摘要
阿尔茨海默病(AD)的一组核心脑脊液(CSF)生物标志物包括总tau蛋白(T-tau)、磷酸化tau蛋白(P-tau)和β-淀粉样蛋白42(Aβ42)。这些生物标志物反映了AD病理生理学的一些关键方面，包括神经元变性、tau蛋白磷酸化与神经原纤维缠结形成，以及Aβ聚集并沉积形成斑块。核心AD脑脊液生物标志物已在众多研究中得到临床验证，发现在疾病痴呆阶段和轻度认知障碍阶段均具有极高的诊断性能来识别AD。脑脊液Aβ42也被发现与淀粉样蛋白PET在识别脑内淀粉样蛋白沉积方面具有高度一致性。突触蛋白神经颗粒蛋白是AD和AD前驱期的一个新型候选脑脊液生物标志物。高脑脊液神经颗粒蛋白水平可预测未来认知能力下降，并且似乎比T-tau等生物标志物更具AD特异性。重要的是，技术发展提供了超敏测量技术，使血液样本中tau蛋白和神经丝轻链(NFL)等脑特异性蛋白的测量成为可能。AD患者的血浆tau蛋白和NFL均升高，最近一项研究表明血浆NFL具有与核心AD脑脊液生物标志物相当的诊断性能，并可预测未来的认知能力下降。未来需要开展大规模纵向临床研究，以确定血浆tau蛋白和NFL作为初级医疗中神经退行性变一线筛查工具的潜力。
引言
对于阿尔茨海默病(AD)等慢性神经退行性疾病，生物标志物具有重要意义，因为认知症状通常模糊不清且与其他疾病重叠；临床进展缓慢且在相同疾病的患者之间存在差异。反映大脑不同病理生理类型的生物标志物可用于临床诊断，特别是在疾病的早期阶段，预测疾病进展，监测临床试验中新药物候选物的效果，最后还可在临床研究中加深我们对疾病发病机制的理解[1:131–44]。在这方面，AD研究领域处于良好状态，因为有一组高度验证和特异的生物标志物可供使用。AD的影像学生物标志物包括淀粉样蛋白和tau蛋白正电子发射断层扫描(PET)，用于测量大脑中这些蛋白沉积的量，以及磁共振成像(MRI)测量脑体积和神经元连接性。此外，还有一组反映疾病病理关键方面的脑脊液(CSF)检测(神经变性、tau病理和淀粉样蛋白沉积)。实验室医学检测影响高达70%的临床决策，因此在临床医学中具有核心地位[2:3–4]。
本文评论了开发和验证这些脑脊液生物标志物过程中的一些注意事项以及新型生化检测的一些最新进展。
伦理准则合规性
本文基于先前进行的研究，不涉及作者进行的任何新的人类或动物受试者研究。
阿尔茨海默病的核心脑脊液生物标志物
核心AD脑脊液生物标志物包括总tau蛋白(T-tau)、磷酸化tau蛋白(P-tau)和β-淀粉样蛋白的42氨基酸亚型(Aβ42)(表1)。这些分析物反映了疾病发病机制的关键方面，即神经元和轴突变性、tau蛋白磷酸化与神经原纤维缠结形成，以及Aβ42肽的寡聚化、聚集和沉积形成斑块[3:605–13]。
表1 阿尔茨海默病的脑脊液和血液生物标志物
测量这些AD生物标志物最常用的技术是酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括测量所有tau亚型(无论磷酸化状态)的T-tau检测[4:231–45]、测量苏氨酸181位磷酸化tau蛋白(P-tau181)的检测[5:49–52]，以及测量β-淀粉样蛋白42氨基酸形式(Aβ1-42)的检测[6:1488–94]。大量研究非常一致地发现AD患者T-tau和P-tau均显著升高，同时脑脊液Aβ1-42降低，这在最近的一项荟萃分析中得到了综述[7:673–84]。核心AD脑脊液生物标志物的高诊断性能也已在通过尸检确认诊断的研究中得到验证。这些研究表明，与仅基于临床诊断的研究相比，脑脊液生物标志物的诊断性能更好[8,9]。
尽管核心AD脑脊液生物标志物已在临床上得到良好验证，但一个问题是不同临床实验室之间以及不同批次试剂之间测量结果的变异性，对于Aβ42比T-tau或P-tau更为明显[10:386–95 (e6)]。这一问题源于实验室之间手动ELISA方法的分析程序差异以及试剂质量和制造程序的变异性。为控制和解决这些问题而进行的标准化工作包括开发完全验证的基于质谱的脑脊液Aβ42参考测量程序(RMP)，作为Aβ42测量的"金标准"[11:987–94]，以及核心AD脑脊液生物标志物的认证参考物质(CRM)[12]。此外，已在全自动实验室分析仪上开发了新型检测方法，实现了非常精确和稳定的测量，也在不同试剂和实验室之间实现了稳定测量[13]。这些发展将为AD脑脊液生物标志物提供验证和稳定的测量基础，并使常规临床评估认知障碍和疑似AD患者时引入统一的临界值和更广泛地使用脑脊液诊断成为可能。
脑脊液生物标志物用于早期诊断
轻度认知障碍(MCI)被视为AD的最早临床阶段，通常以情景记忆障碍为特征，尽管其他认知领域的障碍也可能早期出现。然而，MCI是一种异质性综合征，可能由多种疾病引起(仅约一半病例为AD)，这引入了明显的诊断困难。同时，疾病修饰剂的治疗很可能在AD的这个阶段甚至临床前阶段最为有效，因为在神经退行性变变得过于严重和广泛之前。因此，有必要进行研究，考察AD脑脊液生物标志物用于早期诊断的潜力。第一个此类研究发表于1999年，Andreasen及其同事发现，在临床随访中发展为AD痴呆的MCI患者在此疾病阶段已具有典型的AD脑脊液生物标志物特征(脑脊液Aβ42降低，同时T-tau和P-tau升高)[14:5–8]。重要的是，当患者达到痴呆阶段时，脑脊液生物标志物在随访中保持稳定，表明这些生物标志物在疾病的临床阶段不会发生变化[14:5–8]。
需要延长临床随访期以确定哪些MCI不会发展为痴呆，甚至会改善以至于不再有记忆问题。第一个具有这种延长临床随访的研究发表于2006年，由Hansson及其同事完成[15:228–34]。该研究表明，认知稳定的MCI患者不具有AD生物标志物特征，而进行性MCI患者(具有AD前驱期)对老年对照的敏感性和特异性分别为95%和92%，对稳定MCI病例的特异性为83%[15:228–34]。核心AD脑脊液生物标志物对AD前驱期的这种高诊断准确性随后在几个大型多中心研究中得到验证，包括欧洲的DESCRIPA研究[16:619–27]、美国的ADNI研究[9:403–13]和瑞典的Brain Power研究[17:385–93]。总之，这些以及随后的几项研究表明，AD核心脑脊液生物标志物特征在未选择的MCI人群中具有诊断价值，可用于识别MCI中的AD前驱期病例。
基于生物标志物的AD诊断研究标准
最近的报告显示，我们可能在不久的将来拥有AD的疾病修饰药物。例如，β-分泌酶(BACE1)抑制剂显示出脑和脑脊液Aβ水平的显著、剂量依赖性降低[18:1199–210]，这可能转化为对脑Aβ聚集、斑块形成和临床疾病进展的有益影响。此外，1b期aducanumab试验显示，通过florbetapir PET测量的脑淀粉样蛋白斑块有剂量和时间依赖性减少，但也出现了高频率的淀粉样蛋白相关影像异常(ARIA)[19:50–6]。
因此，鉴于我们可能很快拥有有效但可能也很昂贵的药物，这些药物可能会引起ARIA等副作用，并且轻度认知障碍(MCI)是一种由多种疾病引起的异质性综合征(仅约一半病例为AD)，迫切需要基于生物标志物的诊断标准，以便在MCI阶段就能准确诊断AD，综述见[20:560–74]。第一个此类标准发表于2007年，Dubois及其同事提出了AD前驱期(即痴呆阶段之前)的新型研究标准，这些标准基于早期和显著的情景记忆障碍临床核心，同时至少有一种或多种异常生物标志物，包括结构神经影像学(MRI)、分子神经影像学(PET)和脑脊液淀粉样蛋白β和tau蛋白分析[21:734–46]。2014年发布了这些标准的修订和更新版本，主要区别在于下游拓扑生物标志物(体积MRI和FDG-PET)不再被包括在核心诊断生物标志物中(现在仅限于淀粉样蛋白PET和脑脊液生物标志物)，而仅用于监测疾病病程或阶段[22:614–29]。
由于更新的国际工作组(IWG-2)标准[22:614–29]中包含两种淀粉样蛋白生物标志物，因此需要了解它们是否提供互补信息，或者是否可以互换使用。荟萃分析显示，脑脊液Aβ42浓度(使用不同检测格式测量)和淀粉样蛋白PET(几种不同配体)在将病例分类为脑淀粉样蛋白阳性或阴性方面具有非常高的符合率[23:297–309]。例如，一项在两年临床常规中使用脑脊液Aβ42测量的研究，比较了与18F-flutemetamol淀粉样蛋白PET在未选择的记忆障碍患者队列中的符合率，发现符合率(脑脊液Aβ42和淀粉样蛋白PET均为阳性或阴性)为92-97%[24:1282–9]。此外，基于ADNI-2队列的一项研究表明，仅脑脊液Aβ42就能为AD前驱期或AD痴呆提供与全局淀粉样蛋白PET评分或区域(颞叶、顶叶、额叶或扣带回)SUVr评估相同的诊断准确性[25:534–43]。这些发现表明，脑脊液Aβ42和淀粉样蛋白PET可以互换使用，区域PET评估不会增加诊断准确性。
然而，最常见的不一致情况是脑脊液Aβ42阳性但淀粉样蛋白PET扫描阴性的病例[23:297–309]。一项更详细检查此原因的研究显示，这种不一致在认知正常的老年人和早期MCI病例中比在晚期MCI和AD痴呆病例中更为常见[26:772–83]。此外，最近的一项研究表明，认知未受损的老年人如果脑脊液Aβ42阳性但淀粉样蛋白PET阴性，其脑内淀粉样蛋白沉积的累积程度与两种生物标志物均为阳性的病例相同[27:1240–9]。总之，这些数据表明脑脊液Aβ42比淀粉样蛋白PET更早检测到皮质淀粉样蛋白累积。这一知识可能在临床决策中很重要，即在有轻度记忆障碍和疑似早期AD病理的患者中，是进行脑脊液分析还是淀粉样蛋白PET。最后，虽然淀粉样蛋白PET提供了脑淀粉样蛋白沉积量的静态估计，但添加脑脊液T-tau和P-tau(到脑脊液Aβ42测量)将提供对未来认知能力下降率的估计，从而预测预后[28,29]。
突触功能障碍和退化的新型生物标志物
虽然我们有经过良好验证的神经变性以及斑块和神经原纤维缠结病理的脑脊液生物标志物，但目前还没有建立或验证用于突触功能障碍或退化的生物标志物检测，而这是AD病理生理学的一个关键特征。突触退化和丧失是AD中认知缺陷的最佳病理解剖相关因素，并且比Aβ斑块负荷更能预测疾病[30,31]。已提出几种潜在的致病机制导致AD中突触功能障碍和树突棘丧失，包括Aβ纤维[32]、可扩散Aβ寡聚体[33]、细胞内Aβ累积[34]，以及tau过度磷酸化和小胶质细胞激活[35,36]。
很明显，能够在AD患者和认知正常的老年人中直接监测突触和树突功能和丧失的可靠生物标志物，将是对AD诊断生物标志物工具箱的非常有价值的补充，也可用于临床试验，监测新型药物候选物对突触功能障碍和退化的药效学影响。
神经颗粒蛋白是一种由兴奋性神经元在皮层和海马中表达的树突蛋白[37,38]，在海马中突触可塑性和长时程增强(LTP)的诱导中起关键作用[39,40]。在正常人脑中，Ng表达在联合皮层区域最高，而在AD中，神经颗粒蛋白水平在皮层和海马中[41,42]反映了突触丧失。因此，测量脑脊液中的神经颗粒蛋白可能提供一个反映树突不稳定性及退化的生物标志物，从而作为AD临床症状的直接联系(表1)。
1999年，我们表明包括神经颗粒蛋白在内的多种突触蛋白被分泌到脑脊液中[41]。一项使用免疫沉淀结合Western blotting评估脑脊液神经颗粒蛋白作为AD生物标志物的初步研究显示，与对照组相比，AD中神经颗粒蛋白显著升高[43]。在开发新型单克隆抗体通过ELISA测量神经颗粒蛋白后，发现高脑脊液水平可预测MCI中的AD前驱期[44]。AD痴呆和AD前驱期中高脑脊液神经颗粒蛋白已在随后的几篇论文中得到证实[45,46]，包括在ADNI研究中[47]。高脑脊液神经颗粒蛋白还与MRI测量的海马萎缩率和FDG-PET上的代谢减少率相关[47]。有趣的是，最近一项研究表明，高脑脊液神经颗粒蛋白可能对AD具有特异性，在其他神经退行性疾病如额颞叶痴呆、路易体痴呆、帕金森病、进行性核上性麻痹或多重系统萎缩中未发现[48]。
脑脊液中神经颗粒蛋白的质谱表征表明，它以一系列C端肽的形式存在于脑脊液中[44]，而一项结合免疫沉淀和Western blotting的研究在脑脊液中鉴定出与全长蛋白相对应的条带[43]。一项使用基于结合N端和C端神经颗粒蛋白抗体的夹心格式的免疫测定法的研究，理论上测量全长神经颗粒蛋白，也发现与对照组相比，AD和MCI中的脑脊液水平较高[49]。因此，我们需要进一步研究神经颗粒蛋白在释放到脑脊液之前以何种方式被处理，包括比较全长与C端神经颗粒蛋白肽的诊断潜力的研究。
血液生物标志物：AD生物标志物领域的圣杯
影像学生物标志物(淀粉样蛋白和tau蛋白聚集的PET成像)和脑脊液中淀粉样蛋白和tau蛋白的测量在识别AD病理生理学方面都表现良好。然而，PET成像非常昂贵，仅在专业中心可用，因此不太可能成为评估大量寻求认知症状医疗建议患者的常规诊断工具。此外，即使脑脊液采集在临床神经病学中是常规操作，且AD脑脊液生物标志物测试的成本远低于PET扫描，但许多临床医生可能认为腰椎穿刺是复杂、耗时且侵入性的。因此，血液样本中生物标志物的测量将是一种更实用的方法。
然而，开发血液生物标志物的一个主要挑战是，反映AD分子机制的脑特异性蛋白质在血液中的浓度远低于脑脊液。例如，神经元蛋白tau的脑脊液水平约为2-300 pg/mL[50]，而血浆水平低100倍，约为5 pg/mL[51]。除了对分析灵敏度的要求外，这些非常低的水平必须在其他蛋白质(如白蛋白和免疫球蛋白)的基质中量化，这些蛋白质的浓度高出100亿倍[52]。重要的是，技术发展提供了超敏测量技术，如免疫磁减法(IMR)和单分子阵列(Simoa)方法，使得能够准确分析血液样本中的生物标志物[53]。
使用IMR[54]和Simoa[51]方法都发现了AD患者血浆tau水平升高。最近一项针对大型ADNI和BIOFINDER队列的研究证实了AD痴呆患者血浆tau升高，尽管与对照组相比水平重叠较大[55]。此外，ADNI分析的纵向数据显示，血浆tau与较差的认知、更多的萎缩和随访期间更多的低代谢显著相关。ADNI的纵向分析显示，较高的血浆tau预测未来认知能力下降率、MRI测量的脑萎缩增加，以及FDG-PET检查的皮层葡萄糖代谢减少[55]。
虽然血浆和脑脊液tau水平相关性较差[55]，但血浆和脑脊液神经丝轻链(NFL)蛋白之间的相关性非常紧密[56]，神经丝轻链是另一种轴突神经元特异性蛋白。血液(血清或血浆)NFL可以通过在Simoa平台上开发的免疫测定法准确测量[57]。Simoa检测的分析灵敏度比使用相同抗NFL抗体在基于电化学发光(ECL)的Meso Scale Diagnostics(MSD)技术或标准ELISA基础上的免疫测定法高出25至125倍[57]，这意味着NFL也可以在正常个体的血液样本中测量，而使用ECL-MSD或ELISA方法时，这些样本低于准确量化的水平。
使用Simoa NFL检测，最近一项针对大型ADNI队列的研究显示，与对照组相比，AD和MCI患者的血浆NFL显著升高，诊断性能可与核心AD脑脊液生物标志物相媲美[58]。此外，血浆NFL在淀粉样蛋白PET扫描阳性的AD和MCI病例中最高，并与较差的认知和未来脑萎缩率(通过MRI测量)以及FDG-PET测量的低代谢率相关[58]。然而，在几种其他神经退行性疾病如额颞叶痴呆和进行性核上性麻痹中也发现了高血浆NFL水平[59,60]。
血浆tau和NFL的一个可能的未来应用是在初级医疗中对认知障碍患者进行临床评估。在这里，血浆tau和NFL可能作为简单、无创和廉价的筛查工具，用于识别或排除神经退行性变。然而，需要进行未来的大规模纵向研究，以确定阳性的临界值以及识别AD的敏感性和特异性。
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