摘要
心血管疾病（CVD）仍然是全球性的重大健康挑战。亟需疾病起始和进展的早期标志物。我们及他人此前已显示，肠道微生物组的变化与代谢和CVD相关。在此，我们证明，与心脏和肾脏功能的亚临床变异相关的肠道微生物组变化可以被检测到。与肠道微生物芳香氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）代谢相关的标志物，与循环中前心房利钠肽（proANP）和估算肾小球滤过率（eGFR）在代谢健康的欧洲人群中相关联。观察性和遗传学证据进一步将微生物组相关代谢物识别为这一肠道微生物组-肾脏轴的中介，其基线水平与一个加拿大外部人群的偶发性CVD相关。总体而言，我们的工作表明，肠道微生物组与心肾轴相互作用，并参与影响宿主生理和CVD风险的器官间串扰。
引言
代谢失调是指体内代谢过程调控异常，导致营养物质处理和能量产生或利用失衡，常被视为代谢健康-疾病连续体的中间阶段。代谢失调状态常表现为超重、血脂异常、高血压或前驱糖尿病等一种或多种状况，这些被认为是心脏代谢疾病（CMD）（包括肥胖和2型糖尿病：T2D）和CVD的危险因素。CVD是全球死亡和残疾的主要原因[1]，其患病率持续上升，预计将保持这一趋势[2]，除非能够针对潜在的代谢失调进行干预，从而预测到2050年全球疾病负担减少13.3%[2]。
肠道微生物组是代谢的关键调控者，多项研究将其与代谢健康[3,4,5]和CVD[6,7]联系起来。这些研究依赖于大型人群队列[4]和对常见混杂因素的仔细考量，揭示了微生物组-宿主表型[5]或疾病特征[6,7]之间的关系，增加了信心。虽然对“健康”微生物组的描述仍在审查中[8]，但近期研究表明，肠道微生物组在代谢失调期间发生显著变化[6,7]，其中一些变化在CVD期间持续存在[6]。这些观察表明，肠道微生物组在疾病发展的早期阶段和疾病轨迹的维持中均发挥关键作用，从而凸显了其在预防、早期诊断和/或治疗代谢失调、CMD和CVD方面的未开发潜力。
然而，代谢失调可能代表CVD的一个漫长且代谢异质的阶段，因此支撑疾病起始或进展的生理变异可能来自多种机制。重要的是，肾脏功能作为一个内源性因素已被确定为健康人群中肠道微生物组变异的关键贡献者[5,9,10]，而CKD晚期阶段的肾功能受损与肠道菌群失调有关[11]。反过来，异常的肠道微生物群与肾脏疾病进展之间的因果关系也在人类中得到提示[12]，突出了潜在的肠道微生物组-肾脏轴。值得注意的是，肾功能和CVD也紧密相关，以至于即使在正常范围内轻度至中度的肾功能下降也与CVD死亡率升高高达2倍独立相关[13]，而CKD是心力衰竭患者中高达60%的常见合并症[14]。这种相互关系，常被称为心肾或肾心综合征，提示预防肾脏损害也可降低晚期疾病环境中相关的心血管发病率和死亡率[15]。然而，肾脏-心脏相互作用及其与肠道微生物组的相互作用是否在疾病起始或心血管病理生理学的早期阶段发挥作用仍未知。
在此，利用血浆代谢组学和定量肠道微生物组分析[16]，结合对MetaCardis研究[6,17,18,19]中代谢健康对照者（n=275）的广泛混杂因素控制，我们识别出与eGFR和血浆proANP水平相关的肠道微生物标志物，揭示了肠道微生物组-肾脏-心脏轴（图1）。简而言之，该轴(i)涉及肠道微生物代谢物和宿主共代谢物，源自苯丙氨酸和酪氨酸代谢；(ii)得到遗传学证据的支持，表明肠道微生物组与宿主肾功能之间存在相互作用，其功能关联在MetaCardis的CMD病例（n=1602）中耗竭；以及(iii)与加拿大老龄化纵向研究（CLSA）参与者（n=8,669）的未来CVD发病率相关。我们的观察揭示了一种通过血浆代谢物在肠道微生物组及其宿主之间的相互作用，这些代谢物可能参与CMD的起始和进展。重要的是，我们在健康组内识别了这些变异，暗示了朝向代谢失调和CMD的轨迹，这为精准预防开辟了前景。
结果
代谢健康个体的肠道微生物和生理特征
为了揭示代谢健康-疾病连续体早期阶段的表型组（即临床和人体测量）、血浆代谢组和肠道微生物组变异，我们聚焦于MetaCardis[6,17,18,19]研究中275名代谢健康个体（即BMI ≤ 25 kg/m²、无代谢综合征、无T2D、无缺血性心脏病IHD），相对于患有CMD（即存在代谢综合征、肥胖、T2D和/或IHD；n=1602）的个体。这些个体年龄在20至76岁之间（中位年龄=58岁），62%为女性，招募自德国、法国和丹麦（补充数据1）。预期地，健康个体中与代谢健康相关的变量，如体脂分布、脂质代谢、葡萄糖代谢、血压、肝肾功能的中位值保持在正常范围内（补充数据1）。然而，这些个体中有22.5%血压升高，26.2%为前驱糖尿病，2-8%因高血压等状况接受药物或服用质子泵抑制剂（补充数据1）。该组中血压、血糖和脂质代谢的潜在变异可能表明其生理状态正在从健康状态向代谢失调转变，尽管他们无代谢疾病状态。大多数反映生态或功能方面的肠道微生物组特征——如微生物负荷[16]（即每克粪便中的微生物细胞数）、细菌基因丰富度[20]和细菌物种丰富度[21]——与先前健康个体的报告相当（补充图1）。此外，我们在这些个体中观察到失调的Bacteroides 2肠型[22]的低流行率（仅8人，流行率2.9%），该肠型此前与肥胖[18]、一般性代谢失调和IHD[6]相关。与先前报告一致[18]，我们健康个体中具有Bacteroides 2肠型的个体也表现出显著较低的微生物基因和宏基因组物种丰富度（补充图1）。这些人中大多数（84%）还表示定期排便，这与Bacteroides 2肠型的流行率负相关[16]（FDR<0.1）。此外，每日排便频率<1/2与更高的微生物负荷相关（FDR<0.1），这与先前报告一致[16,23]（补充图2a）。
人口统计学是代谢健康个体中关键的微生物组协变量
我们研究了宿主因素对健康参与者肠道微生物组组成和功能个体间变异的潜在影响（分别基于属、宏基因组物种MGS、肠道代谢模块GMM和京都基因与基因组百科全书KEGG通路的Bray-Curtis相异距离）。分析覆盖了144个可用协变量，包括人口统计学（即年龄、性别和国家）、饮食（即食物组和营养素摄入、总卡路里摄入以及关键饮食评分，包括替代健康饮食指数aHEI、终止高血压饮食法DASH和饮食多样性评分DDS）、其他状况（即过敏、阑尾切除术、更年期、痛风和阻塞性睡眠呼吸暂停）、药物、以及表型组和粪便相关变量。
与先前报告一致[9,10,24,25]，宿主变量如人口统计学、饮食（即酸奶、胆碱和叶酸摄入）、消化性腹胀、排便频率和既往抗生素使用与健康个体中微生物组的组成和功能变异相关（P_univariate_adonis < 0.05；补充数据2），其中人口统计学（图2a）和内脏脂肪质量与宏基因组物种变异在FDR_univariate_adonis < 0.1时仍相关（补充数据2）。人口统计学在单变量分析中仍然是宿主微生物组（即分类群和功能）、代谢组和表型组变量的一致协变量（补充图2、3，补充数据3），其中年龄、性别（包括更年期状态）和参与者招募国家在不同分类水平上影响肠道微生物组（补充图4、5、6）。因此，我们在分析中纳入了对人口统计学的校正，并使用metadeconfoundR[6,17]根据需要对个体微生物组-表型组关联进行了额外的混杂因素测试和控制。
代谢健康个体中肠道微生物组与循环proANP水平的关联
为了评估健康个体中向代谢失调转变的健康生理状态（由血流动力学变异强调）的肠道微生物相关因素，我们采用了人口统计学校正的单变量和多变量微生物组-表型组关联分析。值得注意的是，血浆肌酐和pro-ANP浓度是顶级的临床变量，它们由多变量协变量校正偏最小二乘（CA-PLS）[26]模型（基于肠道微生物组组成和功能，即MGS、GMM和KEGG通路）解释（R²_Yhat = 0.26-0.48）和预测（Q²_Yhat = 0.08-0.12）（补充数据4）。
类似地，除了复制先前[20,27]的观察，如Roseburia[27]和Ruminococcaceae属的较低丰度与较高糖化血红蛋白水平相关（FDR<0.1，补充图7b），多个肠道微生物特征也与这些个体中的肾脏和心脏功能相关（图2，和补充图7）。例如，粪便微生物负荷（图2b）以及微生物组的糖酵解、蛋白质水解和脂解发酵潜力与更高血浆proANP浓度相关（FDR<0.1，补充图7a），而较低Ruminococcus和较高Rothia属丰度与较低eGFR水平相关（FDR<0.1，补充图7b）。此外，较低物种丰富度和Bifidobacterium丰度与较高循环钠水平相关，而Anaerotruncus和Pseudomonas的较高丰度与这些个体中更高循环钠水平相关（FDR<0.1，补充图7a,b）。值得注意的是，Bifidobacterium、Anaerotruncus、Ruminococcus和Roseburia（多为短链脂肪酸SCFA产生菌）丰度的改变已被报道与CKD相关[28]。
有趣的是，血浆proANP浓度也是唯一一个在健康个体中与多种GMM（116个中的78个）和KEGG通路（217个中的168个）呈正相关的临床变量（FDR<0.1，补充图7d,e，补充数据5）。值得注意的是，这些与proANP相关的肠道微生物功能包括多个与微生物芳香氨基酸代谢相关的GMM（例如酪氨酸降解II；肉桂酸转化）和KEGG通路（例如苯丙氨酸代谢；酪氨酸代谢；苯丙烷生物合成；芳香化合物降解）（图2c,d）。
粪便微生物负荷最近被证明是肠道微生物组变异的关键决定因素和微生物组-疾病关联的混杂因素[29]。由于我们的微生物组特征是定量的（即数据已针对微生物负荷校正），且循环proANP水平与微生物负荷呈正相关（图2b），我们接下来测试了proANP-i>微生物组-心肾变量关联是否由粪便微生物负荷驱动。所有proANP-GMM和proANP-KEGG通路的关联均可通过微生物负荷调整而减少（图2c,d，补充数据6），这强调了定量微生物组分析在微生物组研究中的价值。然而，在这些168个KEGG通路中，有7个在测试它们是否介导了微生物负荷与循环proANP水平之间的关系时，显示出显著的平均因果中介效应（ACME）（FDR_ACME < 0.1，补充数据7和8）。这7个通路主要包括与微生物氨基酸代谢相关的术语（例如，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；氨基酸的生物合成；补充数据8）。
正如预期，血浆proANP水平也与血浆肌酐水平和收缩压呈正相关，与内脏脂肪评级和总脂肪量呈负相关（补充图8a）。此外，在代谢健康组内，高血压个体的血浆proANP水平显著高于血压正常的个体，前驱糖尿病个体的proANP水平也显著高于血糖正常个体（补充图8b,c）。然而，这7个血浆proANP-KEGG通路均不受参与者高血压或前驱糖尿病状态的混杂影响（补充图8d）。
总之，单变量和多变量分析都强调了肠道微生物组及其功能特征（尤其是与微生物氨基酸代谢相关的特征）与健康个体中循环proANP水平之间的关联。
代谢健康个体中与proANP相关的微生物芳香氨基酸代谢循环化合物
为了识别参与肠道微生物组-proANP轴的循环代谢物，我们再次使用了人口统计学校正的单变量和多变量方法。对循环proANP水平的血浆代谢组范围关联（即1484种代谢物）揭示了四种与血浆proANP呈正相关的代谢物：N2,N2-二甲基鸟苷、苹果酸、富马酸和香草乳酸（FDR < 0.1；补充数据9）。N2,N2-二甲基鸟苷是一种嘌呤核苷，而苹果酸和富马酸是三羧酸循环的中间体，香草乳酸是一种推测来自芳香氨基酸酪氨酸的微生物代谢物。这些代谢物的循环水平也随着肾功能恶化而增加（即与肌酐呈正相关，与eGFR呈负相关）（FDR < 0.1；图3a），表明proANP的代谢组学特征与这些个体的肾脏-心脏轴密切相关。
然后，我们使用多变量CA-PLS模型，以肠道微生物组特征（即MGS、GMM和KEGG通路）为预测因子，解释和预测个体代谢物，同时控制人口统计学。再次，几种源自苯丙氨酸和酪氨酸代谢的血浆代谢物是顶级微生物组预测的候选者（图3b,c，和补充数据10）。如上所述，微生物KEGG通路“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成”也是连接微生物负荷与循环proANP水平的关键中介（图2d，和补充数据8），总体表明在健康个体中，肾脏和心脏功能的替代指标与微生物对苯丙氨酸和酪氨酸的代谢之间存在联系。
代谢健康个体中微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢与心肾变量的关联
为了进一步阐明微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢在肾脏-心脏生理学中的作用，我们聚焦于该途径中顶级的血浆代谢物（即被微生物分类和功能特征良好解释和预测的代谢物）（图3b），其中包括图3c中强调的11种微生物代谢物和相关宿主共代谢物。其中许多代谢物，如苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、3-(4-羟基苯基)乳酸和酚硫酸，此前已被发现与CVD[13]、心力衰竭[30]、代谢功能障碍相关脂肪性肝病[31,32]和糖尿病肾病[33]相关，并被认为是尿毒症毒素[34]。相比之下，低血浆3-苯基丙酸盐水平最近被确定为非传染性多病症的关键标志物[35]。
这些代谢物之间高度相关（FDR < 0.1，补充图9a），并在健康个体中与临床和肠道微生物组变量表现出广泛的关联（补充图9b-d, 10）。多种代谢物，包括酚硫酸、3-(4-羟基苯基)乳酸、香草乳酸和肉桂酰甘氨酸，与胰岛素和葡萄糖代谢标志物（如C肽、糖化血红蛋白、空腹胰岛素和游离脂肪酸）的循环水平升高相关（FDR < 0.1，补充图9b）。其他代谢物，包括酚硫酸和香草乳酸，与较高的空腹甘油三酯和肝脏γ-谷氨酰转移酶（分别为脂质代谢和炎症的标志物）相关（FDR < 0.1，补充图9b）。苯乙酰谷氨酰胺、3-(4-羟基苯基)乳酸和香草乳酸进一步与低eGFR、高循环肌酐水平（FDR < 0.1，补充图9b）和/或更高的循环proANP水平相关。总之，这些代谢物捕捉了与脂质、胰岛素和葡萄糖代谢以及健康个体中肾脏-心脏功能标志物相关的变异。
为了确定这些代谢物是否也能捕捉线粒体功能的潜在变异，我们使用人口统计学校正的线性模型测试它们与常见循环标志物（如乳酸、丙酮酸、肌酸和乳酸与丙酮酸比率）的关联。值得注意的是，苯乙酰肉碱与较高的循环肌酸水平相关，而酚硫酸、3-(4-羟基苯基)乳酸和香草乳酸与较高的循环丙酮酸或乳酸水平相关（FDR < 0.1，补充图9c），然而，在健康个体中，没有线粒体功能相关的标志物与肾脏-心脏功能的替代指标相关联（FDR < 0.1，补充图9d）。
4-甲酚、苯乙酸及相关代谢物的血浆浓度也与更高基因和物种丰富度以及基于物种的α多样性相关（FDR < 0.1，补充图9e），与先前报告一致[36,37,38]，同时也在健康个体中与单个属、MGS、GMM和KEGG通路表现出广泛的关联，这些关联与proANP相关的特征重叠，尽管方向并非总是一致（补充图9f，和10a-c）。此外，苯乙酸、4-甲酚及相关的宿主共代谢物（包括苯乙酰谷氨酰胺）与微生物发酵潜力比率的关联模式表明，在这些个体中，蛋白水解潜力的上调是以糖酵解和脂解潜力为代价的（FDR < 0.1，补充图9e）。这些观察将微生物蛋白水解厌氧代谢和微生物氨基酸代谢与肾脏-心脏生理学联系起来。一致地，较高的微生物蛋白水解-脂解比率和加工肉类摄入与这些个体中较低的eGFR和较高的循环肌酐水平相关（FDR < 0.1，补充图9g）。
鉴于之前证据显示广泛的混杂（补充图2），我们接下来评估了微生物组-代谢物-肾脏-心脏变量关联是否受到健康个体中宿主变量的混杂，使用我们之前引入的metadeconfoundR方法[6,17]。在16,883个关联中，有1375个被证明对补充数据12中列出的宿主变量是解混杂的（图4a）。值得注意的是，血浆proANP与作为推测微生物代谢物的香草乳酸之间的关联是解混杂的（补充数据13）。同样，eGFR与香草乳酸、3-(4-羟基苯基)-乳酸、苯乙酰谷氨酰胺和Rothia属的负相关在健康个体中也是解混杂的（补充数据13）。
CMD个体中健康肠道微生物组-代谢物-肾脏-心脏关联的耗竭
为了确定我们是否识别了由肾脏-心脏功能变异驱动的CMD的稳定早期标志物，我们接下来在MetaCardis研究的代谢不健康个体中检查了这些解混杂的微生物组-代谢物-肾脏和心脏变量关联。该CMD人群（n=1602）包括患有代谢综合征、超重或肥胖（n=682）、T2D（n=552）和IHD（包括111例急性冠脉综合征、159例慢性IHD和98例因慢性IHD所致的心力衰竭）的参与者。正如预期，CMD组表现出代谢失调，与健康组相比，BMI更高、向心性肥胖更严重、血脂异常、血糖异常和肝酶升高（补充数据1）。然而有趣的是，即使在人口统计学校正后，两组之间的血浆proANP水平也没有显著差异（补充图11a）。
关键代谢物的循环水平在健康组和CMD组之间也存在显著差异，其中酚硫酸、苯乙酰肉碱和3-(4-羟基苯基)乳酸在CMD组中显著高于健康个体，而肉桂酰甘氨酸和3-苯基丙酸则显著降低（人口统计学校正ANCOVA，P < 2e-16；补充图11b）。有趣的是，这些代谢物也在CMD组中与肾脏和心脏相关变量（包括左心室射血分数LVEF）表现出广泛的关联，即使按疾病类别划分，关联随着CMD进展而加强（FDR < 0.1，补充图11c），突出了肾脏-心脏功能与疾病进展的相互关联性。
预期地，我们在健康组和CMD组中都注意到了eGFR与循环proANP水平[39]之间的负相关（P_healthy = 0.11, P_CMD = 1.26e-15），eGFR与LVEF之间的正相关（P_healthy = 0.48, P_CMD = 0.0014），以及循环proANP水平与LVEF之间的负相关（P_healthy = 0.93, P_CMD = 4.51e-15）；然而，仅在CMD个体中达到了统计学显著性（人口统计学校正线性模型；补充图11d）。
然后，我们在CMD组中检查了肠道微生物组特征、血浆代谢物和肾脏-心脏变量之间的解混杂关联。应用严格标准：1）FDR < 0.1具有统计显著性，2）对补充数据12中列出的协变量（包括CMD的附加药物）为解混杂状态，3）效应大小方向性与健康对照组一致，我们发现1375个关联中只有472个（图4a）在CMD组中复制，且负相关明显未复制（图4b，和补充数据13）。
在健康个体中，我们观察到肠道微生物组特征与苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、3-苯基丙酸盐、肉桂酰甘氨酸和苯乙酰肉碱，然后是4-甲酚葡萄糖苷酸、4-甲酚硫酸酯和4-甲酚之间密集的解混杂关联模式（图4a）。有趣的是，许多这些关联是逆关联，肠道微生物功能（即GMM和KEGG通路）与苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和苯乙酰肉碱呈显著逆关联。尽管我们的特征对整体肠道微生物组功能潜力的覆盖具有双向性和范围，但这些观察表明，健康个体中的肠道微生物组在功能上倾向于将这些潜在有害代谢物的循环水平维持在稳态范围内。相反，在CMD组中，大多数肠道微生物组特征与我们感兴趣的代谢物之间的逆关联明显丧失，这可能是由于利用了替代代谢途径、降低了代谢物水平的细菌受到竞争性排斥、增强了宿主-微生物相互作用以保留代谢物，或随着CMD发展微生物对饮食的适应。总之，我们观察到CMD组中合理有益的关联缺乏复制（图4b），这可能进一步表明CMD的发展可能与“健康”肠道微生物特征的丧失有关。这种耗竭的关键例子包括丁酸盐产生菌属Roseburia和Faecalibacterium以及相关的MGS粪便普拉梭菌、粪便罗斯氏菌和食葡糖罗斯氏菌的丰度，这些菌已知具有促进代谢健康的作用[40,41]，它们在健康个体中与苯乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酰肉碱、4-甲酚硫酸酯、4-甲酚葡萄糖苷酸和4-甲酚中的一种或全部呈负相关，而在CMD病例中不显著（补充数据13）。另一个SCFA产生菌属Dorea，在我们的健康个体中与香草乳酸呈负相关，并且在肾功能障碍患者中减少[42]，在CMD病例中也未复制。相比之下，在健康个体中与eGFR呈负相关，同时与苯乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-甲酚硫酸酯和4-甲酚葡萄糖苷酸呈正相关的Rothia属，在CMD病例中与苯乙酸的关联仍保留显著性（补充数据13）。这些发现表明，肠道微生物组通过关键代谢物与肾脏和心脏功能的相互作用在疾病发展过程中可能会改变。这与先前在以色列人群中观察到的与健康对照组相比，心肌梗死病例中整体耗竭的肠道微生物和代谢组学模式一致[7]。在同一研究中，一个与更高循环水平的苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和4-甲酚葡萄糖苷酸显著相关的肠道微生物基因组，在心肌梗死病例中也耗竭了[7]。
微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢物介导肠道微生物组-肾脏-心脏轴
为了阐明解混杂的肠道微生物组特征、血浆代谢物和肾脏-心脏变量关联之间可能的依赖关系，我们接下来在健康个体中对微生物组对eGFR（图5a）和血浆proANP（图5b）进行了中介分析。我们发现血浆肉桂酰甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-甲酚硫酸酯和香草乳酸是肠道微生物组-eGFR关联的中介（FDR_ACME < 0.1；图5a，和补充数据14），其中间接效应在肠道微生物组的所有水平（即生态学、组成和功能）都被注意到。例如，Dorea属通过降低循环香草乳酸水平与更高的eGFR相关，而Rothia属通过升高循环苯乙酰谷氨酰胺水平与更低的eGFR相关（补充数据14）。类似地，Faecalibacterium、Bacteroides和Roseburia（均为SCFA产生菌属）及相关物种粪便普拉梭菌、粪便罗斯氏菌和食葡糖罗斯氏菌通过降低循环苯乙酰谷氨酰胺和4-甲酚硫酸酯水平与更高eGFR相关。相比之下，先前报道在CKD中富集的多种梭菌属[2]以及Victivallis属通过升高循环肉桂酰甘氨酸水平与更低eGFR相关（补充数据14）。相反，肠道微生物组对循环proANP水平仅表现出直接效应（即平均直接效应ADE；FDR_ADE < 0.1，图5b，补充数据15）。
我们的分析揭示，更高的蛋白水解发酵倾向（相对于脂解和糖酵解发酵，即更高的蛋白水解-脂解比率和更低的糖酵解-蛋白水解比率），以及多种与苯丙氨酸和酪氨酸代谢相关的肠道微生物功能途径（即GMM和KEGG通路），通过升高循环苯乙酰谷氨酰胺、4-甲酚硫酸酯和肉桂酰甘氨酸水平与更低的eGFR相关（补充数据14）。一致地，在CKD患者中此前已有报告显示，更高的苯丙氨酸和酪氨酸代谢能力与更高的循环尿毒症毒素（即4-甲酚硫酸酯和苯乙酰谷氨酰胺）水平相关[12]。值得注意的是，这些微生物途径在健康个体中通过直接效应与更高的循环proANP水平相关（FDR_ADE < 0.1，图5b，和补充数据15），表明微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢在调节超出我们测试代谢物的循环proANP水平中发挥作用。总之，我们的中介分析明确了这些健康个体中肠道微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢与肾脏-心脏变量之间的依赖关系。
我们的血浆中介代谢物是众所周知的尿毒症毒素，表明它们也可能受到肾功能的调控。因此，我们接下来采用孟德尔随机化（MR）[43]作为工具变量方法，以解决1）我们的血浆代谢物与肾脏-心脏变量（即eGFR和proANP）之间的双向相互关系，以及2）使用遗传学证据对我们的观察进行三角验证。我们从CLSA[44,45]（n=7059-8029，补充数据16）、CKDGen联盟[46]（n=567,460）和deCODE研究[47]（n=35,559）分别推导出这些代谢物、eGFR和靶向循环利钠肽A（NPPA）的Somascan适配体的遗传工具。此外，我们使用了哮喘遗传学和环境流行病学研究（EGEA）[48]（n=1194）来推导循环4-甲酚水平的遗传工具（补充数据16）。
在我们最初的单变量逆方差加权（IVW）分析中，遗传预测的肉桂酰甘氨酸循环水平与遗传预测的eGFR水平呈负相关（FDR_IVW < 0.1，补充数据17），该结果在测试各种MR假设的额外方法中保持稳健。去除表现出显著异质性（由Cochrane's Q < 0.05和I²统计量≥ 25%衡量）的遗传工具进一步验证了遗传预测的肉桂酰甘氨酸水平与eGFR之间的负相关，同时额外识别了遗传预测的苯乙酰肉碱水平与eGFR之间的负相关（P_IVW-肉桂酰甘氨酸 = 0.007；P_IVW-苯乙酰肉碱 = 0.008；图5c；和补充数据17）。
接下来，我们测试了遗传预测的宿主肾功能对这些代谢物循环水平的影响。与我们的MetaCardis观察一致，遗传预测的eGFR水平与遗传预测的香草乳酸、3-(4-羟基苯基)乳酸、苯乙酰谷氨酰胺和4-甲酚硫酸酯呈负相关（FDR_IVW < 0.1，图5d，和补充数据18），这些发现在测试违反MR假设和工具异质性的额外敏感性分析中保持稳健。
对代谢物-NPPA相互关系的MR研究未得出任何显著结果（图5e,f，和补充数据19-20），而与ANP增加GFR的生理效应一致[49]，遗传预测的NPPA水平与eGFR呈正相关（P_IVW = 0.035）（补充数据21）。然而，在异常值校正后，eGFR和NPPA在每个方向上均呈正相关（NPPA-eGFR: P_IVW = 0.023；eGFR-NPPA: P_IVW = 0.008），且仅在eGFR-NPPA方向对额外的敏感性分析保持稳健（补充数据21）。
总之，MR分析通过增加遗传证据验证了我们的中介分析，表明微生物代谢物可能塑造宿主的肾功能。此外，这些数据表明宿主肾功能在调节关键微生物代谢物（通常被描述为尿毒症毒素）的循环水平中发挥潜在作用（图5g）。
微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢物与CVD发病率关联
最后，为了确定我们关键血浆代谢物的临床相关性，我们在独立的纵向研究中评估了它们的预测潜力。CLSA[44]研究正在跟踪51,338名加拿大人，在入组时年龄45-85岁，于2010-2015年招募，每3年进行一次纵向追踪，以了解和满足老龄化人口的需求。我们利用他们的基线血浆代谢组学数据（n=8669）来测试我们的关键代谢物是否：1）与基线eGFR和首次随访（即2015-2018，FU1）期间肾功能的变化相关；2）与FU1期间的CVD发病率相关；以及3）对CVD的传统临床标志物[6]增加预测价值。为了扩展这些观察的时间框架，我们查询了Pietzner等人[35]公开可用的网络服务器，其中提供了EPIC-Norfolk队列[35]中11,966名欧洲人的血浆代谢物-疾病关联，随访期约为20年。
年龄和性别校正的线性混合模型显示，除3-苯基丙酸盐外，所有血浆代谢物均与基线eGFR相关，其中香草乳酸效应量最大，其次是苯乙酰谷氨酰胺、3-(4-羟基苯基)-乳酸、4-甲酚硫酸酯等，这与我们在MetaCardis和用于MR分析的人群研究中的观察一致（图6a）。这些模式在EPIC-Norfolk数据中也保持一致，其中eGFR和流行肾病分别解释了3-(4-羟基苯基)-乳酸（4%，7%）、苯乙酰谷氨酰胺（4%，5%）和4-甲酚硫酸酯（2.5%，2.5%）循环水平的大部分变异（补充图12a），进一步验证了我们对微生物组衍生代谢物和eGFR相互作用的观察。CLSA中的平均eGFR（76.1±14.9）在3年的FU1期间略有变化（73.9±15.8）；尽管如此，包括香草乳酸在内的关键代谢物也与CLSA中的这种变化相关（补充图13）。
考虑到这种影响，我们接下来采用了年龄、性别和eGFR校正的Cox比例风险模型，揭示了我们的关键血浆代谢物与CLSA中FU1期间疾病发病率之间的多种关联。值得注意的例子包括4-甲酚硫酸酯、4-甲酚葡萄糖苷酸、苯乙酰谷氨酰胺、3-(4-羟基苯基)-乳酸和香草乳酸，它们的基线水平与随后三年内心肌梗死的较高发病率相关（FDR < 0.1，图6b）。其中，4-甲酚葡萄糖苷酸、苯乙酰谷氨酰胺和香草乳酸也与更高的总体死亡率相关（FDR < 0.1，图6b）。我们还注意到，3-苯基丙酸盐的基线水平与较低的死亡率相关，与先前观察一致[35]，此外与FU1期间的CKD呈负相关（FDR < 0.1，图6b）。总之，我们大多数关键代谢物的基线水平与未来的CVD发病率相关，特别是心肌梗死，除了4-甲酚硫酸酯外，所有代谢物在EPIC-Norfolk数据中关于未来冠心病发病率方面都得到了复制（FDR < 0.1；补充图12b）。
最后，我们使用多变量Cox回归构建了机器学习模型，其中CLSA-FU1人群被随机分为70/30，70%集用于训练并进行嵌套5折交叉验证，然后在保留的30%测试集中进行测试。这些模型经过1000次bootstrap以改善稳定性并最小化过拟合。我们比较了三个模型：1）仅考虑常规筛查的CVD相关临床标志物（即年龄、性别、体重指数、收缩压、糖化血红蛋白（分为>5.7、5.7-6.4和<6.4%）、吸烟状况、空腹血浆LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯和eGFR）；2）基于六个具有遗传证据的血浆代谢物（即苯乙酰肉碱、肉桂酰甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-甲酚硫酸酯、香草乳酸和3-(4-羟基苯基)-乳酸）；3）将两者结合作为预测因子，以疾病发生率为结局。值得注意的是，在CLSA中预测心肌梗死（图6c）和死亡率（补充图14）时，纳入这些代谢物显著提高了预测准确性（即一致性指数），相对于仅基于临床特征的模型，表明这些代谢物参与IHD发展。总之，这些观察强调了源自苯丙氨酸和酪氨酸代谢的肠道微生物代谢物具有临床相关性并具有预测价值，提示任何针对这些代谢物或其潜在的肠道微生物驱动因素的未来干预都可能阻止CMD和CVD的进展。
讨论
在多细胞生物中，肠道微生物组已经共同进化成为一个代谢和信号器官，通过调节器官发育和功能来塑造宿主生理。事实上，肠道微生物组与各种宿主器官[50]之间的相互作用以及相关的器官间轴[51,52]，其在健康和疾病中的作用越来越被认识到；然而，其中大多数仍需证据支持。慢性CVD的自然史也突显了多器官串扰的逐渐失败，这很可能支撑了从无症状状态向疾病状态的转变。鉴于肠道微生物组在调节生理和病理生理器官间通讯中的作用，它可能在这一过程中扮演重要角色。
在此，在欧洲MetaCardis队列（n=1877）中，我们提供了关于一条肠道微生物组-肾脏-心脏轴存在的流行病学证据，该轴在健康个体（n=275）中存在的代谢失调早期阶段即可检测到；这些发现被外推到患有明显代谢疾病和IHD的个体（CMD, n=1602）。我们的观察阐明了肠道微生物对芳香氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）的代谢以及相关代谢物在塑造人类心血管健康中的关键作用。这些微生物代谢物及其宿主共代谢物被认为是肠道微生物组-外周器官串扰的关键中介，与CLSA队列中显示的未来CVD发病率相关。
我们在MetaCardis研究中作为CMD（即代谢综合征、肥胖、T2D和IHD）参与者对照的代谢健康个体中，捕捉到了肾脏-心脏功能变异（即eGFR-血浆proANP水平）的肠道微生物特征。然而，排除疾病并不会得到一个没有风险因素的人群[9]，因为这些个体中有40%患有高血压或前驱糖尿病（8%两者兼有），两者均作为独立风险因素与早期肾功能损害相关。此外，T2D和高血压被确定为全球范围内驱动CKD及相关CVD死亡率负担增加的两个主要因果因素[53]。确实，肾功能受损与心脏病之间的关系已得到充分确立，研究报告随着eGFR下降，CVD死亡率增加[54,55]。我们还注意到MetaCardis参与者中eGFR与血浆proANP水平之间存在负相关，与先前报告一致[39]。这些观察表明，互补的机制将血压调节和葡萄糖代谢的变异与肾脏-心脏功能联系起来，这可能使得在我们的研究中识别其微生物相关因素成为可能。
我们的工作为这种肾脏-心脏串扰增加了肠道微生物组组成部分。确实，肠道微生物组已被牵涉到影响肾功能的代谢物（即尿毒症毒素）的产生[12]，而肾功能受损导致这些血浆代谢物和其他含氮废物的积累反过来又被提出可诱导肠道菌群失调[11]。我们证明了：1）一些肠道微生物血浆代谢物确实是微生物组-eGFR关联的关键中介，以及2）这两种机制可能并行运作，微生物代谢物影响肾功能（即苯乙酰肉碱和肉桂酰甘氨酸降低eGFR），而肾功能影响肠道微生物组（即eGFR调控4-甲酚硫酸酯、苯乙酰谷氨酰胺作为关键尿毒症毒素以及像香草乳酸和3-(4-羟基苯基)-乳酸这样的新角色的循环水平）。基于我们的观察，我们假设在某些生理条件下，肠道微生物组过度产生对肾脏产生负面影响的某些代谢物，打破平衡，导致其功能受损。这种肾功能障碍反过来导致影响其他器官（如心脏和大脑[52]）的尿毒症毒素积累，引发一连串病理变化。这些早期、微妙的转变可以持续并随着时间的推移逐渐加剧，导致生理反应，如伴随持续性proANP释放的动脉压升高，这可能进一步损害肾功能，形成一个恶性循环，除肾病外还加速CMD的进展。
涉及高加工肉类摄入的饮食模式在塑造肠道微生物组方面起着关键作用[56]，对肾脏和心血管健康具有重大影响。我们的发现表明，饮食诱导的肠道微生物组变化，如蛋白水解发酵的可能上调，与更低的eGFR和包括乙酰肉碱和肉桂酰甘氨酸[57]在内的微生物血浆代谢物的积累有关，这可能促成疾病的起始和进展。鉴于这些关联，针对肠道微生物组调节的饮食干预可以作为预防或延缓肾功能受损、CKD和CMD发作的关键策略。
近期全基因组关联研究进一步将人类遗传变异与多个与心肾轴相关的微生物分类群以及当前研究中识别的关键代谢物的丰度和遗传多样性联系起来（例如Rothia[58]、Ruminococcus[59]、Bifidobacterium[59,60,61]和Faecalibacterium[62,63]），表明除饮食之外的因素可以影响宿主-微生物组相互作用，从而塑造心肾生理和疾病进展。阐明这些因素可能提供机会来靶向关键的宿主-微生物组相互作用，即使是那些受宿主遗传调控的相互作用，以改变疾病进展或结局。
总之，我们的研究为心肾病理生理学的潜在肠道微生物驱动因素提供了宝贵的见解。然而，仍存在若干局限性：1）我们的发现队列MetaCardis是一个横断面、病例对照研究，模拟了心脏病自然史，样本量相对较小；2）基于参考数据库的微生物分类群或功能注释的覆盖范围不能被视为人类微生物组的详尽代表，并且有其自身的偏倚；3）CLSA中缺乏宏基因组数据，不允许对肠道微生物分类和功能特征进行外部复制，与CLSA的代谢组学图谱不同，这些特征需要在额外的人群中进行验证以确保其普遍性；4）MetaCardis和CLSA的参与者主要是欧洲血统，因此需要在不同人群中进行进一步工作以确保我们的发现可转移到其他种族；5）尽管我们已全面筛选并调整了可能的混杂因素，但我们不能排除研究中未测量变量的残余混杂；6）研究中使用的中介和多变量方法未考虑组学数据集中的多重共线性；7）我们使用MR方法从与MetaCardis和CLSA完全无关的人群中添加遗传证据，但它有固有的局限性[43]，包括工具选择和平行多效性假设。最后，我们承认当前工作尚未确定因果关系，任何关于肠道微生物组及其代谢物在心肾生理中因果作用的含义都需要使用实验方法进行进一步研究。
总之，我们的结果表明，人类肠道微生物组支撑着正常肾功能范围内肾脏-心脏生理的早期阶段变异。考虑到肾功能损害通常在疾病非常晚期之前仍无症状[64]，这些微生物贡献者突显了弥合当前诊断或监测该状况能力差距的潜力，这种状况导致其在全球范围内日益增长的患病率和相关疾病负担[53]。这一点很重要，因为30%的T2D患者可能会发展成CKD[53]；我们的工作及时且为识别肾功能恶化和不良心血管结局风险增加的人群开辟了前景，从而有助于旨在减少CMD全球负担的精准医学努力。
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