缺血性中风后动脉内线粒体移植可减少脑梗死Intraarterial Transplantation of Mitochondria After Ischemic Stroke Reduces Cerebral Infarction | Stroke: Vascular and Interventional Neurology

缺血性中风后动脉内线粒体移植可减少脑梗死

摘要

背景：将自体线粒体移植到缺血组织可能减轻缺血和再灌注造成的损伤。

方法：利用小鼠大脑中动脉闭塞的中风模型，我们评估了将活性线粒体递送至缺血脑实质的可行性。我们评估了同时使用聚焦超声激活微泡（用于开放血脑屏障）对线粒体递送效率的影响。

结果：动脉内递送后，线粒体分布至中风侧半球，并整合到脑实质中的神经和胶质细胞中。与在缺血组织中的功能性整合一致，移植的线粒体提高了中风侧半球的腺苷三磷酸浓度，减少了梗死体积，并增加了细胞活力。聚焦超声的加入可在无出血并发症的情况下改善血脑屏障的开放。

结论：我们的研究结果对缺血性中风后介入策略的开发具有重要意义，并提示了一种在机械取栓术后可能的新治疗模式。

非标准缩写和首字母缩略词

FUS：聚焦超声

tpMCAo：短暂性近端大脑中动脉闭塞

临床视角

• 作者提出了一种新策略，即在大血管闭塞取栓术后，使用小鼠脑缺血和再灌注模型（模拟当前临床范式）进行自体线粒体采集和移植。

• 他们证明，可以在临床可接受的时间内采集线粒体，并将其递送至大脑并整合到实质中。整合后，线粒体可提高腺苷三磷酸浓度，减少梗死体积，并增加细胞活力。

• 这种新策略因其细胞成分是自体采集且经最小程度修饰，因此易于临床转化。

引言

中风是美国导致死亡和严重残疾的主要原因。迄今为止，神经保护剂的临床试验尚未成功，而在动物模型中预防中风相关损伤的研究也未能在临床环境中得到良好转化。目前中风患者的治疗选择仅限于通过静脉注射溶栓药物或血管内取栓术恢复血流。然而，再灌注干预本身已被证明会引发缺血组织的继发性损伤途径。因此，需要新的治疗策略来解决缺血和再灌注引起的损伤，以改善中风后的预后。

线粒体功能对于所有多细胞真核生物的代谢稳态至关重要。在神经系统中，线粒体产生的腺苷三磷酸对于建立跨质膜的 electrochemical gradient 和可靠的突触传递至关重要。动脉闭塞后数分钟内，脑线粒体开始失去 electrochemical proton gradient，导致ATP合成停止和活性氧过量产生。ATP的长期耗竭会导致质膜去极化，并最终导致细胞凋亡。

线粒体移植作为一种治疗方法，最初在心血管疾病中得到探索。McCully等人率先开展研究，从自体骨骼肌中获取线粒体，并通过冠状血管将其移植到兔心脏的缺血区域，改善了缺血后心肌功能的恢复。在一项临床试验中，Emani等人将线粒体移植到因心脏手术后发生心肌缺血事件的人类儿科患者中，并获得了有希望的初步结果。最近的研究也表明，神经元可以整合由其他细胞（如星形胶质细胞）释放到细胞外空间的线粒体。线粒体的再摄取可以保护神经元活力并改善中风后的恢复。利用这一机制，Zhang等人证明，将肌肉来源的自体线粒体移植到中风大脑的侧脑室可减少梗死面积。在最近的一项研究中，静脉注射胎盘来源的线粒体被证明可减少小鼠短暂性局灶性缺血后的梗死面积。

尽管线粒体补充在缺血后产生有益效果的证据越来越多，但尚未对到达受影响脑组织的最佳递送途径进行详细研究。

方法

本文所用方法的详细信息可在在线补充材料中找到。

小鼠模型建立

所有实验均获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。成年雄性或雌性C57BL/6J小鼠购自Jackson实验室。所有小鼠均饲养在12小时光照/黑暗循环的受控环境中，并喂食标准饲料。本研究仅使用成年动物（8-10周龄），并从不同笼子中选择动物用于每个实验组，以确保随机化。同窝同性别的小鼠以1:1的比例随机分配到实验组。所有分析均合并进行，性别不用于数据亚组分析。MitoTimer报告基因在补充方法中描述。

线粒体分离和染色

线粒体分离和组织学按照先前描述的方法进行，并在补充方法中总结。

动脉内递送线粒体

大脑中动脉闭塞一小时后，将小鼠麻醉并如前所述进行再灌注准备。在撤回闭塞丝线之前，立即在颈内动脉上放置一个微夹以防止逆行出血。然后利用颈总动脉上现有的动脉切开术，插入一个装有线粒体或缓冲溶液的动脉内导管。用丝线将导管固定在颈总动脉中。使用连接的Hamilton注射器，以100微升/分钟的速度，在2分钟内缓慢输注200微升新鲜线粒体悬液。然后将导管从颈内动脉中取出，并永久结扎颈总动脉。缝合皮肤，并按所述提供镇痛药。

立体定向递送线粒体

用异氟烷麻醉小鼠；剃去头皮毛发，将动物置于立体定向框架中。使用无菌技术，用小手术剪刀做正中切口。移除皮肤，暴露前囟和 lambda 点。用手持钻在目标区域钻一个小孔。将装有线粒体悬液的5微升Hamilton注射器连接到立体定向装置上，移至纹状体的立体定向靶点。使用Hamilton注射器缓慢注入2微升线粒体悬液。缝合皮肤，给予动物镇痛药，并让其在加热笼中恢复。

结果

快速分离活性线粒体

使用Preble等人的方法，从C57Bl/6小鼠的腓肠肌中分离线粒体，并通过电子显微镜、流式细胞术和生物发光ATP测定评估其形态和活力。透射电子显微镜确认了细胞器完整性、基质中嵴的存在以及分离线粒体的平均面积。接下来，用荧光染料标记分离的线粒体，并使用流式细胞术分析其大小。分离线粒体的峰值大小小于6微米直径的参考珠，这与先前报告的尺寸以及我们对分离线粒体的测量结果一致。此外，MitoTracker CMXRos的积累依赖于膜电位；因此，在我们的制备中观察到的明亮荧光表明这些线粒体存在持续的 electrochemical proton gradient。为了独立于合成染料标记追踪缺血大脑中分离线粒体的命运，在一部分实验中，我们利用了一种转基因品系，其中线粒体被一种名为MitoTimer的DsRed变体进行基因标记。使用荧光显微镜，从这些小鼠中分离出的线粒体呈现亮红色，其大小分布与MitoTracker标记的细胞器相似。最后，我们评估了分离线粒体中的ATP含量，以进一步确认其代谢活性。新鲜线粒体悬液中的平均ATP浓度为0.20 ± 0.04 pM，而在单独的缓冲液中未检测到ATP。

动脉内输注的线粒体可以渗透受损的血脑屏障

为了确定动脉内输注后，在有或没有超声处理的情况下，线粒体在大脑中的分布情况，我们在健康大脑和缺血大脑中进行了一系列实验。通过将闭塞丝线插入颈总动脉，对C57Bl/6小鼠进行短暂性近端大脑中动脉闭塞。60分钟后，通过撤回闭塞丝线使缺血半球再灌注，并通过颈总动脉上的同一动脉切开术输注新鲜线粒体悬液，对照组小鼠在暴露颈总动脉而未闭塞的情况下接受线粒体输注。为了测试我们是否能增加血脑屏障的通透性，我们在线粒体输注前立即用脉冲聚焦超声照射动脉内注射的微泡。最后，还进行了缺血大脑的直接立体定向注射作为对照组。在所有情况下，动物在移植后2小时被安乐死，并使用共聚焦显微镜分析脑切片。

为了测量线粒体的递送，我们量化了背外侧纹状体可比区域中血管和实质内线粒体信号的密度。我们使用CD31染色来识别血管以计算血管内密度，并使用血管外区域来定义实质密度。计算实质与血管内信号密度比，作为线粒体外渗的衡量标准。在血脑屏障完整的正常大脑中进行线粒体输注，导致外渗较低，实质与血管内线粒体信号比为0.33 ± 0.09。在经受tpMCAo的大脑中，该比率增加到6.96 ± 4.50，与血脑屏障的部分破坏一致。然而，这种增加在统计学上不显著。在另一组经受tpMCAo的小鼠中，通过立体定向聚焦超声进一步增加了血脑屏障的通透性。在这些动物中，输注的线粒体在血管外实质中达到了更高的浓度；实质与血管内比率为20.20 ± 7.57。最后，为了进行比较，我们在纹状体中进行了线粒体悬液的直接立体定向注射。这导致线粒体沿递送部位大量递送，但显示在注射周边区域扩散有限。

为了进一步表征缺血性中风和聚焦超声对血脑屏障通透化的协同效应，我们对每个实验范式进行了动脉内伊文思蓝染料注射。动物在注射后4小时被安乐死，并用2,3,5-三苯基四唑氯化铵染色脑组织以勾勒梗死组织。使用平板扫描仪量化伊文思蓝信号，在ImageJ中分析，并以体积表示。在对照组大脑中，伊文思蓝外渗的平均体积为0.048 ± 0.083 mm³。将立体定向聚焦超声应用于正常大脑显著增加了伊文思蓝外渗。如预期，tpMCAo也显著提高了伊文思蓝外渗的体积。然而，当我们将立体定向引导的聚焦超声应用于tpMCAo后的大脑时，外渗染料的体积急剧增加至38.45 ± 16.30 mm³，显著高于单独任一治疗。这些数据重申，缺血性损伤削弱了血脑屏障，并且通过使用脉冲聚焦超声在缺血区域激活微泡可以实现额外的通透化。

有限的聚焦超声不会在中风后大脑中引起出血

考虑到使用聚焦超声后线粒体递送的显著改善，我们询问在急性缺血期间使用聚焦超声是否会引起任何额外损伤，如出血。首先，我们获得了4只处于急性缺血性tpMCAo中风阶段的小鼠的T1和T2加权Gd-DTPA增强磁共振成像扫描。接下来，我们在大脑缺血侧的皮质和纹状体区域上，将磁共振成像引导的聚焦超声递送至3个不同的焦点。聚焦超声暴露后，使用类似的Gd-DTPA磁共振成像序列对所有动物进行再次成像。此外，在聚焦超声后，我们采集了梯度回波T2*加权磁共振成像序列以检测脑出血。对聚焦超声前后T1磁共振成像序列的评估显示，聚焦超声靶向区域的平均灰度强度值有预期增强。因此，磁共振成像的结果为缺血和聚焦超声对血脑屏障局灶性通透化的协同效应提供了额外支持。此外，梯度回波序列未在这些小鼠中检测到任何脑部大出血。最后，使用组织学染色检查微出血。我们对所有接受3次靶向聚焦超声递送的大脑梗死区域进行了连续切片，未发现血管损伤或出血的迹象。因此，有限使用聚焦超声可以安全有效地增强中风大脑中的线粒体递送。

神经元和大脑中的其他细胞整合输注的线粒体

为了追踪线粒体外渗后的命运，我们通过免疫组织化学和共聚焦成像研究了线粒体输注大脑的冠状切片。使用针对神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的特异性抗体，以确定这些细胞类型在脑实质中与线粒体荧光信号的共定位。线粒体可见于细胞外空间和血管内皮中。然而，在所有血脑屏障受损的测试条件下，移植的线粒体也紧密贴近并整合到所有研究的细胞类型中。我们未注意到研究的细胞类型之间存在任何优先整合。为了进一步研究线粒体与细胞的整合，我们分析了4个中风大脑半暗带区域的728个神经元，使用Z堆栈并量化了神经元与线粒体共定位的百分比。我们发现，在半暗带区域，85%的神经元整合了移植的线粒体。为了加强细胞内定位的证据，我们还使用Imaris软件包对共聚焦Z堆栈进行了3D体积渲染。我们识别出荧光斑点，与线粒体一致，这些斑点已被内化到脑细胞（包括神经元）的细胞质内部。

由于MitoTracker是一种合成染料，在某些条件下可能从线粒体上解离，并意外标记内源性线粒体，我们还使用了表达DsRed变体MitoTimer的基因标记线粒体来证实我们的结果。与MitoTracker（一种膜结合的合成染料，即使在碎片化和降解的线粒体中也能保持显著荧光）不同，MitoTimer是一种可溶性的线粒体基质蛋白。如果MitoTimer从受损的线粒体中泄漏，该蛋白会在胞质溶胶中被稀释并被蛋白酶体降解。或者，如果线粒体通过线粒体自噬被降解，MitoTimer蛋白会被溶酶体酶完全降解。我们之前已经证明，所有MitoTimer信号都是Cox4阳性的，即来源于线粒体，这支持了MitoTimer是完整线粒体可靠标志物的说法。

移植的线粒体提高中风侧半球的ATP浓度

我们通过测试线粒体输注是否增加大脑中的ATP浓度来评估代谢挽救。使用tpMCAo范式，我们在C57Bl/6小鼠中诱导中风，并递送新鲜分离的线粒体。两小时后，我们快速冷冻大脑，并通过生物发光法测定每个半球的总ATP浓度。在缺血半脑解剖大脑中测量到内源性ATP水平的预期下降。聚焦超声增强的动脉内输注以及线粒体悬液的直接立体定向注射均将总ATP恢复到对照水平。令人惊讶的是，最高总ATP水平是在未使用聚焦超声辅助的动脉内输注后达到的，显著高于其他组。因此，线粒体输注似乎改善了梗死大脑中的基础ATP含量，为缺血组织提供外源性能量支持。

线粒体移植改善细胞活力并减少梗死面积

为了解决线粒体移植是否减少梗死面积，我们使用流式细胞术在单细胞水平上研究梗死面积减少的基础。小鼠接受tpMCAo，随后动脉内输注新鲜分离的线粒体。手术后两小时，将大脑解离成单细胞悬液，用Live/Dead-Aqua染色评估细胞活力，并使用流式细胞术分析。我们显示了门控策略和基于活力的区分的稳健性。我们发现，缺血大脑细胞悬液中活细胞的比例从68.40% ± 1.70%下降到32.47% ± 13.95%。单独动脉内输注线粒体显著挽救了缺血大脑中的细胞活力，但仍低于正常大脑值。

最后，我们使用了永久性远端大脑中动脉闭塞中风模型，该模型产生的缺血性损伤比短暂性近端闭塞更具可重复性。远端大脑中动脉电凝后，在实验小鼠中通过插我们继续翻译讨论部分及之后的内容。

讨论部分（续）：

远端大脑中动脉电凝后，在实验小鼠中通过插管至同侧颈总动脉输注新鲜线粒体悬液，而对照组仅接受悬浮缓冲液。输注后24小时，提取大脑，切片，并用TTC染色以评估梗死体积。重要的是，线粒体输注使梗死体积减少了34%，从9.919 ± 2.154 mm³降至6.523 ± 1.659 mm³。

讨论

我们提供了证据表明线粒体移植可能作为缺血性中风的治疗干预措施。首先，我们展示了可以在临床相关的时间尺度内从健康肌肉中分离出线粒体。其次，我们证明了动脉内注射线粒体可以以微创方式灌注到血管外空间，并且这种外流可以通过聚焦超声进一步增强。第三，来自间质空间的线粒体被缺血区域内的多种细胞类型整合。第四，线粒体移植提高了脑实质中的ATP浓度，这可能为缺血组织的部分代谢挽救提供基础。最后，线粒体输注后，脑梗死体积减小，细胞存活率增加。

线粒体功能障碍是神经系统疾病的主要诱因。线粒体对于缺血性中风期间神经元的存活尤其关键，补充线粒体功能可以逆转细胞死亡并保护缺血半暗带免受进一步损伤。鉴于缺血性中风的治疗窗口狭窄且医疗选择有限，自体线粒体移植为脑梗死的治疗干预提供了一种有吸引力的范式。

关于脑缺血性损伤，Zhang等人通过立体定向注射将线粒体移植到中风大鼠的侧脑室中。他们的数据显示脑梗死体积减少，神经发生增加，并逆转了神经功能缺损。该研究还发现星形胶质细胞增生、细胞氧化应激和凋亡减少。尽管这些结果非常令人鼓舞，但直接向侧脑室进行脑室内注射本身就具有侵入性，这会给中风患者增加额外的围手术期时间和风险。此外，侧脑室仅占整个成人脑容量的约1%，这使得这种递送途径在临床角度上不太有利。此外，我们之前已经注意到，立体定向实质内注射在中风情况下不太可能有用，因为与动脉内递送相比，其递送范围有限。

我们的结果支持线粒体移植的动脉内途径。虽然正常的血脑屏障对输注的线粒体通透性不高，但内皮屏障在急性缺血性中风阶段会同时开放。这些结果也得到了最近一项研究的支持，该研究显示静脉内递送线粒体在中风后有益。动脉内途径相对于静脉内途径的优势包括可能更高浓度的线粒体特异性地递送到再灌注的大脑，以及更少的非特异性递送和扩散到其他组织。无论哪种方式，通过血管递送都能确保标记的线粒体在实质中均匀分布，明显优于立体定向注射。动脉内途径还能稳健地补充脑组织外源性ATP，这可能有助于缺血区域的代谢恢复。

我们的数据还表明，通过谨慎使用聚焦超声，可以进一步提高缺血性血脑屏障的通透性。在实验室环境中，通过聚焦超声对注射的微泡产生的机械效应，血脑屏障通透性持续增加。使用聚焦超声，我们能够实现大分子向远端缺血半暗带的增强递送。通过聚焦超声实现增强递送似乎很有吸引力，我们表明可以在动物中风模型中建立有效、安全且无出血的条件。然而，我们承认，在聚焦超声辅助的动脉内输注后，我们的功能测试产生了较低的整体ATP水平和细胞活力；最终，需要对这种不一致性进行进一步研究，但我们推测与聚焦超声辅助递送相关的超声处理可能导致ATP水平和细胞活力的下降。

负责将细胞外线粒体整合到缺血半暗带存活细胞中的分子机制尚不清楚。已有几种过程被提出介导内化，包括内吞作用、纳米管形成、间隙连接或连接蛋白桥。最近一项研究发现，从健康细胞向受损神经元转移线粒体在体内自然发生。缺血诱导的星形胶质细胞释放线粒体涉及CD38-cADPR途径，而线粒体向神经元的转移似乎依赖于整合素介导的Src/Syk信号。然而，中枢神经系统中的其他细胞类型已被证明能够整合来自细胞外空间的线粒体，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。使用两种不同的线粒体标记策略（合成和基因荧光团），我们观察到线粒体整合到几种不同的细胞类型中，没有明显的偏好。

我们的研究并未明确解决线粒体输注产生益处的确切机制。可能还有其他旁分泌效应在起作用。例如，线粒体成分可能调节炎症或其他保护性级联反应。然而，值得注意的是，Ramirez-Barbieri等人研究了在完全主要组织相容性复合体不匹配的皮肤同种异体移植物的移植排斥系统中，注射同种异体线粒体后的免疫和损伤相关分子模式相关反应，发现单次或多次注射同种异体线粒体没有直接或间接、急性或慢性的同种异体反应性或损伤相关分子模式相关反应。感兴趣的读者可以参考我们最近的综述，其中讨论了线粒体介导神经保护的潜在机制。关于这些细胞能量工厂如何负责损伤后观察到的表型变化，仍存在一些悬而未决的主要问题。

这项研究，像过去许多其他研究一样，合并了雄性和雌性受试者的结果。性别差异在损伤恢复中的作用是一个激烈讨论的领域，例如在创伤性脑损伤后有显著的差异例子。结果合并是本研究的潜在局限性。

我们提出，自体线粒体移植非常适合补充和增强血运重建治疗，以为中风患者带来最大益处。尽管聚焦超声在此背景下增强线粒体递送的作用仍不清楚，但我们确实表明可以在动物中风模型中建立安全且无出血的聚焦超声条件。

补充材料

扩展材料与方法

在线图1、2、3

作者贡献

Pedro Norat、Jennifer D. Sokolowski、Petr Tvrdik和M. Yashar S. Kalani设计研究；Pedro Norat、Jennifer D. Sokolowski、Sauson Soldozy、Jeyan S. Kumar、Youngrok Chae、Catherine M. Gorick、Khadijeh A. Sharifi和M. Yashar S. Kalani进行实验，Pedro Norat、Catherine M. Gorick、Sauson Soldozy、Jennifer D. Sokolowski和M. Yashar S. Kalani分析数据。Kaan Yagmurlu、Melanie Walker、Michael R. Levitt、Zhen Yan和Richard J. Price协助研究设计。Pedro Norat、Jennifer D. Sokolowski、Petr Tvrdik和M. Yashar S. Kalani撰写论文，Petr Tvrdik和M. Yashar S. Kalani编辑手稿。

资金来源

本研究由美国国立卫生研究院资助。Catherine M. Gorick获得美国心脏协会奖学金支持。Michael R. Levitt获得R01NS105692资助，Petr Tvrdik获得R21NS116431资助。Mohammad Kalani获得聚焦超声基金会资助。

披露

作者声明无竞争性经济利益或披露。

致谢

我们衷心感谢弗吉尼亚大学医学院脑免疫和胶质细胞中心的资源。感谢G. Wilson Miller和William Garrison在磁共振成像方面的协助，以及Stacey Criswell在透射电子显微镜方面的帮助。我们还感谢Kalil Alves de Lima和Aminata Coulibaly在流式细胞术方面的建议和有益建议。感谢Daniel Miranda（Bitplane）的图像分析支持。

脚注

[第一次在线发表后于3月23日添加更正：在通讯详细信息中，大学名称已更正为弗吉尼亚大学健康系统。]

[2023年3月23日添加更正：在上述隶属关系详细信息中，为C.M.G.和R.J.P.添加了作者缩写。]

补充材料

文件 (svi212727-sup-0001-final.pdf)

补充信息

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