摘要
研究亮点
• MPPF的数量和功能在衰老过程中保持稳定
• 年轻和年老MPPF在转录组、增殖能力和线粒体功能方面表现出相似性
• 年轻和年老髓系及淋巴系祖细胞的再植能力保持不变
• MPPF恢复HSC强加的衰老，以正常化祖细胞功能
研究摘要
造血系统的衰老对机体健康和寿命有深远影响，这归因于造血干细胞(HSCs)的功能性衰老，这一现象已有充分研究。在此，我们测试了祖细胞是否可能表现出年龄抵抗力，从而在HSCs功能下降的情况下维持整个生命周期的造血稳态。令人惊讶的是，我们的结果显示年轻和年老祖细胞的再植能力始终如一，表明中间祖细胞在功能上不受衰老影响，并将Flk2+多能祖细胞(MPPF)确定为潜在的年龄韧性来源。这一独特发现通过年轻和年老MPPF转录组、增殖和线粒体能力的不变性得到强调，揭示了它们在衰老过程中的显著相似性。考虑到HSCs随年龄增长功能下降，但中间祖细胞保持不受干扰并具有"年龄韧性"，我们认为MPPF可能在保护下游祖细胞不受HSCs遗传的与年龄相关特性方面发挥重要作用。我们提出了三种可能的机制，解释MPPF如何在衰老过程中维持造血完整性和稳态。
引言
造血作用是指产生所有成熟血细胞和免疫细胞的过程，造血干细胞(HSCs)位于这一分化层级的顶端。这些HSCs通过自我更新和生成所有成熟血细胞系的能力，为生物体的整个生命周期提供服务，并已在衰老背景下进行了广泛研究。在人类和小鼠中，已有充分证据表明HSCs在一生中数量增加，同时伴随着长期多谱系再植能力的受损。除移植外，HSC衰老的其他特征还包括转录组变化、细胞增殖能力改变以及线粒体功能障碍。
然而，尽管HSCs在多个参数上随年龄显著衰退，下游成熟细胞的数量并未平行一致地下降。这种明显的矛盾强烈表明，位于HSCs和成熟细胞之间的祖细胞区室可能起到关键的稳态缓冲作用，以补偿上游HSCs的功能衰退。
利用FlkSwitch谱系追踪小鼠模型明确显示，所有年轻的造血祖细胞都利用HSC下游的一个常见前体细胞——Flk2+多能祖细胞(MPPF)。然而，我们最近发现了一种附加的、年龄特异性的巨核细胞祖细胞(MkP)途径，它偏离了典型的Flk2+分化路径且功能上不同。典型MPPF衍生的MkPs能够维持其功能，尽管经历了衰老。因此，我们假设所有典型衍生的祖细胞也能维持其功能，表现出对衰老的根本抵抗力。
在这项研究中，我们调查了HSCs的功能衰退是否在分化为MPPs和其他祖细胞过程中延续。迄今为止，我们尚未完全了解髓系和淋巴系祖细胞如何受到衰老的影响，仅限于描述稳态频率或细胞数量的变化。此外，我们试图揭示祖细胞如何补偿HSCs的功能衰退，以维持在衰老过程中观察到的相对稳定的成熟血细胞产量。
结果
造血细胞中与年龄相关的改变是细胞类型特异性的
为了了解稳态造血过程中衰老发生的改变，我们分析了年轻(Y; 2-3个月大)和年老(O; 18-23个月大)C57BL/6小鼠的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)，遵循图1A中的定义(代表性流式细胞术图见图S2)。正如先前报道的那样，我们观察到HSCs(Kit+Lineage-Sca1+Flk2-SLAM+细胞)在频率和总细胞数量上随年龄增加(图1B)。重要的是，MPPF的数量和频率在衰老过程中保持不变。虽然Young等人先前报告了这一群体频率随年龄下降，但在我们生成的数据和之前的研究中均未反映这一点；差异可能源于我们同时纳入了雄性和雌性。
与先前报道一致，我们还观察到髓系祖细胞(MyPro)区室频率显著增加，尽管总体细胞数量没有显著变化(图1C)。有趣的是，髓系谱系中没有其他中间祖细胞显示出与年龄的差异，包括普通髓系祖细胞(CMPs)、粒细胞/单核细胞祖细胞(GMPs)和巨核细胞-红系祖细胞(MEPs)。MyPro的扩张主要可归因于MkPs随年龄显著增加，我们在此证实了这一点(图1D)。这种髓系频率扩张，通常称为"髓系偏向"，也可通过CLPs(普通淋巴系祖细胞)的数量和频率同时下降来解释(图1E)。由此我们推断，尽管HSCs和MkPs随年龄扩张，但典型衍生的MyPros的数量，从MPPF开始并包括下游CMPs、GMPs和MEPs，在体内随年龄保持一致。
我们还仔细检查了关键细胞表面标志物(包括Flk2和Sca-1)在年轻和年老HSCs和MPPF上的表达，使用平均荧光强度(MFI)。我们观察到年老HSCs中Sca-1表达显著高于年轻HSCs，但年轻和年老MPPF之间Sca-1表达没有差异(图S3)。我们未观察到年轻和年老MPPF之间Flk2表达的显著差异，这一发现与其他已发表数据一致。
年轻和年老MPPF在移植后功能等效
鉴于MPPF被认为是HSCs的假定后代和所有典型衍生祖细胞的上游前体，我们旨在探索这些细胞在移植后的功能能力。通过将来自年轻或年老鼠的MPPF分选并移植到年轻亚致死辐射C57BL/6(WT)受体中，我们首先假设年老MPPF会表现出功能障碍，类似于HSCs。这将表明HSCs的功能衰退会向下传递，且MPPF功能依赖于它们所源自的HSCs的质量。
出乎意料的是，我们发现年轻和年老移植的MPPF在外周血中对任何成熟细胞类型均无显著差异(图2)。尽管这些MPPs已被报道为"淋巴系偏向"(lymphoid primed)，但我们观察到它们对所有成熟血细胞谱系都有贡献，包括血小板(Plts)、红系祖细胞(EPs)、粒细胞/单核细胞(GMs)、B细胞和T细胞，无论年龄如何。这些引人注目的数据提出了一个修正后的假设，即HSCs不会将其与年龄相关的衰退传递给MPPF，但令人质疑其他祖细胞是否也在移植后经历相同的年龄韧性。
典型髓系祖细胞在衰老后维持功能
为了测试我们的假设，即MPPF衍生的祖细胞表现出对衰老的抵抗力，我们比较了来自年轻或年老供体的典型MyPros在移植后的功能。我们分选了CMPs或MEPs，并分别将10,000和50,000个细胞移植到年轻的亚致死辐射受体中(图3A和3B)，以追踪供体衍生的外周血嵌合率和数量。
无论分选的细胞是来自FlkSwitch供体(通过GFP表达确定为MPPF衍生)还是其他普遍荧光小鼠，我们的数据始终显示移植的任何细胞类型在血液细胞贡献方面没有显著、可重复的差异。总体RBC输出往往来自年轻祖细胞更强，但在任何特定时间点数据均无统计学显著性。这些结果支持我们修正后的假设，即MPPF衍生的祖细胞不受衰老影响，或具有"年龄韧性"，具有稳定的稳态频率和数量(图1)，现在在移植后功能上也是如此(图3)。
典型淋巴系祖细胞在衰老后维持功能
在小鼠衰老过程中，髓系在骨髓中的频率扩张，通常被称为"髓系偏向"，但在人类中这种现象不那么明显。重要的是，这种"扩张"主要由于淋巴细胞随年龄减少所致(图1E)。因此，MyPro区室的频率增加，尽管CMP、MEP和GMP细胞数量在年老小鼠中保持稳定(图1C)。
据报道，来自年老供体的HSCs在移植后往往优先产生髓系细胞，对淋巴系细胞的贡献减少。考虑到这一点，我们测试了CLPs的功能能力是否随年龄下降。有趣的是，移植5,000个来自年轻或年老鼠的CLPs仅显示出这些细胞在衰老过程中的微小功能差异，在单一时间点(B细胞嵌合率)存在显著差异，但这是在B细胞输出峰值之后(图3C，移植后32天)。然而，B细胞数量输出方面未检测到相同差异。这些发现突显了这样一个事实：通常随年龄观察到的B细胞和T细胞输出的稳态减少并非由于CLP功能下降所致。相反，很可能是由于CLP数量减少导致B细胞和T细胞数量减少(图1E)。
年轻和年老MPPF在年老环境中表现相似
鉴于年轻和年老MPPF在年轻受体中细胞输出的显著相似性(图2)，我们考虑这种年龄韧性是否可能受外在因素影响。有证据表明，年老骨髓反映了炎症环境，通常称为"炎症老化"(inflammaging)。与年轻相比，年老骨髓血清中多种促炎细胞因子往往升高，以及其他造血组织中也是如此。
我们和其他人已证明，年轻HSCs在年老环境中表现优于年老HSCs。因此，我们试图确定年轻和年老MPPF是否对年老环境有独特反应。我们假设年轻MPPF会比年老MPPF更好地植入，就像在异时性HSC移植中观察到的那样。已报道关键细胞因子如IL-1β、IL-6和RANTES在HSC移植过程中会驱动髓系分化偏向；因此，我们好奇年老MPPF是否会对相同的外在线索产生髓系偏向。
为了测试这些环境中祖细胞的稳健性，我们分选并移植了来自年轻和年老鼠的MPPF到年老宿主中(图4)。令人惊讶的是，当直接比较年轻和年老MPPF时，我们在年老宿主中仍未检测到供体嵌合率以及对血小板、红系祖细胞、粒细胞/单核细胞或T细胞输出的显著差异。有趣的是，年轻MPPF在B细胞输出方面优于年老MPPF，尽管这些差异仅在B细胞产量下降的时间点才显著。与我们最初的假设相反，这表明MPPF的再植能力在移植过程中独特地不受干扰，不像年老HSCs，并且年老MPPF对通常在HSC移植中观察到的髓系分化偏向不敏感。鉴于此处观察到的无差异，我们得出结论，年老微环境对Flk2+衍生祖细胞在移植后的成熟细胞输出不起决定性作用。
MPPF在转录组上随年龄变化较小
考虑到年轻和年老HSCs在频率和功能上有显著差异，并伴有基因表达的强烈变化，我们试图了解MPPF如何随年龄在转录组上变化。我们分析了先前生成的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，显示年轻和年老HSCs之间有600多个基因显著变化，而年轻和年老MPPF之间仅有126个差异表达基因(DEGs)(图5A和5B；logFC >1或<-1且p<0.05)。
有趣的是，在89个随年龄上调的基因中，我们观察到调节红细胞发育的基因富集(Rhag, Gata1, Ank1和Hbb-bs)(图5C和S5)。同时，在37个随年龄下调的基因中，我们观察到对病毒和细胞因子刺激反应的重要基因富集(Rtp4, Isg15, Ifi206, Ifi44和Il7r)。
我们随后比较了HSCs和MPPF之间的转录组，发现年轻HSCs与年轻MPPF之间有1,569个DEGs，年老HSCs与年老MPPF之间有1,178个DEGs(图5A和5B)。为了进一步研究，我们检查了相对于年老HSCs在年老MPPF中上调的基因。这些基因中的许多是调节B细胞和T细胞产生、中性粒细胞激活以及抗原加工和呈递调控的基因。鉴于MPPF已被引用为"淋巴系偏向"细胞类型，这或许不足为奇。相反，在分化过程中下调最显著的前两个基因是Apoe和Pbx1。这些基因已被引用为通过影响代谢活性来调节HSC的增殖和分化，以及调节自我更新和分化之间的平衡。
总体而言，MPPF的独特分子韧性通过随年龄变化的DEGs相对较少而得到强调，凸显了这些细胞随时间转录组的稳定。
MPPF维持类似年轻水平的增殖能力
细胞频率和数量取决于细胞周期和增殖。在发现Pbx1(细胞周期状态的强力调节因子)是从HSC到MPP转变中最显著下调的基因之一后，我们试图对分选的HSC和MPPF细胞群进行功能性测试，检测细胞周期差异。
之前由Ficara等人进行的研究测试了Pbx1条件失活对HSCs和MPPs的影响，并观察到突变细胞通过溴脱氧尿苷(BrdU)整合增殖增加。利用这些见解以及我们的scRNA-seq数据，我们假设MPPF将比HSCs显示更高的增殖能力，无论年龄如何。
在体内注射5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)并允许24小时整合后，我们从年轻或年老鼠中分选出HSCs(Lin-cKit+Sca1+SLAMF1+Flk2-)和MPPF(Lin-cKit+Sca1+SLAMF1+Flk2+)，并与对照相比测量EdU整合(图6A)。与先前数据一致，MPPF显著比HSCs更具增殖性，无论年龄如何(图6B)。对于HSCs，我们观察到EdU整合显著增加，反映了更高比例的增殖细胞，随年龄增长(图6B)。
然而，在比较年轻和年老MPPF时，我们未检测到增殖的显著差异。然而，可见随年龄增殖趋势略高，这得到了Young等人细胞周期数据的支持，该数据显示增殖存在细微差异，特别是在2-8个月之间。鉴于Pbx1或其他主要细胞周期调节因子在年轻和年老MPPF之间没有差异表达，它们在增殖方面未表现出可检测差异或许不足为奇。
与HSCs不同，MPPF维持类似年轻水平的线粒体特征
造血衰老的一个重要标志包括HSCs线粒体能力的明确衰退。例如，Apoe的缺失已被证明会扩张骨髓HSPCs，并被引用为免疫代谢的重要调节因子。从机理上看，有证据表明线粒体功能障碍直接或间接激活Apoe表达。对此，我们好奇MPPF的衰老(其Apoe表达低于HSCs)如何影响线粒体调节。
为解决此问题，我们用DilC1染色cKit富集的骨髓细胞，以评估线粒体膜电位(MMP)，或用MitoSOX测量线粒体超氧化物水平(ROS)，在HSCs(图6C)和MPPF(图6D)中。
虽然DilC1染色显示年老HSCs与年轻HSCs相比MMP较低，正如文献支持的那样，但这种差异在年轻MPPF与年老MPPF之间并未观察到。在评估ROS水平时，我们确认年老HSCs中MitoSOX高于年轻HSCs，与先前报道类似，但年轻MPPF和年老MPPF之间无显著差异。
有趣的是，几篇论文强调了ROS作为HSCs年龄相关功能衰退潜在原因的作用。这些数据指出MPPF衰老过程中ROS和MMP的稳定性是其维持功能输出的机制之一。
讨论
在这项研究中，我们发现MPPF和所有测试的下游祖细胞在功能上不受衰老影响(图2、3、4和6)。这种年龄韧性通过HSPC定量得到加强，强调了大多数祖细胞池在整个生命周期中的稳定存在(图1)。虽然生物衰老对HSC扩张和与年龄相关的非典型巨核细胞生成途径的出现有强烈影响(图1B-1D)，但没有典型衍生的成熟血细胞池随年龄扩张。相反，我们观察到典型血小板和GMs数量稳定，RBCs、B细胞和T细胞数量随年龄减少。
B细胞和T细胞输出的减少不仅反映了从适应性免疫向先天免疫的转变(导致GMs频率增加但数量不增加)，也可能甚至是胸腺退化的自然进展。报告的RBCs随年龄减少似乎在生物学上无关紧要。事实上，当年轻和年老Flk2+衍生祖细胞被移植时，它们植入相当并产生相似数量的成熟血细胞(图2和3)。即使在年老宿主中，我们也仅观察到MPPF对B细胞产生的微小和短暂差异(图4)。
考虑到HSCs在移植后功能输出的显著差异，我们认为MPPF输出的这种微小差异在造血整体输出的背景下相对微不足道。
在转录组方面，我们发现年轻和年老MPPF非常相似(图5)，尤其是考虑到年轻和年老HSCs之间引用的广泛差异。鉴于这些数据，我们假设HSCs比其下游MPP对应物对衰老更敏感，这是由于维持HSC功能的自我更新和分化之间关键平衡所致。因此，MPPs被迫补偿以维持造血。
虽然我们已经证明Flk2对维持MPPF数量很重要，但我们验证了Flk2敲除后MPPF功能保持不变。因此，虽然Flk2似乎在生成或维持MPPF数量方面起着重要作用，但几乎没有证据支持Flk2作为MPP细胞输出的关键驱动因素。
除稳态、再植和转录组数据外，我们的细胞周期分析证实，尽管HSCs随年龄增殖增加，MPPF增殖保持不受干扰(图6A和6B)。有趣的是，Solomon等人最近根据CITE-seq数据识别出MPPF群体内的固有异质性，这与细胞周期状态相关。他们提出，一部分静止的MPPF作为HSCs和MPPs之间缓冲稳态造血细胞生产的关键过渡。这些MPP产生了其他MPP区室并维持高再植能力，持续超过2个月。我们假设这种MPP阶段在补偿HSCs功能衰退的年龄贡献中占主导地位。
从另一个角度评估MPPF的稳定性，我们使用两种测定方法测量线粒体功能。确实，虽然年老HSCs表现出受损的MMP和更高的ROS水平(图6C)，但年老MPPF维持类似年轻水平的线粒体功能(图6D)。我们提出MPPF的线粒体稳定性在其维持年龄功能韧性中发挥重要机制作用。
鉴于本研究展示的MPPF的年龄韧性，并考虑到这些祖细胞是年老造血的重要贡献者，我们认为这些细胞的年龄韧性得以维持并随时间传递给下游髓系和淋巴系祖细胞。这一关键区别质疑了理解HSC衰老的机制意义，因为下游祖细胞在很大程度上保持不变。如果HSC功能下降但下游祖细胞可以补偿，HSC衰老有多重要？
鉴于此处呈现的数据，我们提出了三种可能的机制来解释MPP池随年龄的生物稳定性：
模型(1)：年老HSCs不贡献于典型稳态造血，MPPs负责在年老情况下维持稳定的成熟细胞生产(图7A)。这得到其他出版物的支持，其中一项利用Tie2MCM/+RosaYFP模型诱导HSCs标记并追踪标签长期进展。尽管MPPs被描述为短寿命细胞类型(特别是在移植后)，作者证明MPPs("ST-HSCs": LSK CD150-CD48-)在稳态下具有约330天的实质性停留时间，几乎是小鼠寿命的一半。这些数据突显了移植和稳态造血之间分化动力学的重要差异。作者发现，尽管HSCs在移植后高度增殖，但其标签进展在体内缓慢。他们得出结论，成人造血主要由MPPs在整个生命周期中维持，称其为系统的"关键放大器"。确实，当Schoedel等人耗尽HSCs时，血细胞生成保持未受损，可能由祖细胞而非长期HSCs的快速和强大恢复维持。
模型(2)：只有一小部分HSCs随年龄贡献于MPP池，可能作为保护机制随时间保护剩余HSC池(图7B)。这一假设得到Sun等人的支持；使用M2/HSB/Tn小鼠模型，他们发现不到5%的长期HSC标签存在于成熟细胞中，而几乎一半在MyPros和MPPs中发现的克隆与成熟群体共享。令人惊讶的是，他们还报告说不到5%的长期HSC与MPPs和MyPros共享标签，突显了在未受干扰的成年稳态造血中HSC贡献多么罕见。事实上，许多出版物提供了证据，表明体细胞突变的积累在人类和小鼠的几乎所有组织中都很常见。这些突变往往赋予竞争优势，特别是当被HSC池积累和传播时。有趣的是，这种衰减伴随着造血多样性的缺乏(图7C)。
模型(3)：HSCs确实贡献于成人造血，但它们在通过MPP阶段分化时被"重新编程"为年龄韧性后代(图7C)。这种年龄韧性在HSCs的移植环境中未观察到，可能是因为当放入受照射、高需求宿主环境时，它们被迫增殖。由于宿主在照射后对成熟细胞的迫切需求，HSCs优先快速分化，而不是被重新编程，因为年龄韧性后代不是最高优先级。
从我们报告的scRNA-seq数据中，我们假设从HSC到MPP转变中差异表达的基因将反映"重新编程"的基因。基因本体分析显示，这些"重新编程"基因与细胞数量稳态、免疫反应调节和细胞分化相关，包括巨核细胞分化和血小板形成。
直到现在，概述中间祖细胞在移植后输出的研究仍然缺乏。这些数据为如何整个造血系统受衰老影响提供了宝贵见解，而不是将HSCs视为终身血液贡献的唯一贡献者。在此，我们证明典型祖细胞维持年龄抵抗力，尽管HSCs功能下降、增殖变化、克隆突变积累以及多样性和线粒体能力丧失。
虽然已知HSC衰老的这些标志可能导致老年人的恶性肿瘤和其他异常，但它们通常无法检测且良性。这是因为在这些情况下祖细胞可以补偿吗？因此，我们质疑哪些非恶性条件可能反映无法被下游年龄抵抗力祖细胞补偿的HSC衰老。
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