心室心律失常和心脏性猝死是心房颤动(AF)患者的主要死因。本研究调查了AF如何促进心室心律失常。
与窦性心律(SR)患者相比，AF患者的心室肌细胞表现出增加的延迟后除极和钙波，这些是心室心律失常的已知触发因素。在小鼠心室肌细胞中进行的体外AF模拟证实了AF后心室促心律失常活动的增加。AF模拟后，小鼠心室肌细胞中氧化钙/钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)激活增加。具有CaMKII氧化位点基因消融的MMVV敲入小鼠在AF模拟后未发生心室促心律失常活动。本研究表明AF促进心室心律失常。这些发现为AF和心室心律失常的相互作用提供了新的机制见解。
心房颤动(AF)是全球最普遍的心律失常，目前影响超过3300万人，预计到2050年其全球负担将增加2-3倍。虽然AF患者的临床管理主要关注预防血栓栓塞事件和心力衰竭(HF)，但心脏性猝死(SCD)是AF患者的主要死因。如ARIC(社区动脉粥样硬化风险)研究等临床研究表明，AF与SCD之间存在独立且显著的关联，以及AF与心室颤动(一般人群中SCD的主要直接原因)之间的关联。尽管这一预后意义重大，与AF和中风之间已建立的因果关系相反，AF易导致心室心律失常的机制仍未得到充分理解。
AF主要被视为一种心房疾病，因此AF研究主要集中在心房上。因此，AF对左心室(LV)功能的影响在很大程度上仍未得到充分探索。临床证据表明，AF可能对LV功能产生有害影响，增加死亡率，并加重心力衰竭患者的发病率和死亡率。EAST-AFNET 4(早期心房颤动治疗预防卒中)研究表明，与单纯心率控制相比，早期节律控制可改善近期发作AF并伴有心血管疾病的患者的预后。这些发现强调了研究AF如何影响LV的机制的转化重要性，即使是在心率控制的情况下。
虽然AF与心房纤维化增加相关，但LV纤维化的研究显示AF患者与窦性心律(SR)患者之间没有差异。患者心室中缺乏结构重塑表明电生理重塑可能是AF对LV的有害影响的基础。在我们之前的工作中，我们证明了AF本身通过损害心肌细胞兴奋-收缩耦联的不良重塑而损害LV功能。重要的是，钠离子和钙离子稳态的改变已被认为与心室心律失常的发生有关。
本转化研究旨在调查AF是否促进心室心律失常。我们使用多种电生理技术分析人心室心肌中的心肌细胞电生理学，研究了AF对心室心律失常的影响。我们研究了接受主动脉瓣置换术治疗主动脉瓣狭窄(AS)且LV功能保留的患者，这些患者表现为心率控制的永久性或持续性AF或SR。考虑到患者队列中可能存在的混杂因素，如合并症和用药，我们进一步通过体外AF模拟研究了心率控制的AF对心室心律失常的影响。
方法
患者
本研究中的所有程序均按照赫尔辛基宣言中概述的伦理标准进行，并获得雷根斯堡大学(参考号31/9/00)和哥廷根大学(参考号10/9/15、21/10/00和21/2/11)当地伦理委员会的批准。所有参与患者均获得书面知情同意。LV心肌组织取自接受主动脉瓣置换术治疗AS的个体。研究包括SR患者以及临床诊断的永久性或持续性心率控制AF患者。LV组织从室间隔切除并立即放入冷却的心脏停跳液(4°C)中运输。详细患者特征见表1。
人心室心肌细胞的分离
将心室心肌在心脏停跳液中仔细清除纤维化组织。心肌细胞分离方法的选择取决于可用心肌标本的大小和完整性。对于较大的组织样本(>50-100 mg)，应用常规块状分离法，而对于小心肌样本(<30-50 mg)或体积有限的薄手术残留物，则优先使用组织切片辅助消化(TSAD)。块状分离如前所述进行。简而言之，组织使用两步胶原酶/蛋白酶方案在Joklik-最低必需培养基缓冲液中进行酶消化。初始消化(23分钟)使用0.9至0.95 mg/mL胶原酶(Worthington I型，315 U/mg)、0.23 mg/mL蛋白酶(Sigma-Aldrich，7-14 U/mg)和2 mg/mL牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)，随后进行第二次消化步骤(5-10分钟)，酶浓度调整为含0.58 mg/mL胶原酶和2.67 mg/mL BSA。收集释放的细胞，机械解离残留组织。细胞洗涤并重悬于含5 mg/mL BSA的Joklik-最低必需培养基溶液中。此过程重复5至8次以最大化产量。块状分离能够同时酶消化较大的心肌块，因此在有足够组织质量时具有优势。使用块状分离法，获得了较高的绝对细胞产量，约为每毫克组织80至150个心肌细胞，具体取决于样本质量和酶效率。
对于TSAD，心肌样本嵌入4%低熔点琼脂糖(Carl Roth)中，冷却，并使用薄层氰基丙烯酸酯胶粘在振动切片机标本架上。为了在最小化细胞损伤的同时最大化表面积与体积比，使用振动切片机(Leica Biosystems)生成300-μm切片，然后在无葡萄糖切片缓冲液中储存，随后从琼脂糖中轻轻分离并转移到含有洗涤液的培养皿中。应用逐步和受控的酶消化方案，包括酶暴露之间的中间洗涤步骤。最初，组织切片在含有1 mg/mL蛋白酶的溶液中孵育10分钟，随后用4 mg/mL胶原酶进行消化。在胶原酶阶段，定期在显微镜下观察培养皿以监测心肌细胞释放。一旦组织表现出明显的软化并可通过轻柔的机械操作解离，即通过添加含10 mg/mL BSA的停止溶液来终止消化。使用精细镊子轻轻撕开心肌纤维进行组织解离。TSAD开发的目的是通过增加表面积与体积比并实现更均匀的酶渗透，促进从小或有限的人心肌样本中分离心肌细胞。虽然TSAD通常产生的细胞数量较少(每毫克9-100个细胞)，与块状分离相比，但在组织可用性有限时，它提供了一种可靠的替代方法，并确保在此条件下可重复的分离。
根据既定的形态学标准评估细胞质量，包括杆状外观、清晰的横纹以及缺乏自发性收缩或高收缩性。先前的研究表明，包括TSAD在内的基于切片的分离方法可产生结构和功能特性与常规块状分离相当的心肌细胞，尽管绝对细胞数量较低。基于这些考虑，当心肌样本大小超过50 mg时使用块状分离，而当样本大小低于此阈值时使用TSAD，确保在广泛的心肌组织范围内一致的心肌细胞分离。
分离后，细胞外钙离子浓度逐渐提高到2 mmol/L。对于下游实验，仅选择表现出横纹的细长、非颗粒状心肌细胞。
小鼠心肌细胞分离和体外AF模拟
小鼠心室心肌细胞如前所述进行分离。通过逐步将细胞外钙离子浓度从0.1 mmol/L提高到1.4 mmol/L，逐渐重新引入钙离子。然后将分离的细胞在6孔板中培养，最终钙离子浓度为2 mmol/L。为了在体外模拟AF，使用培养刺激系统(C-Pace EM，IonOptix Corp)应用电场刺激，持续24小时。对照细胞以恒定频率60次/分钟进行规律起搏。相比之下，AF模拟是通过在相同平均速率(60次/分钟)下以40%的搏动间变异性进行不规则起搏来实现的，模拟正常频率AF。AF模拟中应用的搏动间变异性旨在反映AF患者中观察到的心室不规则性的临床模式。虽然小鼠体内心率明显更高，但分离的心肌细胞无法耐受小鼠体内观察到的高起搏频率持续较长时间，必要的刺激电压和脉冲持续时间将进一步损害细胞生理学。AF模拟进行24小时，因为长期体外培养成人的心室心肌细胞可能导致分离细胞的电生理和结构退化。刺激脉冲幅度设置在阈值以上10%-20%，以确保细胞有效捕获。在整个实验过程中，定期使用光学显微镜评估细胞活力和电刺激的有效性。
自发性后除极的记录
人心肌细胞和小鼠心肌细胞在含2 mmol/L钙离子浓度的Tyrode溶液中孵育在涂有层粘连蛋白的测量室中15分钟后开始测量。为了通过β-肾上腺素能刺激增强心律失常性后除极的发生率，小鼠心肌细胞的Tyrode溶液中包含100 nmol/L异丙肾上腺素。
使用2至4 MΩ的微电极，内部溶液含有：K-天冬氨酸122 mmol/L、KCl 8 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl₂ 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Mg-ATP 5 mmol/L和LiGTP 0.3(pH 7.2，KOH)。
使用破裂贴片全细胞电流钳技术测量动作电位，该技术在室温下持续使用电流脉冲(0.75-1 nA，2-6 ms)引发。破裂后，接入电阻通常保持在10 MΩ以下。在细胞贴附配置中补偿快速电容。贴片破裂后补偿膜电容和串联电阻。使用2.9-和10-kHz贝塞尔滤波器对信号进行滤波，并使用EPC10放大器(HEKA Elektronik)获取。对于自发性后除极的记录，使用30次/分钟的刺激周期，以及一个刺激方案，其中三重60次/分钟刺激期首先被10秒暂停打断，其次被30秒暂停打断，并计算延迟后除极(DADs)的发生率。
为了评估NCX抑制对DADs发生率的影响，心肌细胞在不存在或存在选择性钠钙交换体(NCX)抑制剂ORM-10962(1 μmol/L)的情况下灌注Tyrode溶液。暴露于ORM-10962的细胞与在相同条件下记录但未应用NCX抑制剂的心肌细胞进行比较。数据分析使用LabChart 8软件(ADInstruments)进行。
NCX电流的测量
在室温下以电压钳模式进行全细胞膜片钳记录，以测量NCX电流。膜片移液管(2-3 MΩ)填充有内部溶液，包含：10 mmol/L NaCl、40 mmol/L Cs-谷氨酸盐、90 mmol/L CsCl、0.36 mmol/L CaCl₂、1 mmol/L EGTA(细胞内Ca²⁺浓度调整为100 nmol/L)、5 mmol/L MgATP、10 mmol/L四乙基氯化铵(TEA-Cl)和10 mmol/L HEPES(pH调整为7.2，CsOH)。外部浴液包含：130 mmol/L NaCl、5 mmol/L CsCl、10 mmol/L TEA-Cl、1 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、1.8 mmol/L CaCl₂和0.02 mmol/L硝苯地平(pH调整为7.4，CsOH)。使用铯和TEA抑制钾电流，加入硝苯地平以抑制L型Ca²⁺通道。接入电阻通常<7 MΩ，并在膜破裂后3分钟开始记录，以允许细胞内溶液平衡。NCX电流使用从+80 mV到-120 mV的电压斜坡协议(持续4秒，斜坡速度50 mV/s)从-40 mV的保持电位引发。INCX定义为对NiCl2(5 mmol/L)敏感的电流，并标准化为膜电容以获得电流密度(pA/pF)。
共聚焦Ca²⁺火花测量
所有Ca²⁺成像实验均在微弱红光条件下进行，以最小化光漂白。Ca²⁺敏感染料Fluo-4 AM(Molecular Probes)通过将一个50-μg小瓶溶解在44.4 μL无水二甲基亚砜中来制备。从该储备液中，10 μL与1 μL Pluronic F-127反复移液混合，然后稀释在1 mL Tyrode溶液中，得到最终Fluo-4 AM浓度为10 μmol/L。将分离的心室心肌细胞铺在涂有层粘连蛋白的室中并允许沉降。然后将细胞与Fluo-4 AM装载溶液(500 μL用于人心肌细胞)在室温下孵育15分钟。孵育后，小心去除染料溶液，洗涤细胞，并添加Tyrode溶液进行额外15分钟。Ca²⁺火花记录使用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)在线扫描模式下进行。为确保足够的肌浆网Ca²⁺装载，在1 Hz连续场刺激后休息时获取记录。为最小化观察者偏倚，Ca²⁺火花分析以盲法方式进行。在分析前通过重命名文件标识符对原始图像文件进行匿名化处理。Ca²⁺火花的定量分析使用SparkMaster进行，这是一种用于ImageJ的经验证的自动分析插件，基于相对于基线荧光(F0)的统计定义阈值在线扫描图像中识别Ca²⁺释放事件，从而客观检测细胞内Ca²⁺的局部瞬时增加。
蛋白质印迹
使用体外起搏的小鼠心室心肌细胞评估蛋白质表达和氧化修饰。蛋白质变性在针对每个靶点特别定制的条件下进行。对于兰尼碱受体2型(RyR2)、RyR2-pS2814、磷脂兰(PLB)、PLB-pT17和肌浆网/内质网Ca²⁺-ATP酶2a(SERCA2a)，在10% β-巯基乙醇存在下在37°C下变性30分钟。对于Ca²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶IIδ(CaMKIIδ)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，在10% β-巯基乙醇存在下在95°C下变性5分钟。对于氧化CaMKII(CaMKII-Ox)，在95°C下变性5分钟，不添加还原剂，以保持对氧化敏感的表位。
蛋白质在不同丙烯酰胺浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，针对每个靶点的分子量进行了优化：RyR2和RyR2-pS2814(565 kDa)使用5%；CaMKII、CaMKII-Ox、SERCA2a和NCX(108 kDa)使用8%；PLB使用11%。电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，阻断后与相应的初级抗体孵育：抗RyR2(兔多克隆，1:1,000，Sigma)、抗RyR2-pS2814(兔多克隆，1:1,000，Badrilla)、抗SERCA2a(鼠单克隆，1:20,000，Thermo Scientific)、抗PLB(鼠单克隆，1:20,000，Invitrogen)、抗PLB-pThr17(兔多克隆，1:1,000，Badrilla)、抗CaMKIIδ(兔多克隆，1:10,000，Thermo Fisher)、抗NCX1(鼠单克隆，1:1,000，Abcam)和抗GAPDH(鼠单克隆，1:10,000，Sigma)。使用兔多克隆抗-氧化CaMKII抗体(1:1,000，GeneTex)研究了CaMKII在281和282位点甲硫氨酸残基(Met281/282)的氧化。
膜在4°C下与初级抗体孵育过夜，然后在室温下与适当的辣根过氧化物酶偶联的次级抗体孵育1小时：驴抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白(1:10,000，GE Healthcare)。使用Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物(Millipore)在Bio-Rad ChemiDoc MP系统上进行化学发光检测。使用ImageJ2(Fiji distribution，GitHub)进行条带强度的密度测定分析。蛋白质印迹信号使用来自同一只小鼠的成对样本(AF模拟vs对照)进行量化。不完整的配对从分析中排除。
统计分析
临床和实验数据以个体受试者(患者或小鼠)水平呈现。连续变量报告为均值±标准差或中位数(第一四分位数-第三四分位数)，视情况而定。分类变量以绝对数和百分比呈现。
在适用的情况下，使用Shapiro-Wilk检验评估连续变量的正态分布。对于具有正态分布数据的两个独立组之间的比较，使用非配对双尾Student's t检验。配对分析使用配对双尾Student's t检验进行。对于非正态分布数据，应用非参数Mann-Whitney U检验。使用卡方检验或Fisher精确检验(视情况而定)比较分类变量。这些统计分析和数据可视化使用GraphPad Prism版本10.0(GraphPad Software)进行。
进行单变量线性回归分析，以评估结果变量DADs/min与临床相关协变量之间的关联。在单变量分析中评估了以下变量：年龄(年)、性别、体重指数(BMI，kg/m²)、肾小球滤过率(GFR，mL/min)、糖化血红蛋白(HbA1c，%)、左心室射血分数(LVEF，%)、B型利钠肽(BNP，pg/mL)、主动脉瓣平均梯度(mm Hg)以及AF的存在(是vs否)。
构建了一个多变量线性回归模型，以评估AF与DADs/min之间的独立关联。鉴于样本量有限，多变量模型中包含的协变量数量受到限制，以避免过度拟合。最终的多变量模型包括AF(是vs否)、BMI、年龄、性别、GFR、HbA1c、LVEF和BNP。仅在回归分析中包含与DADs/min相关数据在20名以上受试者(n > 20)中可用的变量。所有回归分析均报告回归系数(B)及其相应的95%置信区间。双侧P < 0.05被认为具有统计学意义。所有回归分析均使用Stata(StataCorp)进行。
结果
患者特征
本研究调查了25名SR患者和16名持续性或永久性AF患者的LV心肌。患者特征总结见表1。总体而言，基线特征和合并症在两组之间具有可比性。SR和AF患者之间的年龄无显著差异(66.6±8.2 vs 69.2±15.6年)，BMI或肾功能也是如此。心率在两组之间没有显著差异(SR：65.0[第一四分位数-第三四分位数：64.0-71.0]次/分钟；n=15 vs AF：71.5[第一四分位数-第三四分位数：65.0-83.8]次/分钟；n=10)，允许评估主要独立于心动过速的AF相关效应。
LVEF在两组中均保留且具有可比性(SR：59.0%[第一四分位数-第三四分位数：54.5%-60.0%]；n=25 vs AF：60%[第一四分位数-第三四分位数：50.0%-60.0%]；n=15)。通过主动脉瓣面积和平均跨瓣梯度评估的AS严重程度，以及诸如室间隔厚度等同心重塑指标，在SR和AF患者之间没有显著差异。相比之下，左心室舒张末期内径在AF组中显著更大(SR：47.1±6.2 mm vs AF：54.9±8.5 mm；P = 0.007)。包括β-受体阻滞剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂、利尿剂和他汀类药物在内的用药在两组之间没有统计学差异。
为了确定DAD频率的临床决定因素，进行了单变量和多变量线性回归分析；然而，由于本研究中患者数量较少，这些分析可能受到限制。在单变量分析中，AF的存在与DAD频率增加显著相关(B = 7.33；95% CI：1.33-13.32；P = 0.020)。相比之下，DAD频率与BMI、年龄、男性性别、GFR、LVEF、BNP(pg/mL)或主动脉瓣平均梯度之间未观察到显著关联。在多变量分析(n=22)中，调整了AF、BMI、年龄、性别、肾功能、血糖控制、LVEF和BNP后，AF仍与DAD频率独立相关(B = 8.35；95% CI：0.84-15.86；P = 0.032)。包括BMI、年龄、男性性别、GFR、HbA1c、LVEF或BNP在内的其他协变量均未显示与DAD频率的独立关联。
AF增加人心室心肌细胞中促心律失常触发物的发生
我们通过分离人心室心肌细胞进行膜片钳研究，调查了AF是否与心室心律失常相关。DADs(图1B)，这些不规则的细胞去极化可引发自发性动作电位，并且是促进心室心律失常的公认细胞心律失常触发物，在AF患者的心肌细胞(n=11；44个心肌细胞)中比SR患者(n=15；59个心肌细胞)中显著更频繁地发生(图1C)。我们的电生理学发现通过共聚焦Ca²⁺成像得到证实，后者显示自发性Ca²⁺波的发生率更高——肌浆网的主要不规则舒张期Ca²⁺释放事件(图1D)。值得注意的是，AF患者的心肌细胞(60个心肌细胞；n=5)中有20%表现出心律失常事件，而在SR组(134个心肌细胞；10名患者)中只有7.2%的细胞表现出此类异常(图1E)。由于舒张期Ca²⁺可通过NCX诱导去极化内向电流，Ca²⁺波的增加可能是AF心肌细胞中观察到的细胞DADs的基础。这些来自人心室心肌的数据表明，AF患者表现出心室促心律失常触发物，这可能有助于增加心室心律失常和SCD的风险。
体外模拟AF诱导小鼠心室心肌细胞中促心律失常机制
我们试图在此基础上，研究AF对LV心肌细胞心律失常的影响，该影响独立于心率。为减轻患者中如用药和合并症等因素的影响，我们研究了接受模拟传导AF的不规则起搏的小鼠心室肌细胞。重要的是，我们选择体外系统进行AF模拟，因为大多数体内动物模型不会自发发展为持续性/永久性AF。体内起搏在动物中不足以模拟通过正常房室结传导的不规则心室兴奋。事实上，体内心室起搏本身就可能由于心室不同步而损害心室功能。在本研究中，我们使用小鼠成人的心室心肌细胞，因为不成熟的心肌细胞模型，如诱导多能干细胞心肌细胞，由于内在的去极化和自发搏动，对研究心律失常有限制。
通过在平均刺激频率为60次/分钟时使用40%的搏动间变异性(图2A)来模拟人类正常频率AF。我们未观察到电起搏24小时对细胞活力的有害影响(补充图1)。与相同速率下的规律起搏相比，AF模拟增加了心室心肌细胞中DADs的发生率(图2B)，AF模拟的心肌细胞(22只小鼠；46个心肌细胞)与规律起搏条件(22只小鼠；51个心肌细胞)相比，DADs增加了65%(图2C)。
我们接下来进行了共聚焦Ca²⁺成像(图2D和2E)，并重现了在人心室心肌细胞中观察到的发现：表现出促心律失常Ca²⁺事件的心室心肌细胞比例从对照组(172个心肌细胞；22只小鼠)的22.7%显著增加到AF模拟后(175个心肌细胞；21只小鼠)的40.0%(图2F)。此外，AF模拟导致舒张期Ca²⁺泄漏和Ca²⁺火花频率显著升高，表明钙处理紊乱(对照：22只小鼠；172个心肌细胞vs AF模拟：21只小鼠；175个心肌细胞)(图2G和2H)。此外，AF模拟的心肌细胞中总体Ca²⁺火花大小显著增加，而单个Ca²⁺火花参数无显著变化(图2I至2L)。这些结果证明了不规则起搏对心室心肌细胞的促心律失常作用，这可能解释了正常频率人类AF情况下心室心律失常的增加。
小鼠心室心肌细胞中AF模拟增加氧化CaMKII激活
为阐明观察到的钙处理改变的分子机制，我们对关键钙调节蛋白进行了蛋白质印迹分析。24小时AF模拟导致总CaMKII表达显著上调，并伴随CaMKII在调控氧化位点Met281/282处的氧化增加31.2%(每组10至12只小鼠)(图3A至3C)。
由于CaMKII氧化已知会导致CaMKII活性增加，从而增强钙处理蛋白的磷酸化，我们接下来评估了RyR2的表达和磷酸化状态。AF模拟诱导RyR2表达显著增加，同时在CaMKII依赖性Ser2814位点的磷酸化增加(n=11)(图3D至3F)，与RyR2开放概率增加和肌浆网促心律失常性舒张期Ca²⁺释放一致。我们将这些分析扩展到其他CaMKII下游靶点。虽然总PLB表达保持不变，但AF模拟后PLB在CaMKII特异性Thr17残基处的磷酸化显著增加(n=9至10)(图3G至3I)，与CaMKII激活增强一致。AF模拟的心肌细胞中SERCA2a蛋白表达显著降低(n=11)(图3J至3K)，这可能进一步导致舒张期Ca²⁺水平升高。总体而言，这些发现表明AF模拟在心室心肌细胞中诱导氧化CaMKII激活，导致RyR2等关键下游靶点的过度磷酸化，这可以解释Ca²⁺循环中促心律失常的改变。
AF模拟增强NCX表达和功能
NCX是响应(空间时间上的)增加的Ca²⁺水平(例如在舒张期Ca²⁺波期间)产生去极化内向电流的主要贡献者。因此，我们评估了24小时AF模拟后小鼠LV心肌细胞中NCX的表达和功能。蛋白质印迹分析显示，与对照条件相比，AF模拟后小鼠心室心肌细胞中NCX蛋白表达显著增加19.3%(n=12)(图4A和4B)。为确定AF模拟是否也导致NCX功能增加，使用全细胞电压钳记录测量了NCX电流(图4C)。定量分析显示，在AF模拟的心肌细胞(4只小鼠；6个心肌细胞)中，-80 mV和+40 mV处的NCX电流密度与对照(5只小鼠；6个心肌细胞)相比显著增加(图4D和4E)。此外，NCX电流-电压关系的斜率(反映NCX电导)在AF模拟后显著增加，表明整体交换活性增强(图4F)。接下来，我们测试了NCX抑制是否可以防止细胞心律失常。在全细胞电流钳记录中，接受24小时AF模拟的小鼠心室心肌细胞(8只小鼠；16个心肌细胞)表现出高DADs发生率。相比之下，用选择性NCX抑制剂ORM-10962(1 μmol/L；n=10；18个心肌细胞)处理的心肌细胞表现出DADs发生率显著降低，对应减少76.4%(图4G和4H)。总之，这些发现将增强的NCX活性确定为AF诱导的心室心律失常的关键贡献者，从机制上将增加的舒张期Ca²⁺释放与后除极的发生联系起来。
遗传消融CaMKII氧化可防止AF诱导的心律失常
为测试氧化CaMKII激活对AF后心室心肌细胞心律失常的因果相关性，我们使用了缺乏调控CaMKII氧化位点Met281/282(MMVV)的敲入小鼠。在这些小鼠中，CaMKII的氧化易感性甲硫氨酸残基被缬氨酸取代，使激酶对氧化修饰具有抗性。与C57BL6小鼠心肌细胞相反，AF模拟对MMVV心室心肌细胞中DADs的发生率没有影响(AF模拟：6只小鼠；22个心肌细胞vs对照：8只小鼠；27个心肌细胞)(图5A和5B)。
用于检测自发Ca²⁺释放的共聚焦成像进一步证实了消融CaMKII氧化的保护作用。表现出心律失常Ca²⁺事件的心肌细胞百分比(图5C)在对照(15%，102个心肌细胞；13只小鼠)和AF模拟(20%，110个心肌细胞；13只小鼠)之间保持不变(图5D)。类似地，与MMVV心肌细胞中的对照起搏(13只小鼠；102个心肌细胞)相比，AF条件(13只小鼠；110个心肌细胞)下Ca²⁺火花频率或舒张期SR Ca²⁺泄漏均未升高(图5E和5F)。此外，对Ca²⁺火花形态的详细分析显示，对照和AF模拟的MMVV细胞之间的火花大小、幅度、持续时间和宽度无显著差异(图5G至5J)。这些发现强调了氧化CaMKII激活在AF诱导的心室促心律失常中的作用，并将CaMKII氧化确定为潜在的治疗靶点。
讨论
心室心律失常是AF患者死亡的主要原因，临床研究确定SCD是该人群的主要死因。最近的数据表明，AF与心力衰竭伴射血分数保留患者中的心室心律失常和心脏骤停密切相关。即使在调整了共享的心血管风险因素后，AF与SCD之间的关联仍然显著。因此，AF也被确定为心室心律失常的独立风险因素。一项前瞻性研究表明，持续性AF与植入式心律转复除颤器治疗心室心律失常的发生率较高独立相关。这种效应可能主要由不规则心室激活驱动，特别是长短短序列，而非基础心率。尽管存在这种关联，但AF如何导致潜在的致命性心室心律失常的机制仍未得到充分理解。在我们的转化研究中，我们研究了正常频率AF如何通过氧化CaMKII激活和Ca²⁺紊乱在心室心肌细胞中引发心律失常级联反应，导致自发性去极化。这种自发性活动可能导致早搏/早搏，可作为自发性局灶性触发物，或导致传导/复极化异质性，这对折返是必要的。
虽然我们的患者队列具有保留的射血分数，但我们对人心肌的观察可能受到临床合并症和用药的影响。使用我们在野生型小鼠LV心肌细胞中的AF模拟模型，我们证实，AF的不规则心室反应，独立于心动过速且在没有合并症或用药的情况下，足以诱导心室心律失常。我们发现，AF后心室心肌细胞中的促心律失常级联反应是由氧化CaMKII激活促进的，导致钙处理蛋白的过度磷酸化。然而，其他CaMKII依赖性和/或独立途径也可能受到AF的影响，应在未来的研究中予以考虑。尽管先前的工作描述了AF心室中的兴奋-收缩耦联和收缩力缺陷，但本研究提供了AF促进心室心律失常的首次转化和机制证据。本研究的关键进展包括在AF患者心室中识别出增加的心律失常触发物、对NCX依赖性心律失常的机制见解，以及在MMVV小鼠中的因果遗传验证。
我们的发现可能为节律控制治疗如何使AF患者受益提供新的机制原理。节律控制策略已被证明可显著改善AF患者的预后，这由几项里程碑式的临床试验证实。值得注意的是，EAST-AFNET 4试验表明，在近期发作AF的患者中，早期节律控制可降低心血管事件，与心率控制相比。同样，CASTLE-AF(导管消融与标准常规治疗在左心室功能障碍和心房颤动患者中的比较)试验强调，导管消融不仅能改善症状，还能降低心力衰竭伴射血分数降低和合并AF患者的全因死亡率。APAF-CRT(消融和起搏治疗心房颤动-心脏再同步治疗)试验暗示了规则化心室起搏在降低发病率和死亡率方面的可能作用。鉴于心室心律失常是AF患者死亡的主要驱动因素，我们的数据进一步强调了AF中心律失常性心室激活的有害影响。
靶向CaMKII氧化可能提供一种潜在的治疗途径，特别是对于不符合导管消融条件或无法恢复窦性心律的AF患者。先前的研究表明，减少活性氧可改善钙处理。此外，CaMKII抑制在临床前模型中显示出抗心律失常作用。一般CaMKII抑制剂通常缺乏特异性并导致全身副作用。相比之下，使用CRISPR-Cas9等基因编辑技术特异性消融CaMKII氧化位点可以实现局部、心脏特异性的治疗方法。
结论
我们的研究支持AF不仅是心房疾病，而且是一种影响整个心脏的疾病的观点。心室心律失常是我们社会中的主要死因。AF在促进心室心律失常方面的作用具有重要的临床意义，值得进一步调查。
医学知识能力： 临床试验表明，维持窦性心律可改善AF患者的死亡率。虽然中风和心力衰竭是AF临床上公认的并发症，但AF对心室心律失常和潜在SCD的影响理解不足。我们的研究确定AF促进心室心律失常。对人心脏和小鼠心室心肌的电生理研究首次揭示了基于心室心肌细胞心律失常性兴奋的AF中增加的细胞心律失常触发物。这些机制是心室心律失常的公认驱动因素。
转化展望： 需要未来的研究来表征AF体内促心律失常的心室表型，并评估窦性心律恢复对室性心动过速和心室颤动的影响。我们的研究强调了AF的一种被低估但可能对预后有影响的并发症。需要进一步的工作来定义对AF患者临床管理的潜在影响。
缩写和首字母缩略词
AF = 心房颤动
AS = 主动脉瓣狭窄
CaMKII = 钙/钙调素依赖性蛋白激酶II
DAD = 延迟后除极
EF = 射血分数
HF = 心力衰竭
LV = 左心室
NCX = 钠钙交换体
PLB = 磷脂兰
RyR2 = 兰尼碱受体2型
SCD = 心脏性猝死
SERCA = 肌浆网/内质网Ca²⁺-ATP酶
SR = 窦性心律
TSAD = 组织切片辅助消化
致谢
作者感谢D. Riedl、J. Heine和Y. Metz的技术协助。图1至5中的人和小鼠象形图是在BioRender中创建的(Pabel, S. [2026]
资金支持和作者披露
Spangler博士获得了德国心脏病学会的资助。Bapat博士获得了NIH K08HL171874的资助。Maier博士获得了德国研究基金会(DFG)SFB TR374、DFG资助MA 1982/11-1和欧盟资助(Horizon 2020)STRATIFY-HF ID 101080905的资助。Sossalla博士获得了德国研究基金会(DFG)通过研究资助SO 1223/4-1和F. Thyssen基金会(Az 10.19.2.026MN)的资助。Wachter博士获得了德国研究基金会WA 3075/6-1/-2/-3的资助。Pabel博士获得了Else-Kröner-Fresenius基金会、德国心脏基金会/德国心脏研究基金会、雷根斯堡大学(ReForM A计划)和德国研究基金会(DFG)Walter Benjamin计划(#530157297)的资助；他还受雇于诺华生物医学研究所。
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