心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因。尽管有指南指导的药物治疗，残留的心血管风险意味着与心血管相关的死亡仍在上升。血栓形成是冠状动脉疾病(CAD)和外周动脉疾病(PAD)患者的恐惧且危及生命的后果。临床血栓形成进展并最终以激动剂通过细胞表面受体激活血小板(生化激活)为标志，最终导致血栓形成。残留心血管风险的一种解释可能是抗血小板药物的不可预测行为以及当前治疗无法缓解的剪切应力引起的持续血小板活化(生物力学活化)。
生物力学血小板活化改变了血小板表型，可能导致止血保护机制缺陷，同时允许高残留血小板反应性(HRPR)持续存在，这是血栓形成的风险因素。在已建立血管疾病的患者中，动脉中的斑块形成导致血流紊乱，引起生物力学血小板活化。我们先前在人类和小鼠中报道，心肌梗死(MI)后血小板反应性增加并持续存在，这凸显了血栓性疾病患者护理中的未满足需求。
OR(嗅觉受体)家族G蛋白偶联受体(GPCRs)代表18个基因家族和300个亚家族，编码细胞表面的跨膜GPCR。虽然ORs主要位于鼻上皮的感觉神经元中，但ORs也被发现异位表达在非嗅觉组织中，如气道平滑肌、肾脏、结肠和血管上皮以及角质细胞。异位OR表达调节重要的生理和病理过程，包括血压(BP)、气道平滑肌张力、血管张力和重塑，使ORs成为疾病新兴的治疗靶点。在人类识别的数百个ORs中，我们仅在血小板前体巨核细胞中发现了少数几个，而在健康成人血小板中仅4个。这为血栓性疾病的靶向治疗提供了机会。在成人血小板中识别的4个ORs中，OR2L13表达最高，并在血小板暴露于紊乱血流条件时从α颗粒转移到膜表面。本研究的主要目标是使用高通量筛选评估OR2L13作为可药物靶点，并研究迄今未被发现的嗅觉信号转导通路在血小板中通过现有抗血小板药物无法触及的机制限制血栓形成。
方法
人体受试者
健康受试者通过不涉及临床护理的协调员在获得知情同意后招募，使用以下方案：19-1451用于患者，20-413用于健康志愿者。从诊所招募了CAD和PAD患者以验证结果。用于从健康个体和血管疾病患者分离血液和研究血小板的生物库分别在ClinicalTrials.gov上注册为NCT05628948和NCT05628974。所有研究程序均按照赫尔辛基宣言和克利夫兰诊所批准的当地机构审查委员会方案进行。
实验动物
小鼠方案获得克利夫兰诊所机构动物护理和使用委员会批准。本研究使用6-8周大的雄性和雌性野生型FVB小鼠(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。如我们先前所述，从眶后收集到肝素化Tyrode's溶液中的血液用于血小板分离，以在激动剂刺激前使血小板保持静止状态。使用Abaxis HM5C & VS2全自动血液分析仪(Allied Analytic, LLC, Tampa, FL)分析从收集到EDTA管中的眶后血液测定全血细胞计数。所有小鼠实验的样本量通过功率计算确定。所有将药物与安慰剂比较的动物实验均以对实验者盲法方式进行。动物由研究者和训练有素的兽医技术人员每天监测两次，必要时由持证兽医评估痛苦、疾病和疼痛。
统计
数据根据分布和种群大小以平均值±标准误(SEM)或平均值±标准差(SD)表示，除非另有说明。通过Shapiro-Wilk检验评估正态性。对于两个比较组之间呈正态分布的数据，使用双尾Student t检验。对于非正态分布的数据，使用Mann-Whitney U检验。对于3个或更多组中呈高斯分布的数据，使用单向ANOVA后跟Bonferroni多重比较检验。否则，使用Kruskal-Wallis检验后跟Dunn事后校正。为确定2个分类自变量对单个连续因变量的影响并分析交互作用，使用具有混合效应模型(REML)的双向ANOVA与Geisser-Greenhouse校正，然后进行Tukey多重比较检验，其中测量值从同一动物在不同时间点获取。也使用具有Šidák多重比较检验的双向ANOVA。显著性接受为P值<0.05。使用GraphPad Prism 10(GraphPad Software)进行分析。
结果
非气味化合物激活OR2L13
我们先前报道了OR2L13在血小板中的激活通过气味分子(留兰香中的活性成分)增加cAMP。使用由OR激动剂激活的工程报告细胞系，OR2L13刺激后可检测到cAMP产生。我们筛选了一个已知激活GPCRs的非气味生物活性化合物库，以识别和测试抗血小板治疗的新方法。8K生物活性库筛选确定了169个初步命中(2.1%命中率，50μM剂量)，超过了25%阈值Z'，这是高通量筛选中每个板阳性对照和阴性对照之间统计分离度，且每板Z'>0.5。为限制细胞传代的变异性，数据与每板中的forskolin(阳性对照；直接激活腺苷酸环化酶合成cAMP)归一化。在使用载体HEK293-CRE细胞系的50μM浓度反筛中，我们验证了初始命中对OR2L13的特异性。12种化合物被确定为OR2L13的激动剂(CCF0051970, CCF0054500, CCF0057537, CCF0054432, CCF0053625, CCF0052884, CCF0053070, CCF0058399, CCF0056873, CCF0052249, CCF0058334和CCF0053066)。这12种化合物每种都显示出高于基线1.5倍以上的报告基因发光。在那12种化合物中，只有6种可用于商业合成和使用。确定了6种OR2L13特异性激动剂的EC50(CCF0054500, CCF0054432, CCF0053070, CCF0052249, CCF0051970和CCF0058399)。共享了6种领先化合物的化学结构。鉴于ORL13是GPCR，6种配体使用动态质量重分布以剂量反应方式进一步评估(6.25μM-50μM)。我们发现与载体相比，所有使用的化合物剂量下GPCR反应显著更高。总体而言，这些数据验证了6种领先非气味配体作为在血小板上表达的人类OR2L13的激动剂。
OR2L13非气味配体对血小板功能的影响
确定6种领先非气味化合物抑制血小板功能的功效。首先在富血小板血浆(PRP)和洗涤血小板中评估。最初，在PRP中使用光透射聚集测量法评估6种领先化合物对血小板抑制作用。血浆白蛋白可与化合物结合并降低其有效浓度，因此首先使用PRP评估每种化合物的功效。PRP在室温下与6种领先化合物(CCF0054500, CCF0054432, CCF0053070, CCF0052249, CCF0051970和CCF0058399)预孵育30分钟，然后用ADP(0.1μM)刺激。只有3种化合物(CCF0054500, CCF0052249和CCF0058399)在健康受试者中抑制了超过30%的ADP介导的血小板聚集。CCF0054500抑制健康受试者PRP中ADP介导的血小板聚集的EC50发现在低微摩尔范围内(14μM)。接下来，通过流式细胞术通过表面CD62P(P-选择素)表达进一步评估3种领先OR2L13化合物的抗血小板特性。通过α颗粒胞吐评估血小板活化同时探究多个血小板受体介导的活化通路(PAR1, P2Y12, 血栓素受体和GPVI[糖蛋白VI])。CCF0052249和CCF0058399未能通过所有常见通路抑制血小板活化。令人惊讶的是，CCF0054500抑制了激动剂介导的血小板活化(TRAP-6[凝血酶受体激活肽6；10μM]，ADP[10μM]，U46619[5μM]和CRP[胶原相关肽；0.5μg/mL])，通过所有评估的GPCRs，包括涉及Gαq和Gαi的受体，以及GPVI，表明在血小板ORs中先前未被发现的非经典下游信号传导介质。因此，CCF0054500因其在PRP和洗涤血小板中对血小板的抑制作用而被推进为OR2L13的有希望的非气味化学探针。
OR2L13激动剂在剪切应力下抑制体内血栓形成而不影响凝血
为评估CCF0054500在更病理条件下对血栓形成的影响，使用T-TAS01系统将CCF0054500重新引入健康受试者的全血中，在该系统中血液在不同大小的剪切应力下通过胶原涂层微流体通道。与载体相比，CCF0054500(100μM)在全血中减少了>50%的血栓形成，独特地在高动脉剪切率(1500s^-1)条件下，而非较低动脉剪切率(600s^-1)。由于CCF0054500抑制了来自人类的全血、分离的洗涤血小板和PRP中的血栓形成，我们接下来优先评估CCF0054500对凝血级联的影响，预期可能有出血副作用。使用血小板耗尽的血浆评估实时纤维蛋白(因子Ia)形成，这是凝血级联中最下游的组分。我们未观察到CCF0054500对从健康人类分离的血小板耗尽血浆中纤维蛋白形成的影响，通过体外测定的凝块生长速率或绝对凝块大小评估。
OR2L13激动剂抑制体内动脉血栓形成
为确定CCF0054500的生物利用度并评估跨物种功效，将该化合物引入FVB/NJ小鼠，该小鼠在血小板中表达高量的人类OR2L13正交基因olfr168，通过每日腹腔注射。这允许评估CCF0054500对体内止血和闭塞性血栓形成的影响。在连续每日CCF0054500(5mg/kg每日腹腔注射)剂量后，通过测量小鼠提睾肌血管中激光损伤引发的血栓形成，评估了血小板和纤维蛋白在血管内膜上随时间的积累。与载体对照治疗组相比，CCF0054500减少了88.9%的血小板在血管内膜上的积累。与在人类血浆中体外发现一致，小鼠中纤维蛋白形成不受CCF0054500影响(P=0.39)，表明CCF0054500在体内对凝血级联无影响。两种治疗的中位动脉损伤大小相似，表明观察到的差异是由于OR2L13/olfr168化学探针的结果。这些数据表明CCF0054500通过抑制血栓形成过程中的血小板积累来限制血栓形成，而不影响纤维蛋白形成。
OR2L13激动剂在血管阻塞条件下抑制体内血栓形成
血液上的机械应力导致体内血栓形成，可通过下腔静脉缩窄轻松评估。下腔静脉缩窄在缝合线近端产生紊乱血流，并使血液暴露于外部机械力和淤滞。FVB/NJ小鼠用CCF0054500(5mg/kg每日腹腔注射)治疗，随后进行下腔静脉缩窄。与载体治疗的小鼠相比，CCF0054500治疗的小鼠血栓大小平均减少了49%(血栓重量，8.20±2.6mg对15.98±5.0mg；P=0.0074)。CCF0054500治疗和载体治疗小鼠的血栓组成，包括红细胞(CD235a)、血小板(CD41)、白细胞(CD45)和纤维蛋白，相当。CCF0054500治疗后小鼠基线血细胞计数不变，说明对造血无毒性作用。最后，CCF0054500不影响止血，因为CCF0054500治疗小鼠的出血时间明显短于血小板耗尽的小鼠(抗CD41治疗，>9分钟)。血小板计数从抗CD41治疗前的555×10^9/L减少到治疗后的8.1×10^9/L(P<0.0001)。此外，CCF0054500治疗小鼠的出血时间与FVB野生型、杂合子(olfr168^+/-)或敲除(olfr168^-/-)小鼠相似，进一步表明CCF0054500对止血无影响。
CCF0054500降低心肌梗死后血小板反应性并改善心脏功能
抗血小板治疗仍然是急性冠脉综合征管理的基石，显著降低血栓风险并降低主要临床事件(如MI和死亡)的发生率。内皮损伤后血小板激活和聚集是急性冠脉综合征病理生理学的核心，当前抗血小板药物靶向不同血小板受体以减轻这些事件。抗血小板治疗是ST段抬高型MI后二级预防的关键组成部分，但已被证明在慢性CAD患者中仅提供部分保护。为确定CCF0054500是否发挥与已建立治疗相当的抗血小板作用，我们在左心室急性透壁MI后的小鼠模型中评估了MI前后血小板活化，其中MI未被挽救，以便在体内给予CCF0054500后研究MI环境中的血小板特性。在载体治疗的小鼠中，通过表面CD62P表达测量的血小板反应性(α颗粒胞吐的血小板活化)在MI后第3天仍显著升高。相比之下，CCF0054500治疗显著减弱了凝血酶诱导的CD62P表达(T0.25=27.10±2.0；T0.5=31.82±1.37；T1=33.91±1.69；P<0.0001)，与阿司匹林观察到的血小板抑制相当且略好，阿司匹林是MI中已建立的抗血小板药物。类似地，表面Jon/A抗体结合(糖蛋白IIb/IIIa的血小板活化)在载体治疗的小鼠中MI后对凝血酶增加浓度的反应显著增加。相比之下，CCF0054500治疗显著减弱了凝血酶诱导的Jon/A结合(T0.25=4.60±0.49；T0.5=5.29±0.38；T1=5.92±0.46；P<0.0001)，与阿司匹林观察到的减少相当且略好(T0.25=5.30±0.41；T0.5=5.79±0.67；T1=5.61±0.44；P<0.0001)。通过超声心动图评估载体、CCF0054500和阿司匹林治疗小鼠MI后的心脏功能。显示了每组的代表性M型图像，其中MI后进行性左心室扩张被CCF0054500预防，方式与抗血小板药物阿司匹林相似。通过射血分数评估的心肌收缩性能从基线(第0天，64.32%±0.79%)到MI后第3天(55.25%±2.68%)和第7天(50.30%±2.92%)在载体治疗组中进行性下降。相比之下，MI后接受CCF0054500治疗的小鼠射血分数保持不变(第0天，63.77%±0.83%；第3天，63.51%±2.03%；第7天，63.17%±1.17%；P=0.0078)和阿司匹林(第0天，63.80%±1.04%；第3天，64.47%±2.40%；P=0.033；第7天，61.69%±2.55%)。
同样，通过收缩分数评估的心肌收缩性能在载体治疗的小鼠中MI后下降。相比之下，CCF0054500治疗的小鼠在MI后表现出显著保留的收缩分数，在MI后第3天达到载体治疗值的121%(34.20%±1.64%对28.18%±1.62%；P=0.0260)，第7天为30%(32.52%±1.67%对25.16%±1.75%)，与阿司匹林治疗组相当(第3天20%，第7天33%)。在支持性数据中，MI后第7天CCF0054500治疗组的心输出量比载体治疗小鼠增加了40%(19.36mL/min±0.78对13.87mL/min±1.06)。提供了左心室尺寸和体积的额外测量。与心脏功能改善一致，CCF0054500治疗导致100% MI后存活，而阿司匹林治疗小鼠为75%，载体治疗对照为37.5%，在有限的观察队列中。引人注目的是，MI后血小板表面olfr168(OR2L13的小鼠正交基因)表达增加，可能增强CCF0054500的结合。CCF0054500治疗不影响MI后循环血细胞群体，表明化学探针对骨髓细胞发育无毒。与CCF0054500治疗的小鼠相比，阿司匹林治疗的小鼠在MI后出现轻度失血性贫血，只有阿司匹林导致血红蛋白下降，这与我们先前的研究一致，表明血小板OR2L13调节化合物不影响止血。
CCF0054500激活血小板HSP27并解聚丝状肌动蛋白细胞骨架
血小板活化几乎总是激活一系列蛋白激酶并引起蛋白质磷酸化事件，改变血小板反应性。为识别解释CCF0054500抗血小板作用的来自所有血小板受体的共同下游介质，我们首先使用无偏质谱方法探究人类血小板中的血小板磷酸蛋白质组。这些研究表明CCF0054500调节参与细胞骨架组织、肌动蛋白丝解聚和调节人类血小板中血小板细胞器的蛋白质。使用靶向磷激酶阵列，我们确定HSP(热休克蛋白)-27为CCF0054500刺激血小板后磷酸化的主要底物，特别是Ser78和Ser82位点。这一观察通过在不同组人类受试者中进行免疫印迹进一步验证。我们观察到CCF0054500(875nM-112μM)剂量依赖性地磷酸化HSP27的Ser15、Ser78和Ser82位点。
鉴于血小板整合素αIIbβ3(GPIIb/IIIa)作为从内到外的血小板活化共同介质的既定作用及其作为机械转导和血小板形状变化介质的已知作用，我们评估了血小板在纤维蛋白原基质上的铺展，这一过程已知依赖于丝状肌动蛋白细胞骨架的重组。用血小板丝状肌动蛋白(F-actin)和P-选择素共染色显示，CCF0054500处理损害了血小板在纤维蛋白原基质上的铺展，表现为与载体相比表面区域减少。为更好地转化先于血小板形状变化的血小板机械转导及其对血栓稳定性和生长的后续影响，我们评估了OR2L13介导的血小板形状变化和F-actin重组动力学。在使用从健康供体分离的洗涤血小板的体外凝块回缩试验中，评估了凝血酶激活的血小板在有无CCF0054500情况下的凝块回缩——这由纤维蛋白和肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架之间的相互作用驱动，并由机械传感器整合素αIIbβ3(GPIIb/IIIa)介导——与血小板活化程度和细胞骨架重组成比例。在存在凝血酶以激活血小板的情况下，定期拍摄有无CCF0054500的洗涤血小板图像，持续60分钟。凝血酶引起的血小板活化导致清晰且进行性的细胞骨架重组和凝块回缩，与载体相比，CCF0054500处理抑制了这一现象。为证明HSP27对这一生物力学过程的依赖性，添加了已知的HSP27抑制剂brivudine，完全消除了CCF0054500对凝血酶介导凝块回缩的保护作用。凝块回缩的定量分析显示，在所有测量时间点，载体处理和CCF0054500处理的血小板之间，以及CCF0054500和brivudine加CCF0054500处理组之间，存在稳健且统计学显著的差异。我们进一步验证了CCF0054500激活OR2L13、下游HSP27磷酸化以及最后导致抑制血小板反应性的血小板细胞骨架重组之间的关系。使用HSP27 Ser78抗体，对CCF0054500激活的血小板蛋白裂解物进行免疫沉淀，有或没有brivudine(HSP27抑制剂)预处理。在簇B中，样本2(用CCF0054500处理并用HSP27 Ser78抗体免疫沉淀的血小板)中，Rho GTPase介导的细胞骨架组织以及细胞-细胞外基质相互作用、细胞-细胞通信和细胞连接组织通路的蛋白质富集。相比之下，CCF0054500孵育前用brivudine(一种HSP27抑制剂)预处理消除了这些富集，表明HSP27磷酸化对CCF0054500驱动的细胞骨架信号传导至关重要。最后，为更好地理解F-actin解聚的生物能量学，对用CCF0054500(100μM)处理的健康受试者洗涤血小板进行体外肌动蛋白结合试验。CCF0054500加速了F-actin从血小板膜部分释放到可溶性上清部分，而不消耗球状肌动蛋白池，如考马斯亮蓝染色后的SDS-PAGE所示。这些发现证实，血小板OR2L13被CCF0054500激活通过非经典HSP27依赖通路促进F-actin解聚，从而降低血小板反应性。
OR2L13激动剂抑制血管疾病患者中的高残留血小板反应性
从接受抗血小板治疗的CAD或PAD患者中分离血小板。评估患者血小板通过4个主要血小板表面受体(PAR1, P2Y12, 血栓素和GPVI)激活的能力，有无体外CCF0054500孵育后用TRAP-6(10μM)、ADP(10μM)、U46619(5μM)和CRP(0.5μg/mL)刺激。尽管接受双重抗血小板治疗(阿司匹林和氯吡格雷)，CAD和PAD患者均显示HRPR，最明显通过血小板GPVI。在服用阿司匹林的PAD和CAD患者中，通过PAR1和血栓素受体以及GPVI也观察到持续血小板反应性。无论患者是否服用单一抗血小板治疗(仅阿司匹林或氯吡格雷)或双重抗血小板治疗(阿司匹林和氯吡格雷一起)，添加CCF0054500均抑制了PAD或CAD中血小板所有常见信号通路的HRPR。这表明血小板中存在下游OR2L13的非经典OR信号转导通路，作为共同收敛点，破坏通过所评估的不同受体通路的血小板活化。
评估了CCF0054500对78个GPCRs、离子通道和膜转运蛋白的脱靶效应，包括Gαs介导的cAMP产生、Gαq介导的Ca^2+动员、核激素受体转位和选定的配体门控K^+/Na^+通道(Eurofins)。在0.1至1000nM剂量范围内，CCF0054500表现出高特异性，对磷酸二酯酶E2、NAV1.5钠通道、大麻素受体2和烟碱乙酰胆碱受体D2观察到有限的非特异性效应。进一步在体内评估CCF0054500的脱靶效应。野生型和olfr168^-/-小鼠腹腔注射5mg/kg/天CCF0054500共3天。然后从血液中分离血小板并在体外刺激。我们观察到，当血小板活性由凝血酶诱导时，与载体治疗组相比，用CCF0054500预处理的野生型小鼠血小板中，通过常见血小板活化受体GPIIb/IIIa(Jon/A抗体结合)测量的血小板反应性受到抑制(P<0.0001)。虽然CCF0054500抑制野生型小鼠血小板，但并不抑制olfr168^-/-小鼠的血小板活化，证明CCF0054500对olfr168(OR2L13的小鼠正交基因)的特异性。尽管CCF0054500明显有助于一些cAMP产生，与通过Golf和通过腺苷酸环化酶激活产生cAMP的操作一致，但CCF0054500在血小板中缺乏cAMP介导的PKA磷酸化，以及CCF0054500对血小板反应性的持续抑制(在PKA抑制剂存在下)表明该通路不如CCF0054500通过HSP27的信号传导重要。
工作模型说明CCF0054500如何通过上游作用于血小板表面受体OR2L13和下游通过减少HSP27在Ser15、Ser78和Ser82上的磷酸化来降低血小板反应性。这种信号级联促进F-actin解聚肌动蛋白细胞骨架，并防止促血栓性颗粒与血浆膜融合(胞吐)。
讨论
本研究确定了一类新的抗血小板药物，通过血小板G蛋白偶联受体OR2L13(孤儿受体)通过非经典通路发挥作用。当OR2L13被CCF0054500激活时，血小板活化受到抑制，对止血或凝血级联无影响。CCF0054500在抑制来自人类和小鼠的分离血小板、富血小板血浆和全血中的血栓形成方面同样有效，表明保守的、跨物种的保护性信号传导通路。
双重抗血小板治疗，包括阿司匹林和P2Y12受体拮抗剂，根据既定指南为每位急性MI后患者开具处方。然而，一些患者对P2Y12拮抗剂氯吡格雷有抗药性。我们在几位服用抗血小板药物的CAD和PAD患者中发现HRPR明显，且添加CCF0054500的抑制与用于激活血小板的受体激动剂无关。给小鼠施用CCF0054500显示其完全生物可利用，独立于凝血级联中断，预防血小板介导的动脉和静脉血栓形成，而olfr168(小鼠OR2L13正交基因)的缺失在阿司匹林的小鼠模型中不会促进出血或导致失血性贫血。最后，在MI的小鼠模型中，观察到MI后数天持续HRPR，并被CCF0054500抑制，同时心肌功能改善，与阿司匹林治疗的小鼠相比——进一步强调了CCF0054500的抗血小板作用。
像OR2L13这样的额外血小板GPCR靶点的识别，结合CCF0054500这样的有前途的化学探针，提供了一种替代方法，以绕过氯吡格雷抗药性、阿司匹林治疗反应不佳或即使有氯吡格雷或阿司匹林仍复发临床血栓形成的患者中功能失调的血小板信号传导通路。包括阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂和特别是PAR1拮抗剂vorapaxar在内的处方抗血小板药物通过损害止血的保护性反应来预防血栓形成，这是对损伤的正常生理反应，限制过度出血。由于每种处方抗血小板药物都会损害止血并增加出血风险，临床医生通常被迫停止对血栓预防必不可少的抗血小板治疗，从而在患者管理中造成重大挑战。
CCF0054500减弱了处方药物靶向的所有血小板表面受体通路，对GPVI信号传导表现出显著的偏好。GPVI是众所周知的激活血栓形成的强大血小板信号转导通路，而不干扰止血的保护机制，这可能解释了CCF0054500的作用机制。小鼠模型的初步数据表明，我们的OR2L13激活化合物CCF0054500在体内系统可利用，并抑制血栓形成而不损害止血。目前可用的任何处方抗血小板治疗都无法实现这一效果。
使用非气味OR配体靶向OR的额外优势是它绕过了气味配体固有的几种化学限制。气味物通常不适合作为治疗剂，因为它们的挥发性和生物利用度差，限制了临床效用。此外，气味物表现出相当大的混杂性，在人类中激活约400个OR中的多个受体，从而损害特异性。虽然OR2L13刺激产生cAMP(图S12)，这是血小板的已知强效抑制剂，但我们发现CCF0054500激活的非经典通路通过共同下游介质HSP27发挥作用。HSP27似乎是CCF0054500抗血小板作用的主要机制解释，因为在引入HSP27抑制剂时，这种保护作用完全逆转。
热休克蛋白已作为血栓形成预防的有希望靶点出现，HSP47最近被证明可抑制固定人类和冬眠熊中的血栓形成。确实，HSP27先前被证明在活化的血小板中转位并与肌动蛋白细胞骨架作为磷酸化蛋白相关——这一机制在我们的研究中完全再现。另一项生化研究表明，在血小板中HSP在Ser15、Ser78和Ser82上的磷酸化损害了F-actin聚合——这一过程可通过突变这些位点防止磷酸化来逆转——尽管未评估对血小板活化的影响。我们的数据证实了这些先前的观察。血小板粘附到包被细胞外基质的表面上，触发一系列事件，如形状变化、伪足突起和铺展。用CCF0054500处理的血小板不在纤维蛋白原包被表面上铺展，CCF0054500解聚肌动蛋白丝。血小板中的肌动蛋白聚合允许伪足突起和片状伪足的形成和伸长，并可能控制促血栓性颗粒的调节性胞吐，这是本研究中改变的过程，为CCF0054500的抗血小板作用提供了机制解释。血小板中的伪足促进粘附并限制血流，导致血小板铺展和稳定血栓形成。我们当前的数据显示，当HSP27在Ser15、Ser78和Ser82上磷酸化时，它使长F-actin丝不稳定并解聚，这可能限制促血栓性颗粒与血浆膜的有效融合和随后的胞吐。这通过P-选择素释放显著减少和血小板聚集降低得到证明。因此，Ser15如Butt及其同事所示，可能是F-actin解聚的刺激物。另一项研究表明，从血小板释放的磷酸化HSP27促进活化，因此其在血小板内的存在可能防止去活化。
用CCF0054500处理的血小板的共免疫沉淀，使用HSP27-Ser78抗体，显示Rho GTPases、IQGAPs和formins激活相关通路的富集。Rho GTPases是肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子。IQGAPs通过其CH结构域结合F-actin，并通过调节球状肌动蛋白/F-actin平衡影响细胞形状和运动性。GPVI信号传导已知诱导血小板细胞骨架的深刻重组，这可能是观察到CCF0054500抗血小板作用在血小板被CRP激活后如此突出的原因。
在现有血管疾病患者中持续存在的动脉粥样硬化栓塞仍然是一个由持续血小板活化解释的问题。本研究的一个重要发现是，无论处方何种抗血小板药物，CAD和PAD患者的GPVI均观察到HRPR。GPVI是血小板活化的已知机械传感器。CCF0054500在1500s^-1的高剪切条件下防止胶原包被微流体系统中的血栓形成，但在600s^-1下不会，该系统促进通过GPVI的剪切介导血小板活化。这与我们的机制数据一致，即CCF0054500解聚肌动蛋白细胞骨架，理论上可能使血小板膜对促进较高剪切率下血小板活化的外部生物力学力不太敏感。我们先前证明OR2L13在健康血小板膜上在紊乱血流条件下易位，并在本研究中在小鼠MI模型中确认，其中MI后血小板表现出表面olfr168表达增加。这种机制可能存在于CAD和PAD患者中，揭示了CCF0054500独特的抗血小板特性——与现有治疗不同——突显了其作为同类首创药物的潜力。
我们的结果表明，CCF0054500抑制血小板反应性与单药抗血小板治疗或双重抗血小板治疗同样有效，并且它通过干扰所有细胞表面受体的血小板活化下游共同通路来独特地实现这一点。被处方氯吡格雷、阿司匹林或双重抗血小板治疗的患者通常表现出HRPR，这增加了缺血性血管事件的风险。本研究表明，CAD和PAD患者血小板中的HRPR可被CCF0054500有效抑制，CCF0054500似乎对其他GPCRs和离子通道等额外常见药物靶点的脱靶效应很少。当给予小鼠时，CCF0054500在低剂量下具有良好的暴露，预防多种动物模型中的血小板活化和血栓形成而不影响止血。这使得开发血小板OR2L13调节配体成为老年人抗血小板治疗的潜在创新替代方案，老年人对氯吡格雷和替格瑞洛均具有更高HRPR发生率。
血小板在动脉血栓形成和冠状动脉闭塞中起关键病理生理作用。据指出，即使在抗血小板治疗下，急性ST段抬高型MI后前6个月血小板反应性升高，并且这些患者作为二级预防的一部分在急性ST段抬高型MI后接受抗血小板治疗。CCF0054500在MI后成功抑制血小板反应性并改善体内心脏功能。
我们承认本研究的局限性，包括CCF0054500的EC50在低微摩尔范围内。正在进行对CCF0054500核心分子结构的微妙修饰，以优化化合物并启用传统药物样特性。此外，虽然我们显示CCF0054500的肠胃外给药在小鼠中是一种有效的抗血栓药物而不影响止血，但应优先考虑口服生物利用度，同时进行彻底的药代动力学研究，以更好地预测体内的药物行为。虽然CCF0054500在小鼠中不会增加出血，但目前尚不清楚该化合物在引入人类时是否会不利地影响止血。
总之，CCF0054500是识别出的首个用于激活OR并抑制血栓形成的非气味配体，通过解聚血小板肌动蛋白细胞骨架来限制血小板形状变化，无论激活血小板的机制如何。以这种方式靶向血小板OR2L13可能还具有额外优势，即预防病理条件下(如狭窄动脉粥样硬化疾病)或当血小板暴露于心源性休克患者外部机械心脏支持设备的外部剪切力时的生物力学血小板活化。
致谢
作者报告以下贡献：概念化，T.M.、J.L.、S.S.、V.P.J.和S.J.C.；方法学，A.A.、N.W.、M.Y.、Y.J.S.、Q.P.K.、R.S.、S.G.、M.G.、M.A.、H.E.P.、A.S.、J.G.、S.M.S.和S.J.C.；正式分析，A.A.和S.J.C.；调查，A.A.、N.W.、M.Y.、Y.J.S.、Q.P.K.、R.S.、S.G.、M.G.、M.A.、H.E.P.、A.S.、J.G.、S.M.S.和S.J.C.；患者和对照样本收集，C.J.、B.R.和A.S.；软件分析，N.S.；资源，S.J.C.；数据整理，A.A.、N.W.、M.Y.、Y.J.S.、Q.P.K.、R.S.、S.G.、M.G.、M.A.、H.E.P.、A.S.、J.G.、S.M.S.和S.J.C.；撰写—初稿，A.A.和S.J.C.；撰写—审阅和编辑，A.A.、N.W.、M.Y.、Y.J.S.、Q.P.K.、R.S.、S.G.、M.G.、M.A.、H.E.P.、A.S.、S.M.S.、J.G.、T.M.、J.L.、S.S.、V.P.J.和S.J.C.；可视化，A.A.；监督，S.J.C.；资金获取，S.J.C.。8000种生物活性化合物库和化合物的再合成由俄亥俄州克利夫兰诊所克利夫兰诊所治疗发现中心提供。我们感谢Anshul Mishra博士在分子克隆方面的协助。我们感谢Dave Schumick博士为文章制作中央图表。
非标准缩写和首字母缩略词：
- CAD：冠状动脉疾病
- CRP：胶原相关肽
- F-actin：丝状肌动蛋白
- GPCR：G蛋白偶联受体
- GPVI：糖蛋白VI
- HRPR：高残留血小板反应性
- HSP：热休克蛋白
- MI：心肌梗死
- OR：嗅觉受体
- PAD：外周动脉疾病
- PRP：富血小板血浆
- TRAP-6：凝血酶受体激活肽6
【全文结束】