研究亮点
• 脑细胞类型的溶酶体蛋白质组学分析
• 鉴定出此前未被表征和具有细胞类型特异性的溶酶体蛋白
• SLC45A1是一种神经元特异性溶酶体糖转运蛋白
• SLC45A1缺失导致溶酶体和线粒体功能障碍
摘要
溶酶体基因突变会导致神经退行性和神经性溶酶体贮积症(LSDs)。尽管溶酶体在脑内稳态中起着至关重要的作用，但不同脑细胞类型的溶酶体组成和功能特异性仍不甚明了。本研究报道了从小鼠神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中获取的溶酶体定量蛋白图谱。我们鉴定出数十种此前未被注释为溶酶体的蛋白质，并揭示了脑部不同细胞类型间溶酶体组成的多样性。值得注意的是，我们发现SLC45A1是一种基因突变会导致单基因神经疾病的蛋白质，其为一种神经元特异性溶酶体蛋白。SLC45A1缺失在体外和体内均导致溶酶体功能障碍。SLC45A1作为溶酶体糖转运蛋白，影响溶酶体膜上V-ATPase(液泡ATP酶)的V1亚基稳定性。与之相符，SLC45A1缺失减少了溶酶体V1亚基，升高了溶酶体pH值，并扰乱铁稳态，导致线粒体功能障碍。总之，本工作将SLC45A1相关疾病重新定义为一种LSD，并建立了研究细胞类型特异性溶酶体生物学的全面图谱。
引言
溶酶体是膜结合细胞器，负责降解大分子物质和清除受损细胞器以维持细胞内稳态。溶酶体功能由其蛋白质组分介导，包括降解来自细胞内外多种来源货物的腔内水解酶，以及调节代谢物输出、溶酶体完整性、运输、融合过程和pH值的整合膜蛋白和膜相关蛋白。
除了降解功能外，溶酶体还是营养和能量感应通路的关键调节者，包括机械靶标雷帕霉素复合物1(mTORC1)和AMP激活蛋白激酶(AMPK)，并且与细胞代谢状态密切相关。溶酶体作为氨基酸、胆固醇以及钙、铁等金属等营养物质的储存库。因此，它们参与血浆膜修复、应激抵抗、细胞生长和程序性细胞死亡等功能。
鉴于其核心作用，溶酶体基因突变会导致溶酶体贮积症(LSDs)并导致多种疾病，特别是阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和额颞叶痴呆等神经退行性疾病。LSDs的特点是未消化的大分子在溶酶体中积累，其中许多疾病表现为严重的神经系统症状。
虽然溶酶体在各组织中发挥作用，但脑内不同细胞类型中溶酶体的组成和作用仍不甚明了。目前尚不清楚溶酶体蛋白丰度是否在脑细胞类型间存在差异，以及这种差异如何导致疾病。此外，尚不清楚不同脑细胞中是否存在专门执行特殊功能的特异性溶酶体蛋白。
为解决这些空白，我们利用LysoTag小鼠模型结合细胞类型特异性Cre重组酶表达，生成了脑主要细胞类型的溶酶体蛋白图谱，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞（可通过
我们的发现提供了脑部细胞类型特异性溶酶体蛋白质组景观的详细视图，并为未来研究溶酶体生物学及其在神经系统疾病中的作用奠定了基础。
结果
使用LysoTag小鼠进行细胞类型特异性溶酶体分离和蛋白质组分析
为从四种主要脑细胞类型——神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中分离完整溶酶体，我们利用了编码TMEM192-3x血凝素(HA)融合蛋白(LysoTag)的转基因小鼠模型，该蛋白整合在* Rosa26 位点下游的lox-stop-lox(LSL)盒中。通过将LysoTag小鼠与在细胞类型特异性启动子下表达Cre重组酶的小鼠杂交，即 Syn1 用于神经元， Gfap 用于星形胶质细胞， Olig2 用于少突胶质细胞，以及 Cx3cr1 *用于小胶质细胞，我们生成了在每种脑细胞类型中表达LysoTag的小鼠。我们证实LysoTag在每种细胞类型中均正确定位于溶酶体。随后，我们建立并验证了用于分离细胞类型特异性溶酶体的高效LysoIP方案。基于这些结果，我们使用无标记数据非依赖性采集(DIA)质谱法确定了纯化溶酶体及其相应的全脑输入溶酶体的蛋白质组景观。正如预期，与mockIP（不表达LysoTag小鼠的IP）相比，所有Cre系的免疫沉淀物(IP)中均观察到先前描述的溶酶体蛋白(此处称为溶酶体相关蛋白)显著富集。为评估拉下物的特异性，我们基于最近发表的EndoIP数据集分析了内体蛋白(与溶酶体密切相关的区室)的富集情况，并发现LysoIP样品中没有一致的富集。我们还通过将我们的数据集与先前研究的 curated cargo lists进行比较，进一步检查了溶酶体货物蛋白(瞬时降解底物)的潜在存在。这些蛋白相对于mockIP表现出无或最小富集，而核心溶酶体蛋白则在所有Cre系中持续富集。总之，这些结果表明，使用细胞类型特异性LysoTag系统的LysoIP能够在无需先前细胞分选的情况下，从不同脑细胞类型中分离溶酶体。这种方法为研究细胞类型特异性溶酶体组成提供了稳健方法。
脑溶酶体的蛋白质组景观
为表征不同细胞类型中脑溶酶体的蛋白质组景观，我们首先生成了相对于mockIP对照在LysoIP部分富集的蛋白质列表。为避免可能受IP效率或细胞类型丰度影响的任意截断值，我们应用了基于每种Cre系富集计算的数据驱动策略，包括全脑LysoIP(* CMV *-Cre)。首先，我们通过比较LysoIP与对照mockIP数据集中的水平，计算了每种蛋白质的富集分数。其次，我们应用了基于明确定义的核心溶酶体蛋白作为阳性集和核染色质相关蛋白作为阴性集的分类器。该策略验证了我们的方法对溶酶体蛋白的选择性富集，曲线下面积(AUC)为0.90-0.92，表明高准确性。它还使得能够独立地为每个数据集分配LysoIP富集蛋白。值得注意的是，在我们的数据集中检测到213种核心溶酶体蛋白中的191种，其中146种(76%)被LysoIP富集，表明覆盖率高。
将所有Cre系中富集的蛋白质(false positive rate [FPR] < 0.05)组合起来，我们鉴定出790种在至少一个数据集中LysoIP富集的蛋白质。此外，790种蛋白质中有170种在所有数据集中均被发现富集，其中大多数(140/170, 82%)先前已被注释为溶酶体相关蛋白。基因本体论(GO)分析证实了LysoIP富集蛋白中溶酶体相关术语的显著富集，而即使是密切相关的术语如内体，其富集程度也低得多(例如，溶酶体术语的过表达分析[ORA]分数为4.77，而内体ORA分数为1.98)。
在脑LysoIP富集蛋白中，303种是先前已知的溶酶体组分，而487种此前未与溶酶体相关联，可能代表未表征的溶酶体蛋白或组织特异性货物，靶向降解。为验证其中一部分蛋白的溶酶体定位，我们基于所有Cre系的富集分数对所有LysoIP富集蛋白进行排名，并选择了七种高排名候选蛋白进行实验验证：CBLN3、EDIL3、ENPP5、PLEKHB1、SLC45A1、TMEM88B和TMEM256。我们在U2OS细胞中检测到所有七种蛋白的GFP融合构建体均定位到溶酶体。与先前报道一致，一些测试蛋白也定位于其他区室。例如，我们发现TMEM256和CBLN3分别部分定位到线粒体和内质网(ER)，支持其在细胞器间接触位点的潜在作用。EDIL3和PLEKHB1定位于溶酶体膜上的特定焦点，而非均匀包被膜，暗示其在接触位点等特化亚区域的作用。重要的是，GFP对照以及在我们的LysoIP数据集中被鉴定为未富集的GFP标记蛋白IGBP1显示出很少或没有溶酶体定位，排除了潜在的标记或过表达伪影。总之，脑细胞类型的溶酶体蛋白图谱为识别先前未表征的溶酶体蛋白提供了可靠资源。
脑细胞中细胞类型特异性溶酶体蛋白质组景观
溶酶体丰度和大小在不同脑细胞类型间存在差异，促使我们评估每种细胞类型中相对于整体溶酶体含量的单个溶酶体蛋白的相对水平。为考虑细胞数量、LysoIP效率和溶酶体丰度的差异，我们将LysoIP富集蛋白强度归一化为核心溶酶体蛋白的中值丰度。这些此后使用的归一化值在细胞类型间高度相关，表明溶酶体蛋白组成大致相似。与此一致，不同代谢功能的溶酶体蛋白丰度分布在不同细胞类型间大体保守。
尽管溶酶体组成大致相似，但主成分分析(PCA)揭示了独特的细胞类型特异性溶酶体特征，表明不同细胞类型溶酶体具有独特的蛋白质组景观。对不同细胞类型进行方差分析(ANOVA)揭示了一组溶酶体丰度在不同脑细胞类型间存在差异的蛋白质。高排名差异丰度蛋白包括已确立的微胶质细胞标记物CD68，以及腔内酶如组织蛋白酶和外切核酸酶，例如在微胶质细胞中更丰富的CTSH和PLD4；在神经元中更丰富的溶酶体膜蛋白SLC36A1；以及在少突胶质细胞中更丰富的芳基硫酸酯酶G(ARSG)。
我们接下来调查了驱动脑细胞类型间溶酶体蛋白差异丰度的潜在机制。为测试这些差异是否可由mRNA表达解释，我们将LysoIP蛋白质组学与单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据进行了比较。mRNA表达谱与溶酶体蛋白丰度模式在"优于随机"的水平上显著相关，验证了我们的细胞类型特异性LysoIP。值得注意的是，观察到几个例外，包括分泌蛋白如小脑素1和2(CBLN1和CBLN2)、gremlin 2(GREM2)和糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)，这些蛋白在表达较少/不表达的细胞类型的溶酶体中更为丰富。其中三种蛋白主要由神经元表达，但在星形胶质细胞(CBLN1和GREM2)和少突胶质细胞(CBLN2)的LysoIP中更为丰富。类似地，GPNMB是一种主要由少突胶质细胞和与疾病相关的活化微胶质细胞表达的跨膜糖蛋白。我们在星形胶质细胞来源的溶酶体中发现GPNMB高度丰富，可能是因为它从细胞表面脱落。对我们在数据集中检测到的GPNMB肽段的详细分析证实了它们来源于蛋白的脱落胞外域。这些结果表明，细胞类型特异性LysoIP可能能够检测到在一个细胞类型中产生而在其他细胞中摄取/使用的蛋白，这一观察对依赖交叉校正原理的基于细胞的疗法具有重大治疗意义。总之，这些数据表明溶酶体的蛋白质组成在不同脑细胞类型间存在差异，至少部分原因是编码溶酶体蛋白的基因表达差异，而细胞类型特异性LysoIP可用于表征可能介导细胞间通讯的溶酶体蛋白动态。
溶酶体基因突变是神经退行性疾病的主要风险因素。为调查与这些基因相关的蛋白质是否在不同细胞类型的溶酶体中差异丰度，我们分析了与LSDs、PD和阿尔茨海默病及相关痴呆症(ADRDs)在遗传上相关的基因集的富集模式。在这三个疾病组中，我们检测到67种LysoIP富集蛋白，其中大多数在脑细胞类型的溶酶体中以相当的丰度存在。我们发现一组与疾病相关的溶酶体蛋白在不同Cre系的LysoIP中差异丰度，暗示疾病相关蛋白的潜在细胞类型特异性作用。我们还鉴定出另一组在在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库中存在的LysoIP富集蛋白，其中包括一组在现有资源中未被注释为溶酶体的蛋白。这些蛋白编码基因的突变可能构成先前未被识别的LSDs，为研究神经系统疾病中溶酶体功能障碍提供了宝贵资源。
SLC45A1是在神经元细胞中表达的溶酶体蛋白
在显示脑细胞类型间差异丰度的疾病相关蛋白中，跨膜蛋白SLC45A1引起了我们的注意。SLC45A1突变会导致具有神经精神特征的单基因神经系统疾病；此外，SLC45A1此前从未被报道为溶酶体蛋白，但被认为是质膜糖转运蛋白。我们假设SLC45A1是一种未表征的神经元特异性溶酶体蛋白，因此SLC45A1相关疾病是一种先前未被识别的LSD。事实上，SLC45A1主要在脑中表达，并且其mRNA表达在原代脑细胞中仅限于神经元。一致地，SLC45A1表达在人诱导多能干细胞(iPSCs)分化为神经元(iNeurons)的过程中增加，这在mRNA和蛋白质水平上均得到证实，使用内源性标记的SLC45A1蛋白。此外，我们在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中观察到SLC45A1表达，并且其表达在血清剥夺条件下增加，该条件用于我们的功能分析以增加这些细胞中对SLC45A1的依赖性。
值得注意的是，我们在LysoIP蛋白质组学中检测到微胶质细胞来源的溶酶体中存在SLC45A1，可能是由于神经元修剪或* Cx3cr1 -Cre渗漏到神经元，因为 Cx3cr1 -Cre的LysoTag在一部分神经元中被检测到。与此一致，SLC45A1 mRNA在小鼠原代微胶质细胞中低或不可检测。使用最近开发的微胶质细胞特异性Cre系( Fcrls -2A-Cre;LysoTag)，我们观察到在此模型中鉴定的溶酶体富集蛋白与使用 Cx3cr1 -Cre;LysoTag获得的蛋白之间存在强相关性，但有一些显著例外，包括SLC45A1在 Fcrls *-2A-Cre;LysoTag的LysoIP中未被富集。此外，与在iNeurons中不同，我们在人iPSC衍生的微胶质细胞(iMicroglia)中使用内源性标记的SLC45A1未检测到SLC45A1表达。基于这些证据线，我们得出结论：SLC45A1是脑中的神经元特异性蛋白。
为验证SLC45A1的溶酶体定位，我们首先在U2OS和过表达标记SLC45A1的SH-SY5Y细胞中使用了免疫荧光。重要的是，我们在SLC45A1蛋白的C末端鉴定出一个保守的酸性双亮氨酸基序EHRPLL，将其突变为AHRPAA导致大多数细胞在质膜上表达部分蛋白。与显微镜数据一致，LysoIP证实了SH-SY5Y细胞中SLC45A1的溶酶体定位。最后，内源性标记的SLC45A1几乎完全定位于iNeurons中的溶酶体，这通过显微镜和LysoIP均得到证实，排除了过表达伪影，并确立SLC45A1为神经元细胞中的核心溶酶体蛋白，从而强调其在溶酶体功能中的潜在作用。
SLC45A1缺失导致溶酶体功能障碍
为调查SLC45A1缺失是否导致先前未描述的LSD，我们生成了SLC45A1缺陷型SH-SY5Y细胞。与LSDs的细胞特征一致，SLC45A1缺失导致LAMP1信号显著增加和溶酶体向核周聚集。透射电子显微镜(TEM)证实溶酶体大小增加。它还揭示了具有脂褐素样色素的致密溶酶体积累，而溶酶体数量没有增加。此外，SLC45A1缺陷细胞显示出自噬通量的实质性阻断、作为自噬标记物的P62蛋白水平增加，并且与野生型细胞相比，其溶酶体表现出蛋白水解能力显著降低。重要的是，所有这些表型在重新表达SLC45A1时均显著逆转。值得注意的是，非靶向脂质组学揭示了双(单酰基甘油)磷酸(BMP)水平显著增加，这是在多种LSDs中已知升高的溶酶体脂质。总之，我们的数据为SLC45A1缺陷细胞中存在溶酶体功能障碍提供了证据，这是真正LSD的标志。
为评估SLC45A1缺失是否在体内导致溶酶体功能障碍，我们生成了* Slc45a1 敲除( Slc45a1 -KO)小鼠，其删除了跨越外显子2至5的5,837 bp区域，这通过靶向质谱得到证实。与我们的细胞系数据一致，SLC45A1缺失导致原代皮层神经元中LAMP1信号显著增加及其向核周聚集。TEM揭示了 Slc45a1 *-KO小鼠皮层神经元中具有脂褐素样色素的致密溶酶体丰度，为SLC45A1缺陷体内溶酶体参与提供了有力证据。
SLC45A1表现出具有广泛胞质环的拓扑结构，暗示其在溶酶体表面的结构作用。为揭示这种潜在功能及其缺失对溶酶体的影响，我们使用邻近依赖性生物素鉴定(BioID)结合质谱来鉴定HEK293细胞中的SLC45A1互作蛋白。我们使用过表达生物素化酶BirA或BirA融合到另一种溶酶体膜蛋白(TMEM192-BirA*)的空间对照。引人注目的是，BirA*-SLC45A1而非BirA或TMEM192-BirA对照回收了V-ATPase复合物的五个V1亚基，包括ATP6V1A、ATP6V1D、ATP6V1C1、ATP6V1E1和ATP6V1B2。免疫共沉淀揭示了SH-SY5Y和iNeurons中SLC45A1与V1亚基之间的邻近性。基于这些结果，我们假设SLC45A1可能影响溶酶体上V1复合物的募集或稳定性，从而有助于溶酶体pH稳态。与此一致，我们观察到与野生型相比，SLC45A1缺陷细胞中V1亚基的溶酶体丰度降低，而全细胞丰度没有相应降低。重要的是，该表型在饥饿条件下观察到，在此条件下V1亚基在溶酶体上的组装增强。与此消耗一致，我们观察到与野生型细胞相比，* SLC45A1 -KO中溶酶体酸化显著受损，这通过重新表达SLC45A1完全挽救。事实上，SLC45A1缺失将溶酶体pH值从约5.4升高到6.2。溶酶体酸化受损导致细胞铁缺乏、活性氧(ROS)增加以及随后在LSDs的细胞系和小鼠模型中的线粒体功能障碍。确实，我们在 SLC45A1 *-KO细胞中观察到较低的铁蛋白和较高的ROS水平。此外，SLC45A1缺失导致较低的氧消耗率(OCR)和线粒体形态改变，形成空泡样结构，与线粒体功能障碍一致。代谢物谱分析显示，依赖铁硫簇复合物生成的线粒体代谢物(琥珀酸、延胡索酸和苹果酸)在SLC45A1缺失时减少。值得注意的是，虽然重新表达野生型SLC45A1可挽救代谢物水平，但表达患者来源的突变SLC45A1(p.Arg210Trp)，该突变成功定位于溶酶体，仅挽救了琥珀酸，但未能挽救延胡索酸和苹果酸水平，并进一步降低了α-酮戊二酸水平。此外，患者突变体未能挽救SLC45A1-KO细胞中的OCR。
SLC45A1缺陷型iNeurons显示线粒体OCR受损，而在不表达SLC45A1的未分化iPSCs中未观察到此类表型。重要的是，铁补充或ROS抑制剂(脂氧合酶抑制剂-1)挽救了SLC45A1缺陷细胞中受损的线粒体OCR。总之，我们的结果表明SLC45A1缺失诱导溶酶体功能障碍，符合LSD，并进一步将线粒体功能障碍作为SLC45A1相关疾病的病理机制。
SLC45A1对溶酶体中己糖外流是必需的
先前研究表明，大鼠SLC45A1包含在糖转运蛋白中发现的几个保守基序，包括RXGRR，该基序也存在于人和小鼠蛋白中。事实上，人、大鼠和小鼠SLC45A1之间的多序列比对表明高度保守序列(约90%-97%)。非靶向代谢物谱分析揭示SLC45A1缺陷细胞中己糖(C6H12O6)显著积累，该现象被野生型SLC45A1挽救，但未被p.Arg210Trp患者突变体挽救。这些结果与SLC45A1作为质膜糖输入器的先前假设相矛盾，如果正确，该假设将预测KO细胞中己糖水平降低。相反，我们假设SLC45A1作为溶酶体膜上的己糖糖输出器发挥作用。为直接测试这一假设，我们利用了一种成熟的方法来监测溶酶体中的葡萄糖外流，通过将溶酶体装载蔗糖，随后通过内吞作用递送转化酶以将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将此方法与LysoIP结合，使我们能够评估葡萄糖是否被困在溶酶体中。为此，我们调整并验证了一种衍生物方法，该方法通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析增加纯化溶酶体中己糖检测的灵敏度。与SLC45A1作为溶酶体中糖转运蛋白发挥作用的假设一致，我们观察到与来自野生型或挽救细胞的溶酶体相比，当用蔗糖和转化酶处理时，* SLC45A1 -KO细胞来源的溶酶体中葡萄糖显著积累。为在体内验证这些发现，我们生成了表达LysoTag的野生型和 Slc45a1 -KO小鼠，该LysoTag在 Syn1 启动子下表达，从而实现神经元溶酶体的稳健纯化。引人注目的是，我们发现与来自野生型小鼠的溶酶体相比， Slc45a1 *-/-神经元来源的溶酶体中己糖糖显著积累。这些结果确立了SLC45A1在清除神经元溶酶体中己糖糖中的关键作用，阐明了其在维持溶酶体稳态和神经元能量代谢中的基本功能。
讨论
溶酶体功能障碍与多种神经退行性疾病相关，许多LSDs表现为严重的神经系统症状。尽管它们在脑中起着关键作用，但溶酶体组成和功能如何在不同脑细胞类型间存在差异仍不甚明了。
利用LysoIP方法结合高分辨率质谱，我们创建了跨越主要脑细胞类型的综合溶酶体蛋白图谱，包括神经元、星形胶质细胞、微胶质细胞和少突胶质细胞。这是通过利用LysoTag小鼠模型实现的，该模型与在细胞类型特异性启动子下表达Cre重组酶的小鼠杂交。我们的脑溶酶体图谱揭示了已知和先前未表征的与溶酶体相关的蛋白，扩展了我们对脑中溶酶体功能和多样性的理解。
尽管溶酶体组成大体保守，但我们观察到独特的细胞类型特异性溶酶体特征，暗示不同脑细胞类型中特化的溶酶体功能。值得注意的是，几种与LSDs相关的蛋白显示跨细胞类型的差异表达模式，暗示不同脑细胞类型和区域对溶酶体功能障碍的易感性不同。虽然涉及膜相关蛋白和腔内酶的溶酶体特化似乎主要由特定于每种细胞类型的转录程序驱动，但我们的数据也强调了在像脑这样复杂器官中进行的细胞类型解析的溶酶体谱分析如何可能揭示与细胞间蛋白质转运相关的额外见解。在稳态和疾病条件下进一步表征这些蛋白质交换事件，可能会揭示通过溶酶体途径在脑中调节蛋白质周转和细胞间通讯的未表征机制。
SLC45A1被鉴定为神经元特异性溶酶体蛋白，突显了LysoIP在发现细胞类型特异性溶酶体组分方面的有效性。据我们所知，SLC45A1是目前唯一被注释为神经元特异性的溶酶体蛋白。
- SLC45A1 *基因突变导致一种以癫痫和智力障碍为特征的单基因神经系统疾病。在此，我们表明SLC45A1相关疾病代表一种先前未表征的LSD。我们的数据表明SLC45A1缺失导致溶酶体中己糖积累，与糖转运功能一致，以及LAMP1水平增加、溶酶体区室扩张及其超微结构破坏、自噬改变和蛋白水解活性降低——这些都是LSDs的标志。虽然我们的结果证实了SLC45A1在糖从溶酶体转运中的作用，而非先前认为的质膜作用，但仍需进一步定义其内源性底物，这些底物可能包括来自降解糖蛋白和糖脂的糖部分。为什么神经元具有特定的溶酶体糖转运蛋白，以及其他脑细胞类型是否存在类似的转运机制，仍有待理解。这可能反映了神经元溶酶体与脑中其他细胞类型相比独特的代谢或信号需求。神经元高度极化且能量需求高。因此，神经元溶酶体中特化的糖外流机制可能支持局部葡萄糖衍生代谢物回收。在星形胶质细胞、微胶质细胞或少突胶质细胞中也可能存在类似的转运机制，但由适应这些细胞类型特定功能作用的不同转运蛋白介导。
除转运功能外，SLC45A1与V-ATPase复合物的V1亚基相关，这对维持溶酶体酸度至关重要。溶酶体pH值调节对于适当的溶酶体功能至关重要，包括分解代谢、代谢物输出和信号传导，并且在SLC45A1缺陷溶酶体中这种调节被破坏，将SLC45A1牵涉到稳定V-ATPase中。事实上，SLC45A1缺失导致溶酶体膜上V1亚基显著减少。鉴于包括葡萄糖在内的营养物质已知调节V-ATPase活性和组装，我们推测SLC45A1的糖转运作用可能影响V-ATPase活性，并由此可能损害溶酶体酸度和代谢信号。了解SLC45A1介导的糖转运与V-ATPase之间的交叉点，其组装受多种机制调控，可能有助于阐明神经元中溶酶体功能的更广泛机制。然而，需要进一步的生化和结构研究来确定SLC45A1-V-ATPase关系的确切性质。
线粒体功能障碍是LSDs中公认的病理机制，并被认为由铁缺乏介导，这破坏了含铁硫簇的线粒体复合物。与这些发现一致，我们观察到SLC45A1缺陷影响细胞铁稳态，升高ROS并导致线粒体功能障碍。这表明SLC45A1相关的溶酶体功能障碍与神经元中更广泛的代谢破坏相关。鉴于神经元高度依赖线粒体活动生存的高代谢需求，这些发现值得进一步调查溶酶体功能与神经元细胞中能量平衡之间的相互作用。
总之，我们的溶酶体图谱为理解溶酶体在不同脑细胞类型中的多样化作用以及细胞类型特异性溶酶体功能如何导致脑疾病提供了宝贵资源。SLC45A1作为溶酶体酸度和糖输出调节因子的鉴定增强了我们对溶酶体功能复杂性和特异性的理解，特别是在神经元中。这些发现为研究脑中溶酶体生物学及其对神经系统疾病和LSDs的影响开辟了机会。
研究局限性
在本研究中，我们使用TMEM192-3xHA作为溶酶体膜标签通过LysoIP分离溶酶体。在未来的研究中，使用替代或组合溶酶体标记物可能会提高蛋白质组分辨率，并能够识别功能不同的溶酶体亚群。我们的* Syn1 -Cre系广泛分离了泛神经元群体中的溶酶体，提供了脑中神经元溶酶体蛋白质组的综合视图，但无法区分兴奋性、抑制性或其他神经元亚型，其溶酶体可能进一步特化。我们的数据显示 Cx3cr1 -Cre存在渗漏。因此，验证 Fcrls -2A-Cre LysoTag模型中的任何微胶质细胞LysoIP富集蛋白很重要。虽然相关货物相关蛋白在LysoIP蛋白质组学数据中似乎比核心溶酶体蛋白富集程度更低，但仅使用LysoIP蛋白质组学数据在未扰动细胞中无法明确区分它们与真正的溶酶体蛋白。虽然我们鉴定出几种可能从一个细胞转移到另一个细胞的分泌溶酶体蛋白，但需要更多生化工作来证明转移机制和生理相关性。当前研究还使用了混合性别幼崽或汇集雄性和雌性样本来最小化性别偏差，尽管它没有明确分析性别特异性溶酶体特征。 Slc45a1 *-KO小鼠的行为评估未作为本工作的一部分进行。尽管如此，我们的发现将SLC45A1定位为溶酶体稳态和V-ATPase功能的关键贡献者。我们承认其他糖或离子转运蛋白也可能参与维持溶酶体功能和支持V-ATPase活性。
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