临床研究已表明白内障与阿尔茨海默病（AD）之间存在潜在联系。然而，白内障是否影响AD的进展仍不清楚。本研究旨在确定白内障与AD之间的关系。通过晶状体穿刺在APP/PS1 [突变型淀粉样前体蛋白（APP）和突变型早老素-1（PS1）基因] 小鼠中建立白内障模型。使用行为分析评估认知功能。采用免疫组化、免疫荧光和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测AD相关病理。
手术诱导白内障后，视觉信号明显受阻，这些小鼠脑内淀粉样β（Aβ）负荷增加，但未发现与Aβ代谢相关的酶水平有显著变化。此外，与对照组相比，白内障模型小鼠呈现星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生增加，促炎因子水平升高。而且，白内障模型小鼠比对照组表现出更明显的认知障碍。我们的研究提供了实验证据，表明白内障显著促进AD的发病机制，从而强调了视觉信号在维持认知健康中的重要性。
引言
大脑作为感知和理解世界的中心枢纽，但认知过程并非孤立发生。大脑还通过视觉、听觉、触觉、嗅觉和味觉系统接收外部环境信息，从而指导我们的行为。其中，80%至90%的外部信息来自视觉，这主要通过识别和感知来构建认知、记忆和学习能力。因此，视觉信号在人脑感知外界和构建认知的过程中扮演着重要角色。
近年来，众多研究表明，视力损害（VI）是认知障碍的一个风险因素。阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆类型，占认知障碍病例的60%-80%，其特征是进行性记忆丧失和认知缺陷。全球约有4400万人患有AD，预计到2050年全球患病率将增至1.3亿。白内障作为全球导致视力损害的主要原因，占全球失明病例的46%。流行病学研究发现，白内障和AD有一些共同的风险因素，如衰老、女性性别、肥胖、吸烟和血管异常。此外，AD患者中常见共患白内障。先前的研究也揭示了晶状体内Aβ可以促进晶状体蛋白的聚集，从而影响光透过率。我们小组之前报道过年龄相关性白内障患者眼房水中Aβ水平升高。这表明白内障可能在AD的发展中起作用。然而，据我们所知，实验证据证明AD和白内障之间的因果关系仍然很少。
为了阐明白内障与AD发展之间的关系，我们在APP/PS1 [突变型淀粉样前体蛋白（APP）和突变型早老素-1（PS1）基因] 小鼠中构建了白内障模型，并检查了白内障对AD样病理和认知功能的影响。我们的研究结果表明，白内障显著促进AD的发病机制。
材料和方法
小鼠
从杰克逊实验室（美国缅因州巴港；JAX目录编号：005864）获得携带AD相关突变的C57BL/6背景的雌性APPswe / PS1dE9转基因小鼠，这些突变包括嵌合小鼠/人源APP695与瑞典突变（K595N/M596L）以及缺失外显子9的人源PS1dE9，两者均受朊病毒启动子控制。雌性野生型C57BL/6J小鼠由第三军医大学附属大坪医院动物中心提供。所有实验方案的伦理和福利方面均经大坪医院实验室动物福利和伦理委员会批准（AMUWEC20237384）。
白内障模型的建立
在6个月大的AD模型小鼠中诱导白内障。用托吡卡胺滴眼液（日本大阪参天制药）扩大小鼠的眼睛。在吸入1.5%异氟醚（中国深圳锐沃德生命科学）维持麻醉下，用碘消毒眼睑。在显微镜下，从角膜缘侧插入30G针头以刺穿晶状体。术后应用左氧氟沙星滴眼液预防感染（日本大阪参天制药）。然后将小鼠放在加热垫上恢复。对照组仅麻醉并接受相同程序，但不诱导白内障。通过裂隙灯检查白内障模型小鼠的临床症状。
明暗箱测试
在12个月龄时，将所有实验小鼠从笼子转移到行为测试室至少30分钟以适应新环境。准备了一个30 cm × 60 cm × 30 cm的箱子，并将其分为两个相等大小的隔间，中间有一个直径为5 cm的开口，允许小鼠通过。然后，将一只小鼠放在照明隔间的中央，背部朝向分区，启动摄像机和照明设备，并开始记录小鼠的行为。经过5分钟的记录后，将小鼠从小盒中移出并放回其笼子。视频通过EthoVision XT行为跟踪软件（荷兰瓦赫宁根Noldus信息技术公司）进行分析。
视觉诱发电位（VEP）记录
每只小鼠适当麻醉，用散瞳剂处理，然后放置在加热垫上以保持恒定体温。清洁皮肤并放置电极以确保与皮肤良好接触。头皮电极放置在相应的骨性标志点上，皮下位于连接双耳线上的枕骨隆突处及双眼连线的中点处。地线连接到尾部。使用全视野闪光刺激器（视网膜矿工-S，中国重庆）。刺激后，将动物从刺激环境中移除并在加热垫上恢复。使用RetiMINER 3.0分析VEP波形和相应参数，如潜伏期。
行为测试
在12个月龄时，所有实验小鼠接受了Y迷宫新颖臂测试、旷场测试和恐惧条件反射测试。所有小鼠被放置在实验室内以熟悉环境。Y迷宫新颖臂测试用于评估空间学习和记忆。Y迷宫的一臂被阻挡，代表新颖臂。每只小鼠被放置在起始臂中，允许其在起始臂和另一臂中自由移动一定时间（通常为300秒）。训练结束后，将小鼠放回笼中休息一段时间（通常为1小时）。在测试阶段，移除阻挡新颖臂的屏障，允许小鼠自由探索所有三臂。再次将每只小鼠放置在起始臂中，记录进入新臂、起始臂和其他臂的次数以及在各臂中停留的时间。行为通过计算机跟踪系统（ANY-maze，美国伍德代尔Stoelting公司）进行跟踪。旷场测试用于评估运动活动。适应后，每只小鼠被轻轻放置在旷场室中心，背部朝向实验者，然后实验者离开该区域。记录动物在旷场室中的活动超过5分钟（ANY-maze，Stoelting）。行为观察包括动态跟踪、总行进距离和速度。恐惧条件反射测试用于评估记忆。最初，每只小鼠被放置在一个20 cm × 20 cm × 20 cm的方形室中并适应2分钟。然后，它被呈现三次听觉条件刺激（CSs；80分贝，4 kHz，持续30秒），每次CS开始后28秒内配以足底电击（非条件刺激；0.3 mA，持续2秒），间隔60秒。训练结束后，清洗实验箱。24小时后，将每只小鼠放回箱中并呈现三次听觉CSs以测试听觉线索恐惧记忆。记录它们5分钟内的冻结行为，并使用EthoVision XT行为跟踪软件（Noldus信息技术公司）进行分析。
脑取样
按照既定方法人道牺牲所有小鼠并获取脑样本。麻醉后，每只小鼠通过心脏灌注0.1%亚硝酸钠生理盐水溶液。然后分离右脑半球，固定在4%多聚甲醛中，并在冷冻切片机（德国韦茨拉尔徕卡）上切成30微米厚的冠状切片，用于后续免疫荧光或免疫组化染色。左脑半球迅速在液氮中冷冻，研磨成粉末，分成三瓶，称重，并保存在-80°C下用于后续生化分析。
检测Aβ斑块
使用6E10抗体（1:1000，美国圣地亚哥Biolegend公司）或硫黄素S（0.015%，美国圣路易斯Sigma公司）对五个代表性切片进行染色以识别Aβ斑块。所用方法在我们之前的研究中有描述。所有切片均使用Olympus VS200幻灯片扫描仪（日本东京Olympus公司）或Zeiss显微镜（德国奥伯科亨Zeiss公司）拍摄照片，并由不了解组别信息的研究人员在相同条件下使用ImageJ软件进行图像分析。
研究小胶质细胞对Aβ的摄取
选择两份跨越包含视觉皮层脑区的代表性切片。在用0.5%Triton-100X（中国上海Sangon公司）清洗和透化后，用3%牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）封闭，然后在6E10（1:1000，Biolegend公司）和抗IBA1（1:1000，日本东京Wako公司）一抗中孵育过夜。第二天，切片用不同荧光团标记的二抗孵育，然后使用共聚焦显微镜（Zeiss公司）捕获图像。使用ImageJ软件（美国贝塞斯达国立卫生研究院）分析荧光信号的共定位。
Western blot分析
脑样本在冰冷RIPA裂解缓冲液（中国南京Keygentec公司）中匀浆。蛋白质通过4%-20% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（中国南京Genscript公司）分离。分离的蛋白质通过电转移至硝酸纤维素膜（美国贝德福德Millipore公司）。膜用3% BSA封闭，并在4°C下与一抗孵育过夜。使用的一抗包括：抗APP C端（1:1000，Millipore公司）、抗BACE1（1:1000，英国剑桥Abcam公司）、抗ADAM10（1:1000，Abcam公司）、抗PS1（1:1000，Millipore公司）、抗IDE（1:1000，Millipore公司）、抗RAGE（1:1000，Millipore公司）、抗LRP1（1:1000，Abcam公司）和抗β-actin（1:2000，Sigma公司）。膜清洗后与相应二抗孵育，然后在Odyssey荧光扫描仪（美国马萨诸塞州Odyssey公司）上扫描。每个条带的强度归一化为内参蛋白条带的强度进行分析。
研究神经炎症
星形胶质细胞用抗GFAP抗体（1:1000，Abcam公司）标记。活化的小胶质细胞用抗CD68抗体（1:200，Abcam公司）标记。所有组织学染色按照我们之前的研究进行。所有切片均使用Olympus VS200幻灯片扫描仪拍摄照片，并由不了解组别信息的研究人员在相同条件下使用ImageJ软件进行图像分析。
ELISA
使用RIPA裂解缓冲液从脑组织样本中提取蛋白质。使用ELISA试剂盒（美国桃树角Raybiotech公司）测量脑匀浆中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，并标准化为总蛋白水平。
统计分析
所有数据均表示为平均值±SEM，并使用SPSS 20.0软件（美国芝加哥IBM公司）进行分析。统计图表由GraphPad Prism（版本10.1.2，美国圣地亚哥GraphPad Software公司）生成。使用未配对t检验和Mann-Whitney U检验评估两组之间差异的显著性。选择未配对t检验或Mann-Whitney U检验取决于数据的正态性。差异在P <0.05时被认为具有统计学意义。
数据和材料可用性
当前研究期间生成的数据集不公开，但可根据合理请求从通讯作者处获得。
结果
白内障导致AD模型小鼠的视力损害
首先，我们建立了如图1A所示流程图所示的白内障模型。白内障模型是在6个月大的APP/PS1小鼠（也称为AD小鼠）中生成的，此时AD病理已经开始发展。建模后第7天，通过裂隙灯检查确认白内障模型的成功建立（图1A）。白内障组（以下简称白内障组）小鼠的晶状体明显混浊。在12个月龄时，为了评估小鼠的视力敏锐度，我们进行了明暗箱测试。在此测试中，视力正常的小鼠通常表现出畏光，因此会在黑暗区域花费更多时间，并减少在明暗隔间之间的转换次数。结果显示，与对照组相比，白内障组在黑暗区域的总时间显著减少，明暗转换次数增加（图1B），表明白内障小鼠视力受损。鉴于焦虑可能影响明暗箱测试的结果，为了避免混杂因素，我们还记录了视觉诱发电位（VEP）以从生理角度评估视力损害。一致的是，我们发现白内障组的P2波潜伏期显著延长，证实了视力敏锐度的下降（图1C）。我们的结果表明，白内障导致AD模型小鼠的视力损害。
图1
白内障模型的建立和视力敏锐度评估。A 本研究基本实验程序示意图。流程图中显示了对照组和白内障组小鼠的代表性眼前段裂隙灯照片。箭头指向混浊的晶状体。B 明暗箱测试的代表性数据和数据分析。轨迹图显示了测试期间小鼠的活动情况，红线表示强记录信号，而灰线表示较弱信号。热图显示了测试期间整个盒子中的活动分布，从冷色调（蓝色）到暖色调（红色）表示该位置活动水平的逐渐增加。暗区累积时间使用未配对t检验进行分析，而交替频率则使用Mann-Whitney U检验进行评估。n = 10–15。C VEP的代表性图像和数据分析（未配对t检验）。在y轴上，R代表右眼，L代表左眼；数字表示不同检测的波形。N1表示第一个负波的发生，N2表示第二个负波。P1表示第一个正波，P2表示第二个正波。右侧的黑框是左侧黑框的放大图像。n = 4–5。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。误差棒为SEM。
白内障加剧AD模型小鼠的认知缺陷
随后，在12个月龄时，我们通过Y迷宫、旷场和恐惧条件反射测试评估了白内障模型小鼠的认知功能。Y迷宫测试中小鼠的热图如图2A所示。与白内障组相比，对照组进入新颖臂的次数更多，在新颖臂中的探索时间更长，表明空间探索倾向增加和短期记忆更好。此外，我们进行了旷场测试以评估小鼠的运动能力。图2B显示了两组小鼠的轨迹。尽管两组在总行进距离或平均速度方面没有显著差异，但在白内障组中发现这两个参数呈下降趋势。此外，为了尽量减少视力损害对认知功能的影响，我们应用了不需要视力的恐惧条件反射测试。白内障组的累积冻结时间缩短，表明白内障组的认知功能比对照组差（图2C）。总之，与我们之前的研究一致，这些行为结果表明白内障显著加剧了AD模型小鼠的认知缺陷。
图2
评估白内障对AD模型小鼠行为的影响。A Y迷宫新颖臂测试中两组小鼠的代表性热图和数据分析（Mann-Whitney U检验）。顶部的颜色条表示下方热图中的活动水平。右侧的暖色调表示这些区域的活动更高。n = 10–14。B 两组小鼠在旷场测试中的代表性轨迹和数据分析（未配对t检验）。n = 9。C 恐惧条件反射测试的实验程序示意图和数据分析（未配对t检验）。n = 8–11。*P <0.05，**P <0.01。误差棒为SEM。
白内障加剧脑内Aβ沉积
为了进一步探讨白内障对AD发病机制的影响，我们用6E10抗体染色以评估总Aβ斑块。与对照组相比，白内障组在新皮层和海马中的6E10染色面积分数和密度显著更大（图3A）。此外，我们使用硫黄素S染色检测致密Aβ斑块。白内障组在新皮层和海马中的硫黄素S染色百分比面积和密度增加（图3B）。我们还单独确定了视觉皮层中的斑块数量，并一致观察到白内障组中视觉皮层中的6E10和硫黄素S染色比对照组更明显（图3C）。我们根据2001年发表的大脑冠状切片解剖图谱对视觉皮层区域进行了统计分析。我们的研究结果表明，白内障加剧了脑内的Aβ斑块负担。
图3
白内障加剧AD模型小鼠脑内的Aβ斑块负担。A 白内障和对照组小鼠脑切片中6E10抗体染色的代表性图像和新皮层及海马的定量结果（Mann-Whitney U检验）。比例尺，800 µm。插图：箭头指示区域的放大视图。n = 10–12。B 白内障和对照组小鼠脑切片中硫黄素S染色的代表性图像和新皮层及海马的定量结果（未配对t检验）。比例尺，800 µm。插图：箭头指示区域的放大视图。n = 8–10。C 左图：冠状脑切片图像；红色方框指示视觉皮层。右图：视觉皮层中6E10和硫黄素S阳性斑块数量的统计分析（统计图表从左到右代表三个连续的未配对t检验，随后是一个Mann-Whitney U检验）。D 白内障和对照组小鼠视觉皮层中6E10和IBA1共染的代表性图像和定量结果（未配对t检验）。比例尺，20 µm。白色箭头指示共染区域，表示小胶质细胞吞噬Aβ的区域。E 代表性Western blot和脑匀浆中APP及其代谢物（CTF-β, CTF-α）水平的定量分析（未配对t检验）。F 代表性Western blot和脑匀浆中APP代谢酶水平的定量分析（未配对t检验）。G 代表性Western blot和脑匀浆中Aβ降解酶和Aβ转运受体水平的定量分析（Mann-Whitney U检验）。n = 8。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。误差棒为SEM。
为了阐明Aβ斑块数量增加的潜在机制，我们用6E10抗体和抗IBA1抗体共染，以便在脑中可视化小胶质细胞和Aβ斑块，并观察小胶质细胞对Aβ斑块的吞噬作用。结果表明，与对照组相比，白内障组中小胶质细胞对Aβ斑块的吞噬作用显著减少（图3D）。这些发现表明，白内障通过损害小胶质细胞的吞噬功能增加了脑内Aβ斑块的数量，从而影响Aβ斑块的清除。
为了进一步探讨这一现象，我们调查了与Aβ产生和Aβ运输相关的蛋白质水平。白内障组和对照组之间全长APP（突变型淀粉样前体蛋白）、其代谢C末端片段（CTF-β和CTF-α）或参与APP代谢的蛋白酶（包括BACE1、ADAM10和PS1）的水平没有显著差异（图3E、F）。此外，我们发现白内障组中运输Aβ进入脑的RAGE（晚期糖基化终产物受体）水平增加（图3G）。此外，我们检查了负责脑内Aβ消化的胰岛素降解酶（IDE）的水平，发现白内障组中IDE的表达水平以补偿方式升高（图3G）。综上所述，我们的研究结果表明，白内障加剧了脑内Aβ沉积，而不干扰APP代谢。
白内障加剧脑内的神经炎症和神经退行性变
为了探讨白内障对AD模型小鼠神经炎症的影响，我们进行了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和CD68染色，以分别评估星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。与对照组相比，白内障组在海马中星形胶质细胞数量更多，在新皮层和海马中活化的小胶质细胞数量增加（图4A、B）。在视觉皮层中，白内障组中活化的小胶质细胞数量显著增加，而星形胶质细胞数量没有显著差异（图4C）。此外，为了支持免疫组化数据，我们使用ELISA测量了促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。与对照组相比，白内障组中的促炎性因子水平显著更高（图4D-F）。这些发现共同表明，白内障显著加剧了AD模型小鼠的神经炎症反应。
图4
白内障加剧AD中的神经炎症。A 白内障和对照组小鼠脑切片中GFAP染色星形胶质细胞的代表性图像和新皮层及海马的定量结果（统计图表从左到右代表Mann-Whitney U检验、未配对t检验、未配对t检验和Mann-Whitney U检验）。比例尺，200 µm。插图：箭头指示区域的放大视图。n = 8。B 白内障和对照组小鼠脑切片中CD68染色小胶质细胞的代表性图像和新皮层及海马的定量结果（统计图表从左到右代表三个连续的未配对t检验，随后是一个Mann-Whitney U检验）。比例尺，200 µm。插图：箭头指示区域的放大视图。n = 7–8。C 左图：冠状脑切片图像；红色方框指示视觉皮层。右图：视觉皮层中GFAP和CD68染色的统计分析（统计图表从左到右代表Mann-Whitney U检验，随后是三个连续的未配对t检验）。D-F 促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平的统计分析（未配对t检验）。n = 6–7。*P <0.05；**P <0.01；***P <0.001。误差棒为SEM。
讨论
在这项研究中，我们证实白内障加剧了AD模型小鼠的认知功能障碍，并加重了Aβ斑块沉积和神经炎症反应。我们的研究为白内障对AD发展的影响提供了实验证据，并强调了视觉信号在维持认知健康中的重要性。
早期研究者发现视力损害对认知功能有显著影响，随后的研究揭示了不同致盲疾病与认知功能之间的关联。白内障作为最常见的致盲原因，已成为关注的焦点。白内障于2003年首次被发现与AD相关。一项回顾性队列研究显示，在AD的并发症中，白内障的发病率相对较高。结合我们之前的发现，这些结果共同表明白内障与AD之间存在很强的相关性，但它们之间的因果关系尚不清楚。在我们的研究中，我们提供了体内实验证据，表明白内障加剧了AD中的认知障碍，补充了之前仅基于相关流行病学数据的证据。此外，我们提供了病理学证据，表明白内障加剧了与AD相关的大脑病理变化，如Aβ负担和炎症反应。这些结果表明，白内障可能促进AD的进展；这与视力丧失是痴呆风险因素的发现一致。然而，目前尚不清楚这些视觉缺陷是否能引起特定脑区神经可塑性、神经元活动和代谢的变化。此外，流行病学研究还表明，帕金森病在白内障患者中的患病率增加。白内障对AD和其他神经退行性疾病的影响需要进一步深入研究。
视觉与大脑认知功能的发展和维持密切相关。近年来，经颅光生物调节作为一种安全的替代方法，用于改善人类的认知功能。此外，光疗，特别是40 Hz闪烁光刺激，已被发现通过调节动物模型中的γ波活动改善认知功能，表明视觉刺激是维持认知功能的潜在手段。此外，一项研究提出40 Hz刺激有助于从大脑中清除Aβ，表明这种刺激促进了小胶质细胞对Aβ的吞噬。40 Hz光刺激被提议作为AD的潜在干预措施，因为它增强了小胶质细胞对Aβ的摄取。有趣的是，我们的研究还发现白内障阻碍了小胶质细胞对Aβ的摄取，表明Aβ负荷的增加可能与减少的光输入信号有关。正如之前的研究强调的那样，40 Hz光刺激调节γ波活动并激活关键脑区的神经回路，这可能有助于认知改善。此外，光刺激已被证明可以恢复皮质醇和血清素水平，表明其在调节神经化学途径中的潜在作用。因此，我们假设白内障可能通过减少光输入信号加剧AD病理，这可能会间接破坏这些神经化学和激素平衡。在未来的研
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