背景：菌血症是接受异基因造血干细胞移植（HCT）患者的常见并发症。HCT后肠道微生物群的改变与不良结局（包括菌血症和总生存率降低）相关。先前的研究表明，肠道细菌多样性的丧失以及单一物种的优势现象（单菌优势）可能预测血流感染，但能提供最佳阳性预测值（PPV）的优势程度尚未明确。方法：每周收集异基因HCT受者的粪便样本，通过16S rRNA基因PCR及测序分析，确定肠道微生物群组成并记录优势事件。通过审查病历记录捕获菌血症事件。计算了在粪便中任何检测到该物种、以及在10%、30%和50%丰度下的优势事件的菌血症阳性预测值。结果：在277名HCT受者中，有95人发生了菌血症，共计130次菌血症事件。肠道优势与菌血症相关，但预测性不高，表现为低PPV。肠道中凝固酶阴性葡萄球菌的相对丰度大于30%时，与凝固酶阴性葡萄球菌血流感染风险增加相关，其PPV为38%。结论：造血干细胞移植与肠道微生物群显著紊乱相关，尤其是在随后发生菌血症的患者中。考虑到其对大多数血流感染相关菌种的PPV较低，肠道优势可能不像先前认为的那样有用。肠道葡萄球菌定植与菌血症事件之间的关联表明，肠道可能是HCT后患者中这些生物体的一个未被充分认识的进入门户。
菌血症是用于治疗血液系统恶性肿瘤和疾病的异基因造血干细胞移植（HCT）的常见并发症。菌血症发作与住院时间延长和死亡率升高相关。细菌可通过多个部位进入血液，包括因粘膜损伤的口腔或肠道、通过静脉导管的皮肤，以及来自感染部位的泌尿道或呼吸道。在HCT期间，化疗放疗可能导致胃肠粘膜屏障受损，使细菌进入血液，这被称为粘膜屏障损伤相关性菌血症（MBI）。
造血干细胞移植常导致肠道微生物群紊乱，表现为物种多样性丧失以及肠球菌和假单胞菌（变形菌门）等细菌的优势。多样性降低可能导致对病原体的定植抗性受损。基于粪便样本16S rRNA测序的单一物种的肠道单菌优势常与不良健康结局相关。
先前的研究已证明肠道中发现的细菌种类与HCT受者血流感染（BSI）中涉及的种类之间存在联系。Tamburini等人对HCT受者的肠道细菌序列与BSI微生物进行了系统发育分析，发现这些菌株在患者内部比在患者之间更密切相关，支持了BSI分离株可能源自患者自身肠道微生物群的假说。Kelly等人通过前瞻性粪便采样和比较基因组学也得出了相同结论，证明BSI分离株与BSI发作前立即采样的粪便菌株最相似，且通常相同。
目前尚不清楚的是，肠道定植或优势与菌血症风险之间的时间关联，以及如何最好地定义优势以评估菌血症风险。HCT受者肠道优势的一种定义使用了大于30%相对丰度的截断值，并发现肠道单菌优势与菌血症之间的中位时间间隔为7天。
我们的主要目标是建立一个基于预测菌血症强度的肠道优势定义，未来目标是采用针对性抗生素治疗以降低菌血症风险和死亡率。我们从移植前至移植后120天，每周对HCT受者的粪便样本进行PCR和16S rRNA基因测序。我们比较了肠道（粪便）中细菌的存在和丰度与菌血症发作中涉及的细菌。
方法：研究人群：2014年4月至2019年5月期间，在华盛顿州西雅图的Fred Hutchinson癌症中心，329名年龄超过18岁的HCT受者被纳入一项关于肠道微生物群和结局的前瞻性研究。47名患者因从未接受移植或提交的粪便样本不足而被排除，5名患者因菌血症发生在移植窗口外而被排除。剩余患者分为两组：从未经历菌血症事件的患者和在移植后0天至120天之间经历菌血症事件的患者。在另一项分析中，我们分析了50名健康HCT供者的粪便样本。入组前均获得书面知情同意。本研究由Fred Hutchinson癌症中心IRB批准。左氧氟沙星中性粒细胞减少症预防是该机构的护理标准。
样本采集和微生物群特征描述：每周的粪便拭子按照先前建立的方案进行处理。在移植前15天内收集一份粪便拭子，并在移植后120天内每周最多收集一次。拭子在采集后72小时内储存于-80°C，并在冷冻状态下保存直至处理和DNA提取。使用广谱16S rRNA基因PCR和测序生成相对丰度数据。关于肠道微生物群模拟群落和参考集的更多信息见补充数据。其他方法见补充数据。
结果：研究人群和样本采集：共277名HCT患者贡献了2316份粪便拭子，平均每位患者8份样本。95名患者在移植后前120天内至少经历了一次阳性血培养，其中85名患者在阳性血培养发作后30天内提交了至少一份粪便拭子。年龄、性别、种族、供者匹配和基础疾病的完整详细信息见表1。
菌血症事件及其相对于移植的发生时间：我们的队列中95名患者共发生了130次菌血症事件。菌血症事件的特征详见补充表2。大多数患者（n=70）经历了一次菌血症事件，16人经历了2次，9人经历了3次或更多。在130次菌血症事件中，14次（11%）涉及多种菌种。菌血症事件中最常见的微生物是凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）属（53次）、大肠杆菌（12次）、缓症链球菌群组（11次）和肺炎克雷伯菌（10次）。每次菌血症事件涉及的微生物完整列表见补充图2。脐带血移植（CBT）受者的菌血症发生率更高，24名CBT受者中有18人（75%）经历了21次菌血症事件（主要是CoNS和草绿色链球菌）。同样，基础诊断为急性淋巴细胞白血病（ALL）的HCT受者菌血症事件更多，26名ALL患者中有13人（50%）经历了16次菌血症事件（也主要是CoNS和草绿色链球菌）。
每次菌血症事件均相对于移植发生的时间进行追踪。菌血症的中位时间为移植后14天（四分位距8-65天），大多数菌血症事件发生在第9天。图1强调了最初两周内的一个高峰，随后在第15天至第100天之间发病率趋于稳定。一些微生物（草绿色链球菌、孪生球菌和大肠杆菌）与移植后早期的菌血症相关，而其他微生物（克雷伯菌和金黄色葡萄球菌）主要出现在移植后40天以上的BSI中。
有菌血症和没有菌血症患者的微生物群多样性变化和总生存率：我们评估了肠道微生物群多样性相对于移植时间的变化（图2）。患者在预处理期间经历了肠道细菌多样性的下降，移植后这种下降变得更加明显。大约在移植后第20天，大多数患者的肠道多样性开始增加。有菌血症的患者在移植后肠道细菌多样性的下降幅度更大，并且微生物多样性的恢复程度不如没有菌血症的患者，如图2所示，在几乎整个移植后期间，菌血症患者的肠道微生物群多样性显著低于非菌血症患者。当我们排除了菌血症后收集的样本（此时已开始使用额外的抗生素）时，这些结果没有显著改变。当菌血症患者被分为“早期”与“晚期”菌血症时，也观察到了类似的模式，早期菌血症患者最初显示出微生物多样性的更急剧下降，而晚期菌血症患者在移植后期总体上显示出多样性降低。补充图4显示了所有粪便样本中细菌属的相对丰度（按菌血症和非菌血症患者分组）。
我们还探讨了具有较高菌血症率的HCT受者亚组内肠道微生物组成的差异，特别是CBT受者和基础诊断为ALL的患者。CBT受者和ALL患者均显示出与菌血症事件相关的肠道微生物物种丰度更高。脐带血移植患者还表现出移植后中性粒细胞减少症延长——平均24天，而其他类型的移植为13天（P值为0.002）。患者结局被追踪至少1000天。菌血症与移植后总生存率显著降低相关（图3）。
与菌血症相关的肠道微生物属以及血液和粪便微生物之间的一致性：在检查与菌血症风险相关的细菌属时，我们注意到凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和乳杆菌与菌血症显著相关，而罗氏菌属、布劳特氏菌属和厌氧丁酸菌属与菌血症风险负相关。为了评估肠道细菌对血液的潜在播种作用，我们评估了有多少菌血症事件与肠道中存在相同微生物相关。只有那些在菌血症发作前后30天内至少提供了一份粪便拭子的患者被纳入；分析了84名患者的114次菌血症发作。在114次菌血症事件中，67次（59%）与菌血症发生后30天内粪便中存在该菌血症微生物相关。34次事件的血液微生物和粪便微生物之间没有物种或属匹配。其余13次事件仅在属水平上匹配。
粪便中细菌预测菌血症事件的阳性预测值：我们评估了粪便菌种对于预测本研究中菌血症事件最常见的7种微生物所致菌血症的阳性预测值（PPV）。阳性预测值在多个阈值下进行了评估，包括存在（任何检测）、大于10%、大于30%和大于50%的相对丰度（通过16S rRNA基因序列读数）。大多数菌种在所有截断值下的PPV均低于10%，但凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）在大于30%的相对丰度时对应38.1%的PPV，而金黄色葡萄球菌（S. aureus）在粪便中存在该微生物时对应50%的PPV，尽管事件数量较少（图4）。我们进行了排除了菌血症事件后采集样本的二次分析，结果基本保持不变。我们的主要分析包括了菌血症事件前后30天内的样本，以解释仅检查菌血症事件前样本可能遗漏的微生物变化，并反映临床环境中采样的不完美性。我们在亚人群（包括移植后期患有肠道移植物抗宿主病（GvHD）的患者以及发生早期与晚期凝固酶阴性葡萄球菌菌血症事件的患者）中进行了额外分析，以评估PPV。
凝固酶阴性葡萄球菌菌血症事件与肠道定植：在277名HCT受者中，130人（46.9%）在其粪便中检测到CoNS。我们通过将CoNS定植定义为至少连续2份粪便样本中CoNS相对丰度大于1%，进一步评估了粪便中CoNS检测的有效性。在至少有2份粪便样本的整个HCT受者人群中（n=262），21名患者（8%）符合此标准（表2）。21名肠道CoNS定植患者中有8人（38.1%）发生了CoNS菌血症，而241名无肠道定植的患者中有34人（14.1%）发生了CoNS菌血症（P=0.004）。我们研究中的50名健康供者，其粪便样本中均未发现CoNS。
我们试图确定，与发生其他菌血症事件和无菌血症的患者相比，CoNS菌血症患者粪便样本中CoNS的检测率是否存在差异。当患者粪便中CoNS相对丰度大于30%时，CoNS菌血症的患病率为5.6%，而粪便中CoNS水平未达到此水平的患者中，CoNS菌血症的患病率为0.9%（P=0.028）。以任何CoNS检测为阈值也发现了类似的结果。然后我们询问，与无菌血症的患者相比，CoNS菌血症患者的粪便中CoNS的相对丰度是否存在差异。CoNS菌血症患者粪便中CoNS的丰度是无菌血症患者的4倍以上。其他与菌血症风险相关的肠道细菌也发现了类似的模式。
我们通过收集微生物学和临床特征数据，进一步调查了每次CoNS菌血症发作（共53次）。44/53次（83%）菌血症发作使用了万古霉素治疗至少7天，表明临床医生认为这些菌血症事件是重大的。60%的采集批次中所有培养瓶均为阳性，72%的采集批次中超过1套培养为阳性。8/53次发作（15%）中只有一份血培养瓶为阳性。被指定为高可能性的患者更有可能在MBI前后发生早期菌血症（P=0.017），并且与低可能性患者相比，更可能在粪便中检测到CoNS（P=0.002）。在高概率组中，5名在30天后发生晚期CoNS菌血症的患者，均在菌血症发生时表现出MBI的证据，并且其粪便中存在CoNS。
讨论：HCT最显著的不良结局之一是菌血症，其死亡率为10-30%。减少菌血症的努力包括预防性/经验性抗生素、氯己定沐浴以及使用综合性中心静脉导管包。然而，预防BSI的一个关键机会是预测哪些患者会发生菌血症，从而允许进行针对性的预防性抗微生物治疗。先前的研究表明，肠道微生物群有望预测HCT后的健康结局，包括菌血症和总生存率，但尚不清楚如何优化肠道微生物群的知识以在该背景下产生临床影响。
本研究的目的之一是调查HCT、肠道微生物群组成和菌血症之间的时间关联。菌血症在HCT后最初两周内最常见，约在第9天达到高峰，与其他研究一致。这个高风险窗口代表中性粒细胞减少期以及预处理放化疗对肠粘膜造成的最大细胞毒性损伤期。在我们对GvHD患者和中性粒细胞减少期CoNS菌血症患者进行的二次分析中，某些微生物的PPV有所增加，表明MBI可能是菌血症事件的驱动因素，而肠道是一个可能的来源。通常经历更长时间中性粒细胞减少症的脐带血受者，与骨髓移植或外周血干细胞受者相比，菌血症发生率要高得多，这强调了该风险窗口严重依赖于植入时间。ALL患者中观察到类似的更高菌血症率，这些患者在HCT前通常接受多个疗程的强化化疗。这个时间段也是患者肠道微生物多样性下降最剧烈的时期。中性粒细胞减少、肠道屏障破坏和肠道微生物多样性下降的结合可能为菌血症创造了“完美风暴”。我们发现，发生菌血症的患者其肠道细菌多样性的下降幅度比没有菌血症事件的患者更大。我们认识到，发生菌血症的患者接受更多广谱抗生素，这可能导致治疗后肠道细菌多样性总体降低。
预测菌血症的肠道优势的最佳定义尚未牢固确立，尽管先前的研究采用了30%的相对丰度截断值。我们研究的一个目标是确定在不同优势水平下，肠道优势预测每种引起菌血症的细菌所致菌血症的PPV。临床医生可以利用基于高PPV的信息来改变抗生素治疗并预防菌血症。我们的结果表明，对于HCT患者常见的BSI，不仅在30%相对丰度下，而且在存在/不存在、10%、50%相对丰度下，其PPV均相对较低。即使在最高PPV下（粪便中存在金黄色葡萄球菌的PPV为50%），这仍然意味着，如果在患者粪便中检测到金黄色葡萄球菌，其发生金黄色葡萄球菌菌血症的可能性只有50%。尽管几项研究表明，肠道优势与癌症患者的菌血症风险之间存在显著关联（表现为升高的比值比或风险比），但对临床医生来说，更具可操作性的指标是阳性预测值。
我们的结果还表明，根据现行的国家医疗安全网络（NHSN）指南，有一部分由于MBI导致的BSI可能被错误分类，因为这些指南排除了常见的共生菌。凝固酶阴性葡萄球菌通常不被视为肠道微生物群的成员。事实上，在我们纳入的50名健康供者的粪便中，没有发现任何CoNS的16S rRNA序列读数。然而，我们的数据以及其他研究者的数据不仅表明，在癌症患者中肠道被CoNS优势是可能的，而且这种优势与CoNS菌血症相关。我们的一些研究参与者的粪便中持续存在CoNS，相对丰度高达100%。出乎意料的是，CoNS和金黄色葡萄球菌两种菌种观察到的PPV最高，而这两种菌种在其他HCT后菌血症研究中并非主要关注点，这提示肠道可能是金黄色葡萄球菌BSI的众多来源之一。
肠道作为感染源的进一步证据来自于移植后期具有高可能性真正CoNS菌血症事件的患者。所有患者在CoNS菌血症事件发生的同时，均表现出MBI的临床证据，例如类固醇难治性GvHD或针对复发性恶性肿瘤的化疗。我们并不认为所有CoNS感染都源自肠道；相反，许多CoNS BSI很可能是由中心静脉导管感染或皮肤污染引起的，而肠道易位仅代表癌症患者中的一部分事件。真正的CoNS易位过程可能依赖于一种“两次打击”机制，即患者不仅存在CoNS肠道定植，而且还存在显著的MBI。
即使某些微生物在肠道中未达到优势水平，但在粘膜屏障功能障碍的情况下，它们的存在可能足以播散到血液并引起感染。我们确定，在114次菌血症事件中，有67次（59%）是由一种在菌血症事件发生前30天内曾在肠道中发现的细菌种类引起的，这进一步强调了肠道储库的重要性。我们的研究结果表明，通过将常见的共生菌从NHSN的MBI指定合格微生物名单中排除，在接受骨髓抑制化疗或HCT的患者中，当肠道易位可能是来源时，可能会发生菌血症事件的错误分类。例如，如果不考虑胃肠道中的CoNS，一些BSI可能被错误地归类为医院获得性的中心静脉导管相关血流感染（CLABSI），从而对照顾这些高风险人群的机构造成惩罚。
肠道中某些细菌的存在与菌血症风险呈正相关，特别是那些导致BSI的细菌属（埃希氏菌属和肠球菌属）。有趣的是，其他未在任何菌血症事件中涉及的属，如乳杆菌属，也与菌血症呈正相关。或许像乳杆菌属这样的微生物可以作为肠道微生物紊乱和菌血症风险增加的指标，尽管它们没有参与BSI。我们发现，某些细菌，如罗氏菌属、布劳特氏菌属和厌氧丁酸菌属，与较低的菌血症风险相关。这种效应是通过维持肠道屏障完整性、竞争性抑制病原菌获取营养，还是通过其他过程实现，目前尚不清楚。研究这些细菌可能有益的作用，可能有助于开发活体生物治疗药物，并制定个性化的抗生素治疗方案，以在接受HCT的患者中保留这些厌氧菌。同样，识别与菌血症风险正相关的细菌，强调了通过优化抗生素管理来保护肠道微生物群组成的重要性。抗生素与HCT后肠道微生物群之间的联系超出了本研究的范围，但未来的研究将调查这种关系。
我们研究的局限性之一在于测序数据的分辨率。我们靶向了细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。与V1-V2区域相比，该扩增子在区分葡萄球菌、链球菌和乳杆菌的物种方面不够稳健。相反，它非常适合分类肠道中发现的许多分类群。一些分析是在属水平进行的，这些分析中额外的分类学分辨率不会有帮助。我们研究的另一个局限性是粪便采集频率。尽管患者尝试每周收集粪便样本，但这一目标并非总能达到。可能会错过微生物群组成的重要变化，而这些变化对于确定特定时间点的优势事件和多样性至关重要。此外，与某些类型菌血症事件相关的低频率可能导致PPU的人为膨胀，尽管未来更大规模人群的研究将有助于确认这些数据。虽然我们无法通过测序方法直接比较血液中发现的细菌菌株与粪便中的微生物，但这为未来的研究提供了一个途径，以确定从肠道直接易位到血液的作用，特别是对于CoNS菌血症事件。通过加入其他因素（如中性粒细胞减少症以及通过生物标志物评估肠道屏障损伤的证据），有望提高肠道微生物群在HCT背景下预测菌血症的能力。
总之，我们的结果证实，肠道微生物群对异基因HCT受者的菌血症事件具有预测价值，但对于大多数细菌（包括肠球菌、克雷伯菌和大肠杆菌），其PPV较低。作为菌血症预测指标的肠道优势的较低PPV限制了将这一知识转化为行动（如个性化抗生素调整）的能力。HCT受者中肠道CoNS优势及其与CoNS菌血症的联系，强调了细菌易位和菌血症风险的一个可能新发现的来源。虽然频繁的粪便采样可能无法提供可转化为行动的数据（就预测菌血症风险而言），但开发含有保护性物种的活体生物治疗产品可能成为降低菌血症的替代选择。
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