摘要：颗粒蛋白前体基因（GRN）的遗传突变导致额颞叶痴呆和溶酶体贮积病。通过对成年杂合致病性颗粒蛋白变异（GRN +/-）携带者的死后脑组织进行单核RNA测序，发现小胶质细胞、吞噬作用以及吞噬受体MERTK和AXL的失调。外源性颗粒蛋白前体调节人诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞中的MERTK和AXL RNA表达，而与GRN突变状态无关，且不直接与MERTK或AXL蛋白结合。我们生成了双敲除小鼠，发现Grn和Mertk的组成型纯合缺失（Grn -/-; Mertk -/-）可挽救小胶质细胞疾病特征，而Grn和Axl的组成型纯合缺失（Grn -/-; Axl -/-）则加重小胶质细胞疾病特征并增加脂褐素。较低的脑脊液MERTK但非AXL与较低的颗粒蛋白前体水平相关。此外，有症状的额颞叶痴呆患者的脑脊液MERTK较低，但无症状患者并非如此，而AXL在这两种状态下没有变化。这些数据部分解释了GRN-FTD中的炎症现象，并适用于其他炎症状态，其中PGRN、MERTK和AXL在神经退行性疾病之外发挥调控作用。GRN、MERTK和AXL之间的相互作用开辟了干预这一炎症轴的新治疗途径。
介绍：MERTK和AXL是巨噬细胞和小胶质细胞的吞噬受体，负责在凋亡或炎症刺激下维持体内平衡。MERTK持续表达，特别是在稳态条件下对凋亡细胞的束缚和清除尤为重要。AXL在炎症刺激下动态上调，且比MERTK更能抑制Toll样受体和细胞因子信号传导。由于以下原因，MERTK和AXL在神经退行性疾病中引起了关注：AXL在包括阿尔茨海默病在内的疾病中上调，而MERTK在稳态小胶质细胞中更丰富，并已被证明介导α-突触核蛋白的吞噬作用。此外，AXL调节APOE，这是阿尔茨海默病发病机制中的关键蛋白质和风险基因，MERTK和AXL与TREM2共表达，后者是阿尔茨海默病的另一个遗传风险基因。总体而言，新兴证据表明MERTK和AXL的失调是神经退行性疾病和神经炎症广泛共享的特征。我们在此报告了对另一种导致痴呆的基因GRN的研究，并确定吞噬受体MERTK和AXL是GRN失调发病机制的一部分。
结果：颗粒蛋白前体缺乏的额颞叶痴呆患者的死后脑组织显示吞噬作用失调的证据。我们在7名GRN +/-单倍剂量不足突变患者和8名无神经系统疾病的GRN +/+年龄对照组的额上回进行了单核RNA测序。尽管大多数细胞类型的比例在两组之间相似，包括兴奋性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和内皮细胞，但在额颞叶痴呆患者中少突胶质细胞的比例较高，而小胶质细胞和抑制性神经元的比例较低。所有分离的细胞类型在GRN-FTD和对照患者之间显示出大量差异表达基因。鉴于小胶质细胞增生和神经炎症是GRN-FTD已确立的病理特征，我们对小胶质细胞的差异特别感兴趣。GRN-FTD中的小胶质细胞显示出与疾病状态一致的基因表达谱，包括APOE、CTSB、TLR2、RPS19、MYO1E等的表达增加。小胶质细胞表达模式的差异映射到吞噬作用和炎症信号传导途径的上调。除了失调的吞噬途径，我们注意到IL-10信号是最上调的途径，IL-7信号也上调。IL-10和IL-7已知调节MERTK和AXL吞噬受体。确实，我们发现MERTK在GRN-FTD中显著转录上调，而AXL表达在两种条件下没有显著差异。
讨论：人类GRN突变携带者的大脑和GRN-FTD动物模型中微胶质细胞增生的证据，相较于散发性和其他突变驱动的额颞叶痴呆病例更为明显，表明微胶质细胞是GRN-FTD的关键病理因素。我们使用来自GRN +/-突变携带者的单核转录组学复制了这些发现，并在我们的Grn KO动物模型中得到了验证。进一步研究发现，微胶质细胞稳态的关键吞噬受体和调节因子MERTK和AXL以特定和复杂的方式与PGRN相互作用。我们的研究结果对于GRN-FTD的疗法和生物标志物开发具有重要意义。
PGRN调节MERTK和AXL但不与它们直接结合。我们在此报道的研究使用了来自GRN +/- FTD患者的死后组织和患病前功能测量，以及PGRN缺乏的细胞和小鼠模型，鉴定了PGRN、吞噬作用和吞噬受体MERTK和AXL之间的重要相互作用。这种相互作用并不像蛋白质-蛋白质结合那么简单，因为我们发现在生化实验中PGRN既不与MERTK也不与AXL结合。此外，PGRN不与GAS6结合，这反驳了先前关于PGRN-GAS6直接结合的报告。在我们的优化实验过程中，我们注意到GAS6倾向于非特异性地吸收到SPR流动系统和传感器表面，从而产生假阳性信号。我们添加了0.1% BSA作为载体蛋白以消除非特异性结合。此外，Fujita等人未报告Gas6的固定量，这使得难以解释他们观察到的PGRN结合是否有生理相关性。在我们的条件下，我们没有观察到PGRN和GAS6之间的相互作用。由于我们的发现与先前发表的发现之间存在差异，我们还通过SPR竞争实验和免疫沉淀确认了PGRN和GAS6结合的缺失。我们确信在这些直接蛋白质相互作用实验中，PGRN在生理条件下不直接与GAS6、AXL或MERTK结合。
相反，我们发现在死后人类样本和人类细胞模型中，PGRN缺乏导致MERTK而非AXL的转录上调。我们观察到吞噬作用和炎症信号传导的上调可能驱动MERTK上调或由MERTK上调引起，因为这些途径已知调节MERTK。在蛋白质水平上，症状性GRN-FTD患者的脑脊液中MERTK而非AXL降低，并且在人类诱导的小胶质细胞中也降低，但在GRN +/-和GRN +/+个体的死后脑组织中没有差异。脑脊液和死后MERTK水平之间的差异可能反映了MERTK表达的下调、分泌或释放减少，或疾病中MERTK的主动保留。这种MERTK的降低是补偿性的还是致病性的仍有待研究。相比之下，突变携带者的脑脊液和诱导的人类小胶质细胞中AXL水平与对照组相当，但在死后组织中AXL升高。我们不能排除死亡过程本身和死后间隔也可能影响MERTK和AXL水平的可能性。
由于MERTK水平在基因携带者出现症状后而不是之前在脑脊液中下降，较低的MERTK水平可能表明疾病转化。PGRN对MERTK的差异调节以及MERTK作为生物标志物的潜力最好在活体人类中纵向研究，这也将区分MERTK表达的变化是补偿性的还是致病性的。此类信息对于GRN缺乏的额颞叶痴呆疗法至关重要，但也适用于GRN上调或过度表达的疾病状态，如组织损伤、败血症、糖尿病和癌症。有趣的是，较低的脑脊液MERTK而非AXL不仅区分了症状性GRN +/-携带者与无症状携带者，还区分了MAPT和C9ORF72突变携带者的症状性和无症状阶段，表明它可能是症状性额颞叶痴呆转化的生物标志物。我们希望我们的数据能够激发将脑脊液-MERTK作为症状性额颞叶痴呆发作的生物标志物测试，并在GRN-FTD中测试MERTK调节剂。
PGRN、MERTK和AXL之间的复杂相互作用。我们的小鼠数据显示，PGRN与MERTK或AXL的相互作用是相反的；Mertk的纯合缺失保护了单独Grn缺失引起的微胶质细胞疾病表型，而Axl的纯合缺失则加重了Grn-/-疾病表型。令人困惑的是，稳态标记（Mertk）的丧失纠正了疾病表型，而疾病响应标记（Axl）的丧失则加重了它；然而，在其他情况下已证明Mertk的丧失是有益的。在病毒感染的动物研究中，Mertk的纯合敲除增加了小鼠的存活率。这归因于通过降低Mertk诱导的IL-10和TGF-beta生产来降低先天耐受性，从而允许继续对病毒的免疫攻击。在社交剥夺的小鼠模型中，星形胶质细胞Mertk的基因消融防止了兴奋性突触的吞噬作用和行为症状。在我们在此报告的动物模型中，Mertk与Grn的相互作用似乎是形成疾病相关小胶质细胞的关键检查点。在PGRN缺乏状态下如GRN-FTD中，MERTK抑制是否具有治疗潜力取决于疾病相关的小胶质细胞增生是有益还是有害。
我们的研究结果对其他疾病状态具有重要意义，最显著的是阿尔茨海默病，但也包括糖尿病、癌症、感染和炎症，其中已知改变的PGRN起因果或关联作用。我们之前已经展示了PGRN的丧失加速了阿尔茨海默病模型中的病理状态，并且GRN突变是阿尔茨海默病的风险基因。在一个过表达AD模型中，Mertk、Axl或两者的丧失减少了小胶质细胞介导的病理标志（致密核心斑块）。在这里我们展示了包括在AD小鼠模型中描述的APOE在内的疾病相关基因在人类GRN-FTD小胶质细胞和Grn-KO小鼠小胶质细胞中均上调。这种疾病机制的重叠支持了痴呆中的共同途径。我们假设PGRN与MERTK和AXL的相互作用将具有更广泛的影响，包括尚未调查的其他疾病状态。
Axl敲除对小鼠白质小胶质细胞增生和中间神经元的意外影响。我们注意到主要的小胶质细胞增生发生在丘脑周围的白质束（穹窿、终纹、大脑脚）。随着人类小胶质细胞亚群分析中髓鞘形成途径失调的额外发现，这些数据表明Axl调节少突胶质细胞群体和髓鞘形成。详细研究GRN和AXL缺乏在少突胶质细胞中的相互作用是必要的。最后，可能最令人惊讶的发现是由纯合Axl敲除驱动的丘脑中间神经元丰富群体（定义为Kcnip4、Ntng1、Kcnc2的表达）的几乎完全丧失。这一意想不到的发现表明Axl对这些细胞的生存或身份至关重要，据我们所知，这种相互作用尚未被报道。我们和其他人之前发现Grn-KO小鼠表现出纹状体和丘脑的过度兴奋，可能是因为抑制性突触的优先消除。GRN-FTD大脑特异性失去中间神经元的观察与这些发现一致，进一步支持了PGRN在维持抑制性电路中的作用。值得注意的是，AXL也在星形胶质细胞中表达，星形胶质细胞已被牵涉到吞噬作用中。这提出了星形胶质细胞AXL在发育过程中或成年大脑中调节抑制性神经元的可能性。
总之，我们展示了PGRN在不与这些受体结合的情况下调节人类诱导的小胶质细胞中的MERTK和AXL RNA水平，MERTK在GRN-FTD患者的人脑组织和脑脊液中失调，同时Mertk和Grn在小鼠中的并发敲除挽救了Grn缺陷相关的疾病相关小胶质细胞表型，而Axl和Grn的并发敲除则加重了它。这些发现不仅适用于GRN-FTD，还适用于其他PGRN水平改变的疾病状态，如AD、中风、炎症、败血症、癌症等。此外，PGRN与MERTK和AXL的相互作用开辟了值得进一步研究的新治疗途径。
方法：人体组织 十二名异质GRN突变患者（年龄范围56-84岁；女性3名，男性3名）和12名无神经系统疾病对照组（年龄范围60-98岁；女性9名，男性3名）通过加州大学旧金山分校（UCSF）记忆与衰老中心参与了这项研究，作为更大规模研究的一部分，旨在记录额颞叶痴呆的自然史。本研究中包括的所有GRN-FTD患者均有病理确诊的FTLD-TDP-A诊断和行为变异额颞叶痴呆（n = 7）、原发性进行性失语症（n = 3）或皮质基底综合征（n = 1）的临床诊断。对照组没有临床神经病学诊断。根据NIA-AA AD标准的偶然病理发现详情见补充数据1。研究方案得到了UCSF人类研究机构审查委员会的批准。遵循了与人类研究参与者相关的所有伦理规定。从所有有能力的参与者处获得了书面知情同意。对于因能力减弱而无法提供知情同意的参与者，从参与者处获得同意，并从指定的代理决策者处获得书面同意。受试者接受了标准化的神经学评估。参与者接受尸检并将大脑捐赠给UCSF神经退行性疾病脑库。从未经固定的冷冻组织中切取约0.5-1 cm²大小的额上回块用于单细胞分析和蛋白质定量。
人类和小鼠单核RNA测序（snRNA-seq） 对于人类单细胞实验：基于RNA质量（RIN>5），纳入了8例GRN-FTD和7例非FTD对照组进行单细胞分析，每组包括2名男性和5-6名女性。对于小鼠单细胞实验：每个组别（2雄2雌）在10-12月龄时选取4只小鼠。从小鼠海马和冷冻保存的人类额上回中分离核的方法改编自先前研究，并进行了修改。所有程序均在冰上或4°C下进行。简言之，将脑组织放入含有1500 µl Sigma nuclei PURE裂解缓冲液（Sigma, NUC201-1KT）中，并用Dounce组织研磨器（Sigma, D8938-1SET）用杵A研磨15次，再用杵B研磨15次。将匀浆后的组织通过35-µm细胞过滤器过滤，4°C下以600 g离心5分钟，并用含有1%牛血清白蛋白（BSA, Thermo Fisher Scientific, 37525）、20 mM DTT（Thermo Fisher Scientific, 426380500）和0.2 U/µl重组RNase抑制剂（Ambion, AM2684）的PBS洗涤三次。然后将核在4°C下以600 g离心5分钟，并重悬于含有0.04% BSA和1× DAPI的350 µl PBS中，随后进行荧光激活细胞分选以去除细胞碎片。将DAPI染色核的分选悬浮液计数并稀释至每µl 1000个核的浓度，溶于含0.04% BSA的PBS中。对于基于液滴的snRNA-seq，按照制造商的协议使用Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3（10x Genomics, PN-1000075）制备文库。snRNA-seq文库在NovaSeq 6000测序仪（Illumina）上进行测序，周期为100。
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