eLife评估
本稿件描述了在重组全长人类tau蛋白中鉴定和表征12个特定磷酸化模拟突变，这些突变触发tau蛋白形成纤维。这项基础性研究将允许进行体外机制研究。所呈现的证据具有说服力。本稿件将引起淀粉样蛋白形成领域所有科学家的兴趣。
意义级别：基础性——发现实质性推进对主要研究问题的理解
证据强度：令人信服——方法适当且经过验证，符合当前最先进的标准
摘要
tau蛋白组装成淀粉样纤维与20多种统称为tau蛋白病的神经退行性疾病相关。脑源性tau纤维的电子冷冻显微镜(cryo-EM)结构揭示了特定结构定义了不同疾病，促使研究人员开发能复制疾病结构的实验模型系统。本文描述了tau蛋白中的12个磷酸化模拟丝氨酸/苏氨酸-天冬氨酸突变，我们称之为PAD12，它们共同诱导全长三重复tau蛋白在体外组装成与从阿尔茨海默病患者大脑中提取的配对螺旋丝(PHFs)具有相同结构的纤维。溶液态核磁共振光谱表明，tau羧基末端结构域中的磷酸化模拟突变可能通过破坏两个IVYK基序之间的分子内相互作用来促进纤维形成。PAD12 tau可用于体外核依赖性和多轮种子组装，也可用于tau生物传感器细胞的接种。PAD12 tau可在各种摇动条件下组装成配对螺旋丝，所形成的纤维可长期稳定存在。它们可以被荧光染料和生物素标记。从阿尔茨海默病患者大脑中提取的tau纤维已知由过度磷酸化和异常磷酸化的全长tau组成，但尚不清楚这种翻译后修饰的存在是否不仅仅是相关性。我们的研究结果表明，tau蛋白的过度磷酸化可能足以形成阿尔茨海默病tau折叠。PAD12 tau将成为研究神经退行性疾病分子机制的有用工具。
引言
tau蛋白组装成淀粉样纤维的特征是一组称为tau蛋白病的神经退行性疾病。阿尔茨海默病(AD)是最常见的tau蛋白病。在大多数tau蛋白病中，tau是唯一组装成纤维的蛋白，而在AD中，tau蛋白的细胞内聚集体与细胞外淀粉样β纤维斑块共存。
六种长度从352到441个氨基酸的tau亚型通过单个基因(MAPT)的替代mRNA剪接在成人人类大脑中表达。tau序列(图1A)包括氨基末端投影结构域(残基1-150)、富含脯氨酸区域(残基151-243)、四个微管结合重复序列(R1-R4；残基244-368)和羧基末端结构域(残基369-441)。tau亚型通过在氨基末端结构域中加入零个、一个或两个29个氨基酸的插入片段(0N、1N或2N亚型)以及存在或缺失第二个微管结合重复序列，形成三重复(3R)或四重复(4R)tau亚型。阿尔茨海默病和慢性创伤性脑病(CTE)中存在所有六种tau亚型的混合物，而Pick病中只有3R tau组装，进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底变性(CBD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)和嗜银颗粒病(AGD)中只有4R tau组装。
电子冷冻显微镜(cryo-EM)揭示了特定的tau折叠定义了不同的tau蛋白病。在tau纤维中，微管结合重复序列加上羧基末端结构域约10个残基有序排列。在来自AD和其他疾病的tau纤维中，剩余残基无序，形成围绕有序核心的模糊外衣。有趣的是，除了一种由tau的P301T突变引起的家族性tau蛋白病外，每种疾病都只观察到单一的tau折叠，而患有特定疾病的多个个体总是具有相同的纤维。同一tau蛋白病患者中tau纤维结构的一致性支持朊病毒假说，即tau纤维通过模板化错误折叠传播其结构。
在人类大脑中形成和传播的特定tau折叠可能受到其组装所在细胞环境的影响。用于研究tau蛋白病的模型系统应能复制在患病人类大脑中观察到的相同tau折叠。然而，这已被证明具有挑战性。例如，当重组野生型全长tau在体外组装时，需要添加带负电荷的分子(如肝素或RNA)，但肝素或RNA诱导组装的tau纤维结构与从人类大脑中提取的纤维不同。同样，通过在SH-SY5Y细胞中过表达全长人类tau并结合使用人脑源性tau纤维进行接种，也未能重现AD或CBD的结构。此外，在不同启动子控制下过表达携带P301L或P301S突变的4R tau的转基因小鼠形成具有不同结构的tau纤维，表明不同启动子可能导致在不同细胞类型中组装纤维，影响形成哪种tau折叠。这些小鼠模型中没有一种tau纤维结构与在人类大脑中观察到的相同。
我们先前报告称，在摇动条件下，包含残基297-391的截短tau构建体(tau297-391)组装成配对螺旋丝(PHFs)，这是AD中的主要纤维类型。向tau297-391组装反应中添加氯化钠导致形成CTE纤维。随后的时间分辨冷冻电镜研究表明，疾病特异性结构的形成经历了许多中间淀粉样纤维，其中在AD和CTE纤维组装中观察到一个共同的第一中间淀粉样(FIA)。
除了组装发生的细胞环境外，不同的tau折叠也可能由tau自身的化学修饰决定。AD患者大脑中的PHF-tau是过度磷酸化和异常磷酸化的；这被认为先于纤维组装并与之相关。tau的过度磷酸化也可能通过使tau从微管上脱离而间接加速聚集。通过质量谱和针对AD大脑中PHFs产生的抗体表位作图，鉴定了多个位点，这些位点都在tau的模糊外衣中，在AD大脑PHFs中过度磷酸化。单克隆抗体AT270识别苏氨酸181(T181)的磷酸化；AT8识别丝氨酸202(S202)和苏氨酸205(T205)的磷酸化，AT100识别T212、S214和T217的磷酸化，AT180识别T231和S235的磷酸化，PHF-1识别S396和S404的磷酸化。全面的质量谱翻译后修饰图谱证实这些残基在AD大脑组装的tau中过度磷酸化。
基于这些观察，我们先前设计了tau羧基末端结构域中的四个磷酸化模拟突变(S396D、S400D、T403D和S404D)，使重组tau297-441能够组装成具有阿尔茨海默折叠的纤维，尽管只有单个原纤维。类似的构建体也被证明适合生产大量用于核磁共振(NMR)的同位素标记蛋白，但再次只产生具有阿尔茨海默原纤维折叠的纤维，但其原纤维包装与PHFs中的不同。此外，一个在富含脯氨酸区域(含S202E、T205E、S208E)和羧基末端区域(含S396E、S400E、T403E、S404E)具有磷酸化模拟突变的tau构建体被发现能够组装，但形成的纤维与AD中发现的纤维不同。
我们假设在tau的富含脯氨酸区域引入额外的磷酸化模拟突变可能有助于重组全长tau的组装。基于上述抗体表位和质谱数据，我们将tau富含脯氨酸区域中的八个残基(T181、S202、T205、T212、S214、T217、T231、S235)突变为天冬氨酸。与tau羧基末端结构域中先前描述的四个突变相结合，这导致了全长tau中的十二个磷酸化模拟突变，其中九个位于丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序中(图1A)。我们表明，这些突变(我们将其称为AD的十二个磷酸化模拟物，或PAD12)允许重组全长tau进行核依赖性和种子组装成PHFs，从而为研究tau模糊外衣在疾病分子机制中的作用开辟了新途径。我们的研究结果表明磷酸化如何导致tau模糊外衣中的纤维形成，并表明特定位点tau的过度磷酸化可能足以从全长蛋白形成阿尔茨海默tau折叠。
结果
PAD12全长tau组装成PHFs
0N3R和0N4R版本的PAD12 tau在大肠杆菌中表达并纯化，随后在摇动条件下进行体外组装(图1A；图1-补充图1；表1；材料与方法)。组装在500 rpm轨道摇动(2分钟开；1分钟关)下进行7天，蛋白浓度为100 μM，缓冲液含100 mM磷酸钾(pH 7.2)、400 mM柠檬酸钾和4 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)。我们使用冷冻电镜确定了所得纤维的结构(图1B-D；图1-补充图2；表2)。0N3R-PAD12 tau主要形成PHFs(85%)，少部分(15%)为具有阿尔茨海默折叠的单个原纤维。剩余的纤维，包括自动纤维挑选中的假阳性，均在图像处理中被丢弃。0N4R-PAD12 tau组装成仅包含单个具有CTE折叠原纤维的纤维。可能是样品中少量的氯化钠导致了具有CTE折叠的原纤维形成。观察到第二个微管结合重复序列的部分有序，形成与第三个重复序列的交叉β包装，可能与该构建体形成仅包含单个原纤维的纤维有关。
因为AD大脑中的tau纤维包含等摩尔量的3R和4R tau，我们在相同条件下组装了0N3R-PAD12和0N4R-PAD12 tau的1:1混合物。同样，我们主要观察到PHFs(72%)，以及具有阿尔茨海默tau折叠的单体的少数(28%)。PHFs与AD大脑中发现的PHFs相同，主链均方根偏差(r.m.s.d.)为1.4 Å(图1E)。为增加PHFs与单体的比例，我们在1周后将平板从摇床上取出，并在37°C下静置孵育2周。这导致形成了100%的PHFs(图1-补充图4)。重复七次时，平均形成95.3%的PHFs，单个异常值中形成25%的单体(图1-补充图5)。
PAD12 tau的PHFs不黏附且可在各种摇动条件下形成
虽然几组已经复制了我们关于tau297-391组装成PHFs的发现，但纤维形成需要进一步优化组装条件，并报告了其他纤维类型的形成。我们先前表明，组装反应中存在多种纤维类型，这些类型在形成PHFs的途径上是有意义的。另一个可能造成可重复性困难的原因可能是tau297-391的组装对摇动条件敏感，在200 rpm或700 rpm摇动时形成不同的结构。组装反应容器内由摇动产生的物理力可能比反应混合物的生化成分更难控制。例如，不同的摇动机器或不同形状、不同体积的容器都可能导致不同的力。观察到在Eppendorf LoBind微量离心管中，100 μl 0N3R-PAD12 tau在500 rpm轨道摇动下(在Eppendorf ThermoMixer C中)形成具有阿尔茨海默折叠的PHFs，表明全长PAD12 tau的组装对摇动的物理性质比tau297-391的组装更不敏感。
tau297-391 PHFs的另一个缺点是它们倾向于聚集在一起，特别是在长期储存或冻融后。纤维聚集使冷冻电镜结构测定复杂化，并可能干扰后续实验，如小分子化合物的结合研究或在细胞培养和动物中的接种实验。与tau297-391不同，几乎所有的全长PAD12 tau显微照片都显示分散的单个纤维，即使组装的纤维在4°C下保存2个月，或在-196°C下速冻然后在室温下解冻(图1-补充图3B和C)。观察到tau 0-391和151-391 3R PAD12 tau构建体也不聚集(图1-补充图3D和E)，表明氨基末端模糊外衣的缺失导致了tau297-391纤维的黏性。
不同的磷酸化模式导致不同的纤维
我们首先测试了是否可以使用谷氨酸代替天冬氨酸进行PAD12突变，将所有12个天冬氨酸替换为谷氨酸。所得结构再次为PHFs(图1-补充图3A)。接下来，为测试PHF的形成是否依赖于特定的PAD12突变，我们测试了另外三个0N3R tau构建体，具有不同的突变。在第一个构建体(PAD12-4)中，我们从富含脯氨酸区域中移除了八个磷酸化模拟突变中的四个，仅保留T181D、S202D、T217D和S235D。在第二个构建体(PAD12+4)中，我们添加了四个在AD tau中也具有高水平磷酸化的磷酸化模拟突变(T153D、S237D、S262D和T263D)。在第三个构建体(PAD12±4)中，我们移除了第一个构建体中的四个相同突变，并添加了第二个构建体中的四个相同新突变，导致与原始PAD12构建体相同的净电荷。在与之前相同的轨道摇动条件下，这三种构建体的0N3R版本均形成纤维。然而，PAD12+4、PAD12-4或PAD12±4构建体形成的纤维形态与PHFs明显不同；它们不扭曲，因此我们无法确定其结构(图2)。
PAD12 tau纤维可以被标记
接下来，我们探索了使用NHS-酯化学标记PAD12 tau纤维的能力，该化学反应专门针对赖氨酸残基中的伯胺。荧光标记的纤维可能有用，例如通过光学显微镜跟踪细胞中的接种反应。我们将预组装的0N3R-PAD12 tau纤维用DyLight-488、Alexa-647、Atto-647、Atto-565和CF-680标记。我们在超速离心后观察到荧光沉淀(图3C)。所得纤维的冷冻电镜证实PHF结构在所有条件下均保持完整(图3C)。
我们还探索了是否可以使用相同的NHS-酯化学对PAD12 tau纤维进行生物素化。生物素化用于蛋白质选择和通过邻近标记研究蛋白质-蛋白质相互作用。10 nm金结合的链霉亲和素的免疫电镜确认预组装的0N3R-PAD12 tau纤维可以广泛生物素化(图3D)。
PAD12 tau的体外种子组装
接下来，我们研究了AD脑源性tau纤维是否能够接种PAD12 tau的组装，以及这种接种是否能够持续超过一轮。我们将超声处理的AD脑源性tau纤维引入40 μM(~1.5 μg/μl) 0N3R-PAD12 tau溶液中，并在500 rpm轨道摇动下进行体外组装(2分钟开；1分钟关)48小时，缓冲液含20 mM HEPES pH 7.3、4 mM磷酸钾pH 7.2、300 mM柠檬酸钠和4 mM TCEP。在相同条件下，但不添加AD种子，我们在48小时内未观察到纤维形成。尽管我们仅在含有60 μg重组(未标记)PAD12 tau的反应中使用了0.8 μg AD脑组织的提取物，但在添加种子后，硫黄素T(ThT)荧光未观察到滞后期。相反，添加种子后ThT荧光直接线性增加，并在48小时后达到平台期(图4A)。冷冻电镜分析证实接种的tau纤维主要为(73%) PHFs(与PDB-ID 6hre的主链r.m.s.d.为1.3 Å)，以及具有阿尔茨海默折叠的单个原纤维的少数(8.5%)(图4B-D)。
最近有报道称，野生型0N3R tau的体外组装可以通过大量AD脑源性纤维进行接种。接种的纤维被证明是PHFs，但它们无法在第二轮接种组装中对野生型0N3R tau进行接种。为测试PAD12 tau是否也是如此，我们将第一轮中形成的纤维以约1:2500的比例用于第二轮接种组装。我们再次在添加种子后观察到ThT荧光迅速增加，接种聚集体的冷冻电镜分析仍显示PHFs(图4A和B)，表明PAD12 tau可用于多轮接种聚集。
用PAD12 PHFs接种tau报告细胞
然后，我们使用在HEK293T细胞中过表达血凝素(HA-)标记的tau297-391的生物传感器细胞系(见材料与方法)，并比较其对tau297-391、PAD12 0N3R或PAD12 0N3R:0N4R的PHFs不断增加的接种反应(图5A和B)。这些细胞在暴露于从AD大脑中提取的种子时也产生强烈的接种反应(图5-补充图1A)。比较tau297-391和PAD12 0N3R或PAD12 0N3R:0N4R tau的重组PHFs，我们在低浓度(~5 ng)的PAD12 PHFs下观察到有效的接种，而tau297-391在相同浓度下未导致接种。在较高浓度下，tau297-391 PHFs的接种效率较低，且重复之间的变异性大于PAD12 PHFs。使用适当的激发和发射设置来可视化生物传感器细胞内用DyLight-488标记的PAD12 0N3R纤维的原始种子，我们观察到原始种子与HA-297-391斑点的共定位(图5C；图5-补充图1B和C)。
羧基末端结构域中的磷酸化模拟突变影响FIA区域
我们使用溶液态核磁共振研究了PAD12突变对tau单体的影响。由于该技术的尺寸限制，我们使用了两个截短的tau构建体。第一个构建体包含4R tau的残基151-391，带有或不带有富含脯氨酸区域的八个PAD12磷酸化模拟突变。第二个构建体包含4R tau的残基297-441，带有或不带有羧基末端结构域的四个PAD12磷酸化模拟突变。
富含脯氨酸区域中tau151-391构建体的磷酸化模拟突变的影响是微妙的。野生型和PAD12 tau151-391之间的化学位移扰动(CSPs)在包含S202、T205、S212、S214和T217突变的残基198-222区域以及包含T231和S235突变的残基237-244附近区域最大(图6-补充图1A；图6-补充图2)。主链Cα和Cβ化学位移(对主链扭转角敏感)的分析显示，野生型tau151-391、PAD12 tau151-391和tau297-391在297-391区域的二级结构倾向几乎没有差异(图6-补充图1B)，或在野生型和PAD12 tau151-391的富含脯氨酸区域(尽管其26个脯氨酸可能阻止任何潜在的二级结构改变)。异核NOE(HetNOE)分析(图6-补充图1C)，报告皮秒时间尺度主链流动性，显示PAD12 tau151-391比野生型tau151-391更刚性，主要在突变位点附近。相对峰强度(图6-补充图1D)显示富含脯氨酸区域存在一些差异，其中峰衰减表明野生型tau151-391比PAD12 tau151-391具有更大的构象取样。然而，这两种构建体之间的微妙差异并不表明PAD12 tau151-391形成纤维的倾向增加的明显原因。
相比之下，野生型和PAD12 tau297-441的比较揭示了有趣差异。二级化学位移分析(图6-补充图3A)表明，包含四个突变位点的残基393-404在PAD12构建体中具有形成扩展构象的更高倾向，可能是由于带负电荷的天冬氨酸之间的静电排斥。残基405-407表现出对螺旋主链扭转角的强烈偏好，表明在PAD12构建体中存在类似转角的结构，而在野生型tau297-441中不存在。磷酸化模拟突变对这些残基的影响也在CSPs中反映出来(图6-补充图3B；图6-补充图4)。HetNOE分析表明，与野生型tau297-441相比，PAD12构建体在残基305-311和398-412之间在皮秒时间尺度上更刚性(图6-补充图3C)。最后，峰强度分析显示，与tau297-391和PAD12 tau297-441相比，野生型tau297-441的残基297-319显示出降低的强度(图6-补充图3D)。与PAD12 tau297-441相比，野生型tau297-441的残基392-404也显示出类似的峰强度衰减。
残基302-316形成tau297-391组装成PHFs或CTE纤维时FIA中的有序核心。我们先前假设tau297-391单体中这些残基的部分刚性可能减少成核新纤维的熵成本。观察到在同一区域，通过HetNOE分析，PAD12 tau297-441比野生型tau297-441更刚性，可能有助于其组装成纤维的能力。此外，残基297-319和392-404的峰强度降低可能源于构象交换展宽，这是由于它们各自的IVYK基序在重复3(残基308-311)和羧基末端区域(残基392-395)之间发生瞬时分子内相互作用所致。这种类似发夹的相互作用(可能类似于FIA中两个原纤维之间的相互作用)可能抑制无磷酸化模拟突变时的纤维形成。类似相互作用(也被羧基末端结构域中的磷酸化模拟突变(S396E和S404E)阻碍)已被假设发生在tau的微管结合重复区域与其羧基末端结构域之间，基于FRET测量。早期观察到tau的磷酸化导致电泳迁移率发生显著变化，这被认为是构象变化的反映。
为进一步研究，我们还测试了包含tau297-441但无磷酸化模拟突变的构建体，但删除了残基392IVYK395(Δ392-395)。纤维迅速形成，冷冻电镜结构显示有序核心由跨越残基297-318的构建体氨基末端部分组成(图6B)。核磁共振分析(图6-补充图5B)显示tau297-441 Δ392-395构建体表现出与tau297-441 PAD12构建体相似的主链刚性特性，尽管峰位置和局部二级结构倾向更接近野生型tau297-441(图6-补充图5A；图6-补充图6)。tau297-441 Δ392-395的297-319和392-404区域的HSQC峰强度(图6A，扩展自图6-补充图5C)与tau297-441 PAD12相同。这些数据表明，IVYK缺失对残基396、400、403和404的磷酸化模拟突变具有类似影响，破坏了FIA核心区域和羧基末端结构域之间的分子内相互作用，因此可能由类似于FIA中观察到的两个IVYK基序之间的相互作用介导。
讨论
从AD患者大脑中提取的tau纤维含有所有六种亚型的全长、过度磷酸化tau。相比之下，全长重组tau在体外组装成纤维需要带负电荷的辅因子的存在。我们先前表明，肝素诱导的全长重组tau体外组装产生与从AD大脑中提取的纤维不同的结构，但截短的tau297-391可以在无辅因子的情况下组装成PHFs。我们还报告称，在tau297-441的羧基末端结构域中引入四个磷酸化模拟突变会产生具有阿尔茨海默折叠的单个原纤维。在本文中，我们表明在富含脯氨酸区域中额外的八个磷酸化模拟突变足以使重组全长tau组装成PHFs。这些发现首次表明全长重组tau可以核依赖性地组装成PHFs。
未修饰tau的富含脯氨酸区域带正电。我们对PAD12+4、PAD12-4和PAD12±4构建体的研究表明，全长tau组装成PHFs不仅仅依赖于在此区域引入负电荷：哪些残基发生突变也很重要。这与其他人使用伪磷酸化重组tau和某些蛋白激酶对重组tau进行磷酸化的研究一致。我们不能排除每种构建体都需要其自身的组装条件优化，并且其他修饰而非PAD12的构建体也可以形成PHFs的可能性。先前的研究报告称，不同PAD12突变子集的磷酸化或磷酸化模拟突变可能导致tau在体外和细胞内组装。然而，对于这些研究中的任何一个，都没有冷冻电镜结构来证明所形成的纤维是PHFs。定义使全长tau自发组装成PHFs所需的最小磷酸化模拟突变集合需要系统地移除PAD12突变，每个突变都需优化组装条件并通过冷冻电镜结构确定来验证是否形成正确结构。虽然此类工作可能在未来提供进一步见解，但我们认为PAD12全长tau组装成PHFs值得在进行此类探索之前进行传播。
与疾病中的tau纤维一样，与tau297-391的纤维不同，PAD12 tau纤维具有模糊外衣。tau模糊外衣在疾病分子机制中的作用仍知之甚少。例如，AD接种的PAD12 tau纤维可用作第二轮体外接种组装的种子，而AD接种的未修饰tau纤维据报道不具备接种能力，尽管两种tau构建体在第一轮接种中都形成了PHFs。模糊外衣也可能影响tau纤维与细胞成分的相互作用，例如用于tau纤维摄取的细胞外受体，或降解它们的大分子复合物。此外，模糊外衣可能干扰旨在靶向疾病中tau纤维有序核心的正电子发射断层扫描候选配体或生物制剂的结合。需要进一步研究以探索模糊外衣及其翻译后修饰的作用，而使用重组PAD12 tau制造具有模糊外衣的PHFs将促进这一点。
tau的过度磷酸化会破坏其与微管相互作用的能力，并被认为与纤维组装相关。模糊外衣的磷酸化可能通过减少成核新纤维的熵成本来促进自发纤维组装。此外，纤维中过度磷酸化tau的负电荷可能通过静电吸引招募磷酸化较少的可溶性tau单体。这可以解释为什么野生型全长tau与大量AD脑源性种子的体外组装在单轮接种中起作用，但所形成的纤维无法在第二轮中接种野生型全长tau。值得注意的是，AD大脑中tau的磷酸化模式排除了PHF有序核心中的残基。一致地，在任何从尸检大脑中报告的tau纤维的有序核心中，都没有可见的磷酸化基团的冷冻电镜密度。因为PHFs的有序核心包含tau的第三和第四微管结合结构域，所以这些残基可能在tau与微管结合时受到保护而免于磷酸化。事实上，具有PHF有序核心中残基磷酸化的tau分子可能无法形成纤维，这是由于磷酸基团的大小及其电荷之间的排斥力所致。模糊外衣中tau的磷酸化是调节其与微管结合的生理机制。
我们的核磁共振数据提供了关于磷酸化如何或截短tau如何导致具有有序核心的纤维组装的机制见解，这些有序核心由本身未磷酸化的残基组成。未修饰的tau 297-441、PAD12 tau 297-441和tau297-391之间的HSQC峰强度差异表明，模糊外衣中的磷酸化，特别是靠近羧基末端结构域中392IVYK395基序的磷酸化，会影响tau中在FIA中有序排列的残基的构象。在tau 297-441的羧基末端结构域中移除残基392IVYK395导致在无磷酸化模拟突变的情况下快速纤维形成，而该构建体的HSQC峰强度差异表明与tau 297-441(无缺失)相比，其主链刚性相似，但具有羧基末端结构域中的四个PAD12突变。综合来看，这些观察支持以下模型：在未修饰的全长tau单体中，392IVYK395基序与308IVYK311基序相互作用，从而通过防止成核物质FIA的形成来抑制纤维形成。396、400、403和404附近残基的磷酸化或在残基391处的截短破坏了这种相互作用并导致纤维形成。该模型与先前提出的tau纸夹模型一致，尽管tau氨基末端结构域与核心形成区域之间的相应相互作用仍未知(图7)。观察到PAD12 tau在SDS-PAGE中迁移的表观分子量高于预测值也支持PAD12突变导致更延伸构象的模型。有可能tau在调节微管稳定性中的正常生理作用(通过磷酸化)不会扩展到所有对纤维组装所需的残基，但有时可能如此。尚待观察的是，tau纤维是否偶尔作为这种生理调节的结果而形成，随后被降解，或者tau纤维形成是否总是病理事件的结果。
可以探索不同的翻译后修饰模式是否对于组装成特定于其他tau蛋白病的tau折叠很重要。为此，可以将此处针对AD描述的类似方法应用于其他tau蛋白病，前提是这些疾病中tau纤维的蛋白质组学数据变得可用。同时，目前的研究结果表明tau的过度磷酸化足以形成阿尔茨海默折叠。尚待观察其他tau的翻译后修饰是否也能产生PHFs。使用重组PAD12 tau形成PHFs的能力将促进对tau聚集分子机制及其在AD中作用的进一步研究。观察到PAD12 tau纤维可以被标记，并且单个纤维在溶液中稳定数周，这将促进其在细胞和动物中tau的接种，以及用于高通量结合测定的潜在治疗或诊断化合物，及其结构测定。了解tau如何以及为何在不同tau蛋白病中采用特定折叠，以及这些折叠是否以及如何影响不同疾病，可能为治疗开发提供新途径。
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