疟疾仍然是一个主要的全球健康挑战，尤其是在撒哈拉以南非洲地区，恶性疟原虫对一线抗疟疗法的耐药性日益增强。CRISPR-Cas9作为一种突破性的基因组编辑工具，已成为生物医学研究中的变革力量，为耐药性的遗传机制提供了宝贵的见解。本综述全面概述了CRISPR-Cas9系统，包括其起源、演变及其在抗疟药物耐药性研究中的应用，特别关注非洲的研究。我们探讨了CRISPR在阐明耐药途径、验证分子标记和增强诊断策略中的作用。此外，一项系统的范围综述突出了在非洲进行的CRISPR相关疟疾研究的地理范围和重点。观察到应用和采纳率极低。尽管存在技术和监管障碍，CRISPR在加速抗疟药物发现和推进精准医疗方面仍具有巨大潜力。其在疟疾流行地区的战略应用可显著加强疾病控制乃至最终消除的努力。
1. 引言
疟疾是一种原生动物寄生虫病，尽管在化疗、诊断和媒介控制方法方面取得了最新进展，但它仍然是一个严重的全球健康问题。[1] 2023年，恶性疟原虫感染估计导致2.63亿例病例和59.7万例死亡；其中超过27%的全球负担在尼日利亚。[2] 寄生虫对抗疟药物耐药性的出现仍然是控制疟疾流行的主要挑战。[3] 恶性疟原虫表现出显著的遗传多态性，导致菌株分层，其中一些有助于化学耐药性。[4] 为应对恶性疟原虫对氯喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶等关键抗疟药物的耐药性日益增强，世界卫生组织（WHO）于2001年建议用青蒿素联合疗法（ACTs）替代单一疗法治疗无并发症疟疾。在所有感染人类的疟原虫物种中，恶性疟原虫在WHO定义的非洲流行区仍然是毒性最强、分布最广的。这种寄生虫可以进行基因改造，使研究人员能够研究基因的功能作用，最终有助于确定潜在的疫苗候选物和治疗靶点。[5] 在生物体基因组中插入、删除或编辑基因的能力对于产生有意义的生物学见解至关重要。[6]
随着更高效、更精确的基因组编辑技术的出现，关于恶性疟原虫的基因组学研究取得了显著进展。[7] 锌指核酸酶（ZFNs）等工具已实现靶向基因组修饰。[8] 然而，由于成本高、脱靶效应以及可靶向位点范围狭窄，其使用受到限制。类似地，转录激活因子样效应物核酸酶已显示出在多种生物中进行基因组编辑的潜力，[9,10]但由于类似的限制，它们尚未有效应用于疟原虫。相比之下，CRISPR-Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列和CRISPR相关[Cas9]内切核酸酶介导的基因组编辑平台）提供了一种更直接、更易获得的基因组编辑方法。[11] 该系统已成功用于修改多种生物的基因组，包括恶性疟原虫，促进了用于关键基因功能特征分析转基因品系的开发。[12,13] 本综述的动机是尼日利亚疟疾基因组学研究和培训中心正在进行的努力，该中心正在应用CRISPR-Cas9技术进行抗疟药物耐药性的功能基因组学研究。在此，我们概述了CRISPR-Cas9如何在恶性疟原虫的体外研究中应用，重点是药物耐药性，并强调了该技术在非洲面临的挑战和机遇。
2. CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas是大多数细菌和古细菌中发现的一种适应性免疫系统，能够抵御噬菌体入侵。[14] 该系统由重复-间隔序列阵列组成，这些阵列是DNA片段，由重复序列与独特的间隔序列交替排列而成，以及一组编码Cas蛋白的Cas基因，这些蛋白具有内切核酸酶活性。[15] 这些阵列被转录成CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），它们引导Cas蛋白到达其靶点（此处省略具体描述，后续内容包含更多细节，但基于原文段落，我们翻译了此句）。
3. CRISPR-Cas9修复途径
当DNA发生双链断裂（DSB）时，无论是自然发生还是由于CRISPR-Cas9等基因组编辑工具引起，细胞都会通过启动修复过程来维持基因组稳定性。[27] 介导这种修复的两种主要途径是同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）[28]（图2）。[44] 每种途径依赖于不同的机制，并为修复结果引入不同的可能性，特别是在用于基因组编辑时。[29]
HDR涉及使用一个DNA模板来精确修复断裂，实现指定的序列改变或插入。
4. CRISPR-Cas9在疟疾研究中的应用
CRISPR-Cas9已成为生物医学研究的基石，广泛用于研究基因功能、开发遗传病疗法以及创建转基因生物。[45,46] 除了在疟疾中的应用，该技术已应用于癌症、[47,48,49] 镰状细胞病、[50,51,52] 亨廷顿病、[53,54] 杜氏肌营养不良症、[55,56] 和SARS-CoV-2[57,58]等疾病。
在疟疾研究中，CRISPR-Cas9实现了对恶性疟原虫的精确遗传修饰，使得研究人员能够研究耐药性相关基因，如kelch13（K13），该基因与青蒿素耐药性有关。
5. 抗疟药物耐药性
由于有效的疫苗候选物仍在开发中且尚未广泛可用，抗疟药物仍然是管理疟疾病例的主要策略。[63] 然而，耐药菌株的出现和传播对抗疟药物的疗效构成了重大威胁。[64] 抗疟药物耐药性的特点是寄生虫在暴露于相当于或高于推荐治疗剂量的药物时仍能存活和增殖的能力。
6. 耐药性疟疾的挑战与创新需求
抗疟药物耐药性的出现、传播和加剧源于多种因素，其中许多因素仍然未知。[73] 各种促成因素跨越多个领域，包括人类行为、媒介和寄生虫生物学、药代动力学以及社会经济条件。[74] 这些重叠的变量使得抗疟药物耐药性领域高度动态和复杂；因此，完全理解和减轻这一现象具有挑战性。[75] 不完整的治疗...
7. 利用CRISPR-Cas9在其他地区进行抗疟药物耐药性研究中的疟原虫遗传操作
开发更有效的功能基因组学工具对于全面了解恶性疟原虫的发病机制和药物耐药性至关重要，因为对该寄生虫的遗传操作仍然极其困难。[83] 耐药性机制的分子见解和分子耐药性的鉴定使得耐药标记的检测和验证以及抗疟药物功能的理解成为可能。[84] CRISPR-Cas9的出现...
8. 在非洲进行的CRISPR-Cas9抗疟药物耐药性研究的系统范围综述
如图4所示，从PubMed最初确定的266篇文章中，有41篇符合我们的纳入标准；然而，只有2项研究[79,93]是在非洲进行的。表2总结了这两篇文章的关键特征。
9. 结论与未来展望
CRISPR-Cas9基因组编辑系统代表了全球抗击耐药性疟疾斗争中的关键进展。它提供对耐药机制的精确遗传见解的能力使得能够识别新的治疗靶点，并加深了我们对恶性疟原虫生物学的理解。虽然技术、监管和伦理挑战仍然存在，但将CRISPR技术与高通量基因组学和蛋白质组学相结合，为在...
致谢
O.A. 感谢非洲研究卓越基金（AREF）的研究发展基金和种子基金（AREF-325-OLUS-S-C0969）的支持。我们感谢费城德雷塞尔大学医学院分子寄生虫学中心的Akhil Vaidya教授和Hangjun Ke博士在此项工作中提供的巨大支持和帮助。本综述不需要伦理批准。
作者贡献
O.A. 构思了想法，撰写了初稿，审阅了稿件并提交；I.S.D. 撰写了初稿并审阅了稿件；H.M. 审阅了稿件；I.C.N. 提供了技术意见并审阅了稿件；E.O. 提供了技术意见并审阅了稿件；A.A.-N. 审阅了稿件草稿并监督了整个流程。所有作者均批准了稿件发表。
利益声明
作者声明没有竞争性利益。
【全文结束】