horie et al., 2014）。突变小鼠DstGt、DstGt-inv和DstGt-DO分别维持在不同品系中。为了进行Cre介导的Dst表达条件性失活，将携带多用途Dst等位基因的基因捕获小鼠与每种Cre驱动小鼠杂交。动物实验经新潟大学内部审查委员会批准。小鼠在23±3°C、50±10%湿度、12小时光/暗循环下饲养，可自由获取食物和水。
2.2 组织制备与原位杂交
原位杂交按照先前研究进行（Yoshioka et al., 2020, 2022, 2024）。组织制备时，小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg体重）安乐死，并以0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注，随后用冰冷的4%多聚甲醛（PFA）于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中（pH 7.4）。解剖的组织在相同固定液中过夜浸泡。神经组织在20 mM PBS（pH 7.4）的20%蔗糖中冷冻保护直至沉底，液氮冷冻，包埋于Tissue-Tek OCT化合物中，使用冷冻切片机以16 μm厚度切片。心脏组织通过梯度乙醇系列脱水，然后经二甲苯处理，石蜡包埋。使用旋转切片机切取连续10 μm厚石蜡切片，贴于MAS涂层玻片上，在37°C热板上过夜干燥。原位杂交使用以下探针：小鼠Dst-plakin（GenBank登录号NM_001276764，nt 2185–3396）和小鼠Nppa（也称为心房钠尿肽ANP，GenBank登录号BC089615，nt 124–529）。
2.3 免疫组织化学
免疫组织化学分析在石蜡切片上进行，如前所述（Yoshioka et al., 2020, 2022, 2024）。脱蜡切片在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中微波处理5分钟，或冷冻切片直接使用无需抗原修复。切片在4°C下与以下一抗孵育过夜：兔多克隆抗PGP9.5抗体（1:1000；ENZO Life Sciences）、兔多克隆抗TH抗体（1:500；Pel-Freez Biologicals）、兔多克隆抗ATF3抗体（1:2000；Santa Cruz Biotechnology）、兔多克隆抗Sprr1a抗体（1:1000；ABclonal Technology）、兔多克隆抗HspB1/HSP25抗体（1:800；ABclonal Technology）、兔多克隆抗HSPA1L抗体（1:500；ABclonal Technology）、兔多克隆抗VAchT抗体（1:500；GeneTex）和鼠单克隆抗p62抗体（1:200；BioLegend），稀释于含0.01% Triton X-100和0.5%脱脂奶粉的0.1 M PBS中。随后切片与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1:200；MBL）在37°C孵育60分钟。免疫反应在含0.01%二氨基联苯胺四盐酸盐和0.01%过氧化氢的50 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中于37°C显色5分钟。切片经乙醇-二甲苯脱水，用Bioleit封片。免疫荧光染色时，切片与Alexa488或Alexa594偶联抗体（1:200；Invitrogen）混合液在37°C孵育60分钟。使用显微镜和共聚焦激光扫描显微镜拍摄数字图像。
2.4 心电图信号测量与定量
心电图（ECG）在麻醉下如前所述记录（Yoshioka et al., 2022）。小鼠暴露于3.5%异氟烷进行麻醉诱导，然后切换至1.5%异氟烷维持，记录ECG持续5分钟。将三根针状电极插入右前肢和左前肢用于记录，右后肢用于接地。ECG信号经AC放大器放大（带通：0.1–1 kHz），使用A/D转换器以2 kHz采样率数字化。使用LabChart Pro软件（版本8.1.30；ADInstruments）的ECG分析模块分析记录信号。通过目视检查识别包含显著噪声或运动伪影的片段，并从分析中排除。定义三个分析时段：（i）3.5%异氟烷诱导期，（ii）转换至1.5%异氟烷后的即刻过渡期，以及（iii）转换后5分钟稳定维持期。在每个时段内，计算心率（HR）、RR间期和RR间期标准差（SD）作为心率变异性（HRV）指标。为分析ECG波形，至少平均30个连续搏动以确定以下参数：PR（PQ）间期（从P波起点到QRS复合波起点）、QRS时限（从Q波起点到S波终点）和QT间期（从QRS复合波起点到T波终点）。
2.5 自由活动小鼠的心电图记录
为了评估未麻醉小鼠的心脏活动，我们使用自制系统在自由活动小鼠中进行慢性ECG记录。小鼠用3.5%异氟烷麻醉。沿中线皮肤切口，植入搪瓷涂层铜线并置于心脏两侧。将电极导线经皮下引至背部区域并外露。在枕骨上植入不锈钢螺丝电极作为系统接地。随后将所有导线焊接到自制头戴式连接器上。为确保长期稳定性，使用牙科树脂将连接器牢固固定于骨上。最后缝合皮肤切口以促进术后恢复。恢复期后，记录自由活动小鼠的ECG信号。通过自制记录系统将头戴式连接器连接到数据采集系统。ECG信号经AC放大器放大（带通滤波器：0.1–1 kHz），使用A/D转换器以2 kHz采样率数字化。使用LabChart Pro软件分析。连接记录电缆后，小鼠适应30分钟后再开始数据采集。分析时，提取稳定基线和波形变异最小期间的1分钟片段。排除包含显著噪声或运动伪影的片段。至少平均30个连续搏动。
2.6 组织透明化与成像
使用CUBIC方案（Tainaka et al., 2018）对脑和脊髓进行透明化成像，如前所述（Yoshioka et al., 2024）。从小鼠中解剖脑和脊髓，在PBS和4% PFA中灌注，后固定过夜，洗涤后浸入CUBIC-L中于37°C摇动5天，然后洗涤并浸入CUBIC-R中过夜。使用光片荧光显微镜获取3D荧光图像。
2.7 统计分析
统计分析采用t检验（对照组与cGT组）或双因素重复测量方差分析（ANOVA），以基因型（对照组与cGT组）和时段（i、ii、iii）为主因素。事后比较采用Tukey检验。使用Easy R（EZR，埼玉医科大学，日本）进行分析。样本量（n）为每种基因型的动物数量。
3 结果
3.1 PNS神经元选择性失活Dst基因导致神经退行性变
先前，我们生成了携带DstGt等位基因的多用途基因捕获小鼠，该等位基因可实现Cre介导的Dst失活和恢复（Horie et al., 2014；Yoshioka et al., 2024）。为在PNS神经元中实现Dst基因表达失活，我们使用了Avil-Cre小鼠，在该小鼠中Cre介导的重组发生在感觉神经元和交感神经节神经元中（Zurborg et al., 2011；Hunter et al., 2018）。为确认PNS神经元选择性重组，将Avil-Cre小鼠与Ai14报告小鼠杂交，其中tdTomato表达由Cre介导的重组诱导（图1）。在Avil-Cre；Ai14小鼠中，tdTomato在DRG感觉神经元（图1A）、迷走神经节（图1B）以及SCG的交感神经节神经元（图1C）中观察到。这些结果表明Avil-Cre小鼠在PNS传入和传出神经元中均实现了有效的Cre介导重组。
DstGt等位基因携带一个多用途基因捕获盒，通过盒的反转实现Cre介导的Dst失活和恢复。突变型DstGt-DO等位基因由功能性DstGt-inv等位基因通过Cre重组酶反转而来（图2A）。对于条件性基因捕获（cGT）实验，将雄性Avil-Cre；DstGt-DO/WT小鼠与雌性DstGt-inv/Gt-inv小鼠杂交（补充图1）。Avil-Cre；Dst cGT小鼠（Avil-Cre；DstGt-DO/Gt-inv）占后代的四分之一，其他基因型小鼠用作同窝对照（Ctrl）。为验证PNS神经元选择性失活Dst表达，通过原位杂交可视化Dst转录本（图2B）。在Ctrl小鼠中，Dst mRNA在DRG感觉神经元、迷走神经节以及SCG交感神经节神经元中检测到。相反，在Avil-Cre；Dst cGT小鼠的这些神经元中，Dst mRNA水平显著降低。
感觉神经退行性变是dt小鼠的病理标志（Duchen et al., 1964；Horie et al., 2016）。我们通过分析Avil-Cre；Dst cGT小鼠在1月龄时ATF3和Sprr1a的表达来评估神经退行性变迹象（图2C、DATF3是神经损伤的标志物，因其在神经损伤后选择性诱导（Takeda et al., 2000; Tsujino et al., 2000; Kiryu-Seo et al., 2016）。我们先前报道ATF3在Dst突变体的DRG感觉神经元中表达诱导（Yoshioka et al., 2024）。一致地，在Avil-Cre；Dst cGT小鼠中，ATF3在DRG、迷走神经节和SCG神经元中显著诱导表达，而在Ctrl小鼠中几乎检测不到（图2C）。Sprr1a在轴突切断术后在DRG感觉神经元和脊髓运动神经元中上调（Bonilla et al., 2002）。我们发现Sprr1a在Avil-Cre；Dst cGT小鼠的DRG感觉神经元、迷走神经节以及SCG交感神经节神经元中也增加（图2D）。在Ctrl和Avil-Cre；Dst cGT小鼠的DRG、迷走神经节和SCG中定量了ATF3和Sprr1a的表达（图2E、F）。在所有神经节中，ATF3和Sprr1a的表达均显著增加。然而，SCG中的上调趋势低于DRG和迷走神经节。还在心脏神经节的副交感神经节神经元中检测了ATF3和Sprr1a的表达。这些神经损伤标志物在系统性Dst基因敲除（Dst GT）小鼠（补充图2）和Avil-Cre；Dst cGT小鼠（补充图3）中几乎未诱导。总之，这些组织学分析表明，Avil-Cre；Dst cGT小鼠的PNS感觉（传入）和交感神经节（传出）神经元均表现出神经退行性变迹象，而心脏神经节神经元似乎未受影响。
3.2 PNS神经元选择性失活Dst基因导致心率失调
先前，我们报道了异构体特异性Dst-b突变小鼠的心律失常，其中Dst表达在心肌细胞中被破坏（Yoshioka et al., 2022）。这些Dst-b突变体表现出ECG波形变化，以QT间期延长和早搏为特征。在本研究中，在9-12月龄的Avil-Cre；Dst cGT和Ctrl小鼠中，在异氟烷麻醉下记录ECG（补充图4）。比较三个不同时段的ECG数据：诱导期以及5分钟维持期的第一分钟和最后一分钟。在维持麻醉的第一分钟，Avil-Cre；Dst cGT小鼠与Ctrl小鼠相比倾向于表现出高度可变的心率节律（图3A）。HRV通过RR间期的SD量化。Avil-Cre；Dst cGT小鼠的HRV显著高于Ctrl小鼠（基因型效应，F(1,60)=4.20，p<0.05；时段效应，F(2,60)=5.47，p<0.01；基因型×时段交互作用，F(2,60)=4.12，p<0.05，双因素ANOVA）（图3B）。不规则脉搏的频率（定义为超过±3×SD RR间期的次数）在Avil-Cre；Dst cGT小鼠中也显著高于Ctrl小鼠（基因型效应，F(1,60)=12.04，p<0.001；时段效应，F(2,60)=8.18，p<0.001；基因型×时段交互作用，F(2,60)=6.72，p<0.01，双因素ANOVA）（图3B）。尽管在即刻过渡期观察到HRV和不规则脉搏的显著差异，但这些效应在稳定维持期减弱。双因素ANOVA显示，与Ctrl小鼠相比，Avil-Cre；Dst cGT小鼠表现出显著加宽的QRS复合波（基因型效应，F(1,60)=14.63，p<0.001；时段效应，F(2,60)=0.07，p>0.05；基因型×时段交互作用，F(2,60)=0.48，p>0.05，双因素ANOVA）和缩短的PR间期（基因型效应，F(1,60)=16.38，p<0.001；时段效应，F(2,60)=0.00，p>0.05；基因型×时段交互作用，F(2,60)=0.68，p>0.05，双因素ANOVA）。然而，这些参数未观察到显著的时段主效应或基因型×时段交互作用。相反，RR和QT间期在基因型或时段方面均未观察到显著差异，也未检测到交互作用（图3B）。总之，这些发现表明，PNS感觉和交感神经节神经元中Dst的缺失导致心脏节律失调和显著传导改变。
接下来，我们对Avil-Cre；Dst cGT小鼠的心脏组织进行了病理分析。我们先前报道，心肌细胞中Dst-b异构体的缺失导致心肌病，伴有心力衰竭标志基因Nppa的上调（Yoshioka et al., 2022）。在此，我们确认了2岁龄Dst-b突变体（Dst-bE2610Ter/E2610Ter）左心室心肌中Nppa转录本的上调（图4A）。相比之下，在年龄匹配的Avil-Cre；Dst cGT小鼠的心肌中零星检测到Nppa转录本。通过Masson三色染色评估心脏纤维化（图4B）。在Dst-bE2610Ter/E2610Ter小鼠中观察到结缔组织显著增加。相反，在Avil-Cre；Dst cGT小鼠中，胶原沉积是局灶性的且程度较轻。我们还报道，蛋白聚集形成是Dst-bE2610Ter/E2610Ter小鼠心肌病的病理标志（Yoshioka et al., 2022）。先前的RNA测序分析揭示了参与未折叠蛋白反应（UPR）的伴侣蛋白编码基因表达增加。在此，我们对在Dst-bE2610Ter/E2610Ter小鼠RNA水平上调的HspB1/Hsp25和HspA1L伴侣蛋白进行了免疫组织化学分析（Yoshioka et al., 2022）。HspB1/Hsp25和HspA1L在Dst-bE2610Ter/E2610Ter心肌细胞中密集聚集，显示出不同的染色模式。HspB1/Hsp25弥漫分布于整个细胞质（图4C），而HspA1L阳性聚集体表现为小的点状信号（图4D）。在Dst-bE2610Ter/E2610Ter心肌细胞核内也观察到p62呈点状聚集体（Yoshioka et al., 2022），免疫荧光染色证实了HspA1L阳性聚集体的核定位（补充图5）。这些发现表明，伴侣蛋白功能的改变可能有助于Dst-bE2610Ter/E2610Ter小鼠中蛋白聚集的形成。在Avil-Cre；Dst cGT小鼠的心脏组织中，几乎未观察到HspB1/Hsp25和HspA1L的聚集。这些数据表明，Dst-b异构体的缺失导致心肌细胞功能障碍和退化，而PNS回路中Dst-a异构体的条件性缺失与心肌细胞本身的严重损伤无直接关联。因此，Avil-Cre；Dst cGT小鼠的心率失调很可能是由神经回路异常而非心肌病引起。
3.3 PNS传入回路破坏导致心律失常
我们的数据表明，PNS神经回路的破坏是Dst突变小鼠心律失常的基础。然而，尚不清楚心率失调涉及传入还是传出回路的异常。为了解决这个问题，我们接下来使用Vglut2-Cre小鼠选择性失活感觉神经元中的Dst表达，因为Vglut2-Cre介导的重组发生在感觉神经元中，但不在PNS的交感神经节神经元中（Niu et al., 2020）。尽管Avil被认为由PNS神经元特异性表达（Hunter et al., 2018），但囊泡谷氨酸转运蛋白2（Vglut2）在中枢神经系统（CNS）的谷氨酸能神经元中广泛表达（Kaneko and Fujiyama, 2002）。因此，我们专门比较了使用CUBIC进行组织透明化后Avil-Cre；Ai14和Vglut2-Cre；Ai14小鼠全脑和脊髓中Cre介导的重组区域（补充图6）。在Avil-Cre；Ai14的脑和脊髓中，tdTomato信号定位于源自DRG和三叉神经节感觉神经元的轴突轨迹。相比之下，在Vglut2-Cre；Ai14中，tdTomato阳性细胞分布于脊髓灰质，并且整个大脑皮层观察到tdTomato信号，而PNS感觉神经元不直接投射到该区域。这些观察证实了Avil-Cre对PNS神经元的特异性，而Vglut2-Cre在CNS和PNS神经元中均有活性。在Vglut2-Cre；Ai14小鼠的PNS中，tdTomato在DRG感觉神经元（图1A）和迷走神经节（图1B）中表达，但不在SCG的交感神经节神经元中表达（图1C）。在SCG中，仅在神经纤维中检测到tdTomato。这些数据表明，在Vglut2-Cre小鼠中，Cre介导的重组发生在PNS传入回路中，但不在PNS传出回路中，符合预期。定性组织学分析显示，在Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠的DRG和迷走神经节感觉神经元中诱导了神经损伤标志物ATF3和Sprr1a，而SCG的交感神经节神经元中几乎不表达这些标志物（图5）。这些发现表明，在Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠中，PNS传入回路被选择性破坏，而PNS传出回路未受影响。
最后，我们记录了11-13月龄Vglut2-Cre；Dst cGT和Ctrl小鼠的ECG。与Avil-Cre；Dst cGT小鼠类似，一些Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠在转换至维持麻醉后立即表现出升高的HRV（图6A）。统计学上，Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠表现出轻度但显著的HRV增加（基因型效应，F(1,51)=7.47，p<0.01；时段效应，F(2,51)=4.87，p<0.05；基因型×时段交互作用，F(2,51)=0.58，p>0.05，双因素ANOVA）和不规则脉搏频率增加（基因型效应，F(1,51)=10.05，p<0.01；时段效应，F(2,51)=1.69，p>0.05；基因型×时段交互作用，F(2,51)=1.69，p>0.05，双因素ANOVA），以及与Ctrl小鼠相比PR间期显著缩短（基因型效应，F(1,51)=5.63，p<0.05；时段效应，F(2,51)=3.05，p>0.05；基因型×时段交互作用，F(2,51)=2.04，p>0.05，双因素ANOVA）（图6B）。Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠的QRS复合波保持不变（图6B）。此外，与Avil-Cre品系不同，Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠在RR（基因型效应，F(1,51)=13.78，p<0.001；时段效应，F(2,51)=3.78，p<0.05；基因型×时段交互作用，F(2,51)=0.37，p>0.05，双因素ANOVA）和QT间期（基因型效应，F(1,51)=4.57，p<0.05；时段效应，F(2,51)=0.07，p>0.05；基因型×时段交互作用，F(2,51)=0.45，p>0.05，双因素ANOVA）方面表现出显著改变（图6B）。这些数据表明，Vglut2-Cre介导的Dst缺陷也导致节律不稳定和传导改变。对心室去极化和复极化的具体影响不同于Avil-Cre；Dst cGT小鼠中观察到的。由于已知异氟烷影响自主神经系统（Kato et al., 1992），我们研究了在清醒状态下是否发生心脏节律不稳定（补充图7）。我们发现三只Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠中有一只表现出清醒状态下的节律不规律。这些结果支持了这样的观点：PNS传入回路的破坏，而非交感神经节神经元的退化，是心率失调的主要贡献因素。
4 讨论
PNS传入和传出回路破坏在心脏失调中的意义
HSAN是一组复杂的遗传性疾病，主要影响感觉和自主神经系统。HSAN患者表现出多模态躯体感觉障碍，包括触觉、痛觉和本体感觉缺陷。虽然躯体感觉功能障碍已被广泛研究，但内脏功能障碍的病理生理学仍相对未被探索。一般认为，自主神经系统失调会损害内脏功能，导致一系列临床表现，如心律失常、体位性低血压和胃肠动力障碍（Sakae et al., 2001；Thireau et al., 2017）。最近使用动物模型的研究进一步阐明了自主神经功能障碍与心脏异常之间的复杂关系。例如，Meis1缺陷小鼠表现出交感神经节神经元发育异常和HRV增加，提示交感神经功能障碍与心脏不规则性的关联（Bouilloux et al., 2016）。
使用Elp1突变小鼠（家族性自主神经功能障碍（FD；HSAN-III）模型）研究了内脏功能障碍的复杂机制。在感觉和交感神经节神经元中条件性缺失Elp1基因导致靶组织神经支配受损，支持了感觉和自主神经回路发育异常是内脏功能障碍基本机制的观点（Jackson et al., 2014）。胃肠系统受迷走神经、交感神经节和背根神经节的外源性神经支配以及内在的肠神经系统共同调节（Sharkey and Mawe, 2023）。从PNS神经元条件性缺失Elp1会破坏肠神经系统的正常形成以及肠道黏膜和平滑肌的靶神经支配（Chaverra et al., 2024）。此类异常会扰乱肠上皮屏障，并且可能是FD患者胃肠动力障碍的基础。总之，这些动物研究强调了HSAN中导致内脏功能障碍的多样且复杂的神经回路机制。
作为HSAN-VI的模型，Dst突变小鼠也被用于探索胃肠功能障碍的机制（Lynch-Godrei et al., 2020）。Dst突变体表现出胃肠动力减慢和结肠黏液层变薄，尽管肠神经系统结构似乎保存完好。相反，Dst突变体表现出迷走神经和迷走神经节神经退行性变的证据，而交感神经节几乎没有退化（Lynch-Godrei et al., 2020），提示副交感神经控制受损导致HSAN-VI的胃肠功能障碍。然而，内脏传入回路异常的作用仍不清楚。在本研究中，我们证明了PNS神经元选择性消融Dst基因（Avil-Cre；Dst cGT）诱导了DRG和迷走神经节感觉神经元以及SCG交感神经节神经元中神经损伤标志物ATF3和Sprr1a的上调。与先前发现一致（Lynch-Godrei et al., 2020），迷走神经节感觉神经元的神经退行性变迹象比SCG交感神经节神经元更明显。Avil-Cre；Dst cGT小鼠表现出以HRV增加为特征的心律失常。值得注意的是，在Vglut2-Cre；Dst cGT小鼠中观察到较轻微但类似的HRV升高和不规则脉搏，其中退化仅限于PNS感觉神经元，而交感神经节神经元保持完整。这表明HRV增加主要由PNS感觉神经元退化驱动。相比之下，两个模型之间心室去极化和复极化的差异可能源于其他区域（包括CNS）的不同重组，而非单纯的感觉回路。此外，虽然Vglut2-Cre不直接诱导自主神经元内的重组（Chang et al., 2015），但它可能间接调节自主神经系统，因为已知Vglut2阳性中间神经元在脊髓损伤后调节交感神经系统的结构和功能可塑性（Noble et al., 2022）。这些条件性基因靶向策略支持了以下概念：PNS感觉神经元的退化导致内脏传入回路紊乱，并且随后通过扰乱内脏传入和传出回路之间的相互作用导致心脏节律失调。然而，应注意，这些特定区域神经退行性变与心律失常发作之间观察到的关系仍然是相关性的，且在目前框架内建立确定的因果联系存在技术局限性。近年来，病毒载体和光遗传学的使用允许精确绘制参与心率控制的外周神经回路（Rajendran et al., 2019）。在未来的研究中，更局部和时空调控Dst表达将阐明感觉回路破坏与心律失常发生之间的直接因果联系。此外，已知异氟烷麻醉会破坏自主神经系统平衡（Kato et al., 1992）。虽然清醒状态下心律失常的发生表明自主神经功能障碍和节律紊乱并不总是同时出现，但异氟烷麻醉下这些事件频率显著增加表明Dst突变小鼠对自主神经应激源的易感性增强。这种增加的易感性可能反映了受损的稳态恢复能力，突显了感觉回路在维持内脏稳态中的关键作用。
4.1 PNS传入通过多重反馈回路控制心率
内脏感觉通常归因于迷走神经节中的感觉神经元（Waise et al., 2018；Ichiki et al., 2022；Prescott and Liberles, 2022）。最近的光遗传学和病毒示踪研究表明，通过迷走神经传递的传入信号通过CNS通路增强副交感神经张力并抑制心脏的交感神经活动（Rajendran et al., 2019）。相比之下，其他研究已鉴定出DRG中的原肌球蛋白受体激酶C（TrkC）阳性感觉神经元通过交感神经系统通路调节血压和心率（Morelli et al., 2021）。总之，这些发现表明，PNS感觉神经元通过涉及自主神经系统的多重反馈回路控制心血管功能。在本研究中，感觉神经元选择性丧失Dst导致迷走神经节和DRG感觉神经元严重退化，提示通过这些不同途径的内脏反馈回路同时中断。DRG神经元仅源自神经嵴，而迷走神经节由神经嵴细胞和外胚层基板组合而成。这种双重发育起源可能导致HSAN中内脏感觉缺陷的病理异质性。阐明这些发育差异如何影响感觉神经元群体差异易感性的方式，将是未来研究的重要方向。
4.2 HSAN内脏功能障碍的发病机制
HSAN内脏功能障碍的病理生理学，包括心血管反射异常、胃肠功能障碍和呼吸衰竭，是多因素的，涉及多个器官之间的复杂相互作用。Dst基因编码组织选择性异构体DST-a、DST-b和DST-e，分别主要在神经、肌肉和皮肤组织中表达（Künzli et al., 2016）。这些Dst异构体在维持组织稳态中发挥关键作用（Yoshioka, 2024）。我们最初对Dst-b突变小鼠的分析预测了肌肉病理的存在（Yoshioka et al., 2022），随后鉴定出与DST-b突变相关的先天性肌病和心肌病患者（Jacob et al., 2025）。Dst-b突变诱导蛋白聚集形成，伴有与UPR相关的伴侣蛋白积累。因此，Dst-b突变小鼠表现出心律失常，包括QT间期延长和伴有蛋白聚集性心肌病的早搏（Yoshioka et al., 2022）。相比之下，PNS神经元选择性Dst cGT小鼠（Avil-Cre；Dst cGT和Vglut2-Cre；Dst cGT）表现出窦性心律失常，而无蛋白聚集形成。虽然Avil-Cre；Dst cGT小鼠与Dst-b突变小鼠相比表现出较轻的心肌细胞损伤，但轻度纤维化的存在表明PNS可能有助于维持心肌细胞。因此，外周神经功能障碍介导心肌损伤的机制仍然是未来研究的重要课题。这些发现表明，DST突变可通过多种机制引起心律失常，包括心肌细胞内在功能障碍和调节心脏功能的神经回路破坏。呼吸衰竭也被报道为严重HSAN-VI患者幼年死亡的原因（Edvardson et al., 2012；Ahmad et al., 2025）。值得注意的是，迷走神经节包含投射到心血管和呼吸系统的感觉神经元，可能介导呼吸与心率之间的协调（Devarajan et al., 2022）。鉴于已确定的心脏心律失常与呼吸控制之间的关联，在HSAN心律失常的病理生理机制中应考虑这种相互作用。综合这些发现，有必要从整合致病基因、神经回路和多器官相互作用角色的综合视角来阐明HSAN的内脏功能障碍。
声明
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，无不当保留。
伦理声明
动物研究经新潟大学内部审查委员会批准。研究按照当地法规和机构要求进行。已获得动物所有者对其动物参与本研究的书面知情同意。
作者贡献
NY：概念化、资金获取、研究、项目管理、可视化、撰写初稿、数据整理、撰写审阅与编辑。MK：研究、概念化、数据整理、资金获取、方法论、可视化、撰写初稿、撰写审阅与编辑。KT：研究、方法论、撰写审阅与编辑。TI：研究、撰写审阅与编辑。YT：资源、撰写审阅与编辑。HF：资源、撰写审阅与编辑。MU：资源、撰写审阅与编辑。HO：监督、撰写审阅与编辑。IK：监督、撰写审阅与编辑。HT：监督、撰写审阅与编辑、概念化、资金获取、方法论、资源。
资金
作者声明获得了对本工作及其出版的经济支持。本项目由JSPS资助（20K15912和23K06317给NY，21K10169和25K13088给MK，15H04667、18H02592和21H02652给HT），创新领域科学研究基金“非线性神经振荡学”（18H04939给HT），Nakatani基金会（NY），Nippon Shinyaku研究基金（NY），SENSHIN医学研究基金会（NY），Nagai感知科学促进基金会（NY和HT），UNION TOOL奖学金基金会（NY），武田科学基金会（NY），Mochida纪念医学与药学研究基金会（NY），Kato纪念生物科学基金会（NY），新潟大学跨学科研究基金（NY），上原纪念基金会（HT），以及新潟大学脑研究所跨学科联合研究项目基金（HT）。
致谢
我们感谢Fan Wang、Hiroshi Hasegawa和RIKEN BRC提供Avil-Cre小鼠。此外，感谢Masao Horie、Norihisa Bizen和Masato Yano的讨论，Haruna Sato、Yuya Imada、Yukiko Mori、Yumi Kobayashi、Seiji Takahashi、Koki Nakajima和Yuuki Ohshiro的技术协助。
利益冲突声明
作者声明本工作是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
作者HF和MU声明，在提交时他们是Frontiers的编辑委员会成员。这对同行评审过程和最终决定没有影响。
生成式AI声明
作者声明在创建本手稿时未使用生成式AI。
本文中附图的任何替代文本均由Frontiers在人工智能的支持下生成，并已尽合理努力确保准确性，包括尽可能由作者审阅。如果您发现任何问题，请与我们联系。
出版商注
本文中表达的所有主张仅代表作者本人，不一定代表其所属组织、出版商、编辑和审稿人的主张。本文中可能评估的任何产品或其制造商可能提出的任何主张，均未得到出版商的保证或认可。
补充材料
本文的补充材料可在以下网址在线获取：[链接已删除]
参考文献
[此处省略了完整的参考文献列表，共51条，均已在原文中列出]
=====
【全文结束】