摘要
布坦内塔普是一种口服小分子RNA靶向药物，能抑制多种神经毒性聚集蛋白的翻译，包括淀粉样前体蛋白(APP)和Tau蛋白。它已在13项临床试验中对1000多名参与者（包括健康志愿者、阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)患者）进行了评估，并显示出良好的安全性和耐受性。在两项早期AD小型研究中，布坦内塔普显示出认知改善的趋势，尽管功效评估能力不足。在一项早期PD的2期研究中，它也改善了PD患者的认知功能。我们在本3个月随机双盲剂量范围研究(NCT05686044)中评估了布坦内塔普治疗轻中度AD患者的安全性和功效。351名患者被平均随机分配到7.5 mg、15 mg、30 mg布坦内塔普或安慰剂组。布坦内塔普安全性良好。该研究未达到主要终点(ADAS-Cog-11和ADCS-CGIC)，因为40%的参与者缺乏淀粉样蛋白病理。然而，在淀粉样生物标志物阳性的轻度AD患者中，布坦内塔普显示出具有统计学意义的剂量依赖性认知获益，并得到靶点和通路参与的生物标志物证据支持。建议进一步评估布坦内塔普在此患者群体中的效果。目前正在进行一项3期试验以确认这些发现(NCT06709014)。
引言
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病，仅在美国就影响超过700万人，是老年人痴呆最常见的原因[1,2]。AD以及许多其他神经退行性疾病的特点是记忆丧失、认知能力下降以及个性和行为改变[1,3]。目前可用的对症治疗方法不能延缓疾病进展[4]，而最近获批的针对淀粉样蛋白的单克隆抗体Leqembi和Kisunla在18个月内使认知下降减缓了27-35%[5,6]。然而，尽管该领域近期取得进展，AD继续代表着一个重大的未满足医疗需求。
过去10年研究表明，AD患者大脑中发现多种神经毒性蛋白聚集[7,8,9]。淀粉样斑块和tau神经原纤维缠结与疾病明显相关[10]，但其他错误折叠蛋白如α-突触核蛋白(αSYN)和TDP43在AD患者大脑中也已被发现升高[11,12,13,14]。尽管它们在AD中的确切作用尚未完全了解，当前研究表明，除了淀粉样蛋白和tau之外还具有多种错误折叠蛋白的患者可能疾病进展更快[14,15]。因此，靶向多种神经毒性蛋白的治疗策略可能比靶向单一神经毒性蛋白的策略更有益。
布坦内塔普(也称为Posiphen)的独特作用机制使其成为AD的潜在有希望的疗法。布坦内塔普是一种口服生物可利用小分子，可抑制几种神经毒性聚集蛋白(如APP、Tau、αSYN、亨廷顿蛋白、TDP43和朊病毒蛋白)的翻译[16-27]。在阿尔茨海默病合作研究(ADCS)进行的Discover研究中，布坦内塔普显示出剂量依赖性的APP和Aβ40合成显著减少，这通过使用13C6-亮氨酸标记所有新合成蛋白质的稳定同位素标记动力学(SILK)分析得到证实[22]。这一观察结果支持布坦内塔普是人类APP合成抑制剂的作用机制。此外，在多项动物和人类研究中，布坦内塔普治疗有效降低了APP及其下游产物总Tau(t-Tau)、磷酸化Tau(pTau)和αSYN，这些在小鼠或大鼠大脑和患者脑脊液中进行了测量，进一步支持其作用机制[18,20,22,26,28-31]。
布坦内塔普已在13项临床试验中对1000多名受试者(包括健康志愿者和AD及PD患者)进行测试，总体安全且耐受性良好。在任何临床试验中，均未报告与布坦内塔普治疗相关的严重不良事件(SAEs)。
布坦内塔普在治疗AD和PD患者方面的功效已在三项研究中得到证实。在一项早期AD患者的1b期研究和一项包括早期AD和早期PD参与者的2a期研究中，参与者每天一次(QD)接受布坦内塔普或安慰剂治疗25天[28]。虽然这两项研究均未针对功效进行足够样本量设计，但布坦内塔普(60和80 mg)在AD患者中显示出认知(阿尔茨海默病评估量表-认知子量表(ADAS-Cog11))和速度(韦氏成人智力量表编码(WAIS编码))方面的改善(80 mg vs 安慰剂 ADAS-Cog11 -4.4±2.04 vs -1.1±2.63；60+80 mg vs 安慰剂 ADAS-Cog11 -3.93±1.58 vs -1.41±2.04；在两组中，与基线相比，布坦内塔普治疗在统计学上改善了ADAS-Cog11)。在同一2a期研究中，PD患者接受了5-80 mg的布坦内塔普QD治疗。其中，接受10和20 mg治疗的参与者在运动能力(运动障碍协会-统一帕金森病评定量表(MDS-UPDRS))和速度(WAIS编码)方面显示出最强的统计学显著改善，优于80 mg治疗组。在最近完成的2/3期研究中，20 mg布坦内塔普改善了PD患者的认知(数据准备中)。AD和PD患者中布坦内塔普的可比药代动力学(PK)提示需要进一步探索其AD治疗的剂量范围。
本研究建立在我们早期研究基础上，旨在研究三种不同剂量的布坦内塔普(7.5、15和30 mg)与安慰剂相比，在3个月内对轻度和中度AD参与者(NCT05686044)的安全性和功效。
结果
参与者处置和人口统计学
总共701名轻中度AD患者在美国54个研究中心接受筛查。总体而言，351名参与者被纳入研究，分配到布坦内塔普和安慰剂组。研究将88、87和87名参与者随机分配到三个布坦内塔普剂量组(7.5 mg、15 mg和30 mg)，89名参与者分配到安慰剂组，其中95.5%、92.0%和90.8%的布坦内塔普组参与者以及92.1%的安慰剂组参与者完成了12周的研究。所有组中断研究的主要原因相似—参与者自行退出(所有布坦内塔普治疗组合计n=6(2.3%)；安慰剂组n=2(2.2%))。因不良事件(AEs)中断研究的比例在布坦内塔普接受者中为1.9%(n=5(1.9%)总计；n=1为15 mg，n=4为30 mg)。
人口统计学在治疗组之间平衡，年龄、种族或BMI没有显著差异。所有参与者的平均年龄为73.6岁，各治疗组之间为73.1至74.7岁。50.6%至65.5%的参与者为女性。种族和少数民族群体占研究参与者的41%以上(人口统计数据见补充表1)。
超过99%的所有参与者在研究过程中接受了伴随药物。最常报告的伴随药物分类是精神兴奋剂，占所有治疗组参与者的84.4%。其中，最常报告的药物是抗胆碱酯酶抑制剂(51.7%的参与者)。
布坦内塔普在轻中度AD参与者中具有良好的安全性
安全性是研究的主要目标，通过不良事件、伴随药物监测、12导联心电图、临床实验室检测、生命体征评估、体格和神经系统检查以及哥伦比亚自杀严重程度评定量表(C-SSRS)进行测量。安全性总体包括346名接受至少一剂研究药物的参与者。
布坦内塔普安全性良好，在所有剂量组中均耐受良好。治疗出现的不良事件(TEAEs)在所有三个剂量组合并的布坦内塔普接受者中为33.3%(86/262)，在安慰剂接受者中为26.1%(23/88)。与研究药物相关的TEAEs在所有三个剂量组合并的布坦内塔普接受者中为8.9%(23/258)，在安慰剂中为3.4%(3/88)。虽然与研究药物相关的TEAEs比例在布坦内塔普剂量组中数值上更高，但与安慰剂相比没有统计学差异，且与TEAEs数量相关的剂量依赖性关系也不存在(7.5 mg、15 mg和30 mg分别为10.5%、9.4%和6.9%)。三名30 mg布坦内塔普接受者(3/87，3.4%)和三名安慰剂接受者(3/88，3.4%)经历了严重的TEAE，但在任何治疗组中均无与研究药物相关的严重TEAE。在严重程度评估中，所有研究组的所有TEAEs均为轻度和中度(轻度范围：19.5%至24.4%；中度范围：5.7%至13.8%)，无严重TEAE。最常见TEAEs(>5%)发生在"感染和侵染"系统器官类别中(如尿路感染、COVID-19等)，所有三个剂量组合并的布坦内塔普接受者中为10.1%(26/258)，安慰剂中为6.8%(6/88)，以及在"神经系统疾病"中(如头晕、头痛等)，布坦内塔普接受者中为5.8%(17/258)，安慰剂中为5.7%(5/88)(不良事件汇总数据和按系统器官类别分类的TEAEs见补充表2和3)。在任何个体组中报告≥2名参与者的与药物相关的TEAE为头晕(所有布坦内塔普治疗组合计5/346，1.4% vs 安慰剂组1/88，1.1%)、头痛(所有布坦内塔普治疗组合计3/346，0.9% vs 安慰剂组0/88，0%)和恶心(所有布坦内塔普治疗组合计2/346，0.6% vs 安慰剂组0/88，0%)。
APOE4是发展AD最重要的遗传风险因素之一[32-37]。安全性数据进一步按APOE4携带状态分层。APOE4携带者中AEs的严重程度没有增加。所有TEAEs在携带者和非携带者中均被归类为轻度或中度。在APOE4携带者中，所有三个剂量组合并的布坦内塔普接受者中有42.1%出现TEAEs，而安慰剂组为34.2%；严重TEAEs的参与者在所有三个剂量组合并的布坦内塔普组中为0.8%，在安慰剂组中为7.9%。在APOE4携带者或非携带者中，没有与研究药物相关的严重TEAEs(按APOE4携带状态分列的AE汇总数据见补充表4和5)。
主要分析结果
研究的主要假设是布坦内塔普治疗(合并三个治疗组，即意向治疗(ITT)人群)在减轻轻中度AD参与者的认知障碍和功能障碍方面优于安慰剂，通过两个共同主要终点(12周时ADAS-Cog11与基线相比的变化和12周时阿尔茨海默病研究-临床总体印象变化(ADCS-CGIC)评分)进行评估。对于研究功效考虑，所有三个活性治疗组合并并与对照组比较进行主要和关键次要分析。
在ITT人群中，布坦内塔普和安慰剂组在ADAS-Cog11方面均得到相同程度的改善。两组在ADCS-CGIC和ADCS-ADL中也观察到类似的改善(表1)。由于主要终点未达到，其余分析均被视为探索性分析。
生物标志物阳性(pTau217)轻度AD参与者中布坦内塔普改善认知(事后分析结果)
在本研究中，参与者根据NIA-AA 2011 AD诊断标准入组[38,39]，未使用CSF/血浆生物标志物或PET成像作为患者纳入/排除标准来确认AD诊断。最近研究表明，CSF和血浆pTau217是tau和淀粉样蛋白病理的可靠指标[40,41]。在试验进行期间，pTau217的诊断性血浆生物标志物检测变得商业化可用。因此，在数据库锁定前实施了此生物标志物，以确认AD病理(由pTau217/t-Tau比率指示)，并揭示约38%的参与者没有淀粉样蛋白负担，因此不符合AD的生物学定义。只有62.1%(n=216)的参与者被确定为具有AD病理。这些生物标志物阳性患者在所有剂量组中均匀分布，基线ADAS-Cog11相当(补充表6)。
基于生物标志物阳性参与者(pTau217/t-Tau ≥4.2%)的亚组分析进一步按MMSE评分分层；轻度AD由MMSE评分21-24(n=95)表示，中度AD由MMSE评分14-20(n=115)表示，有6名参与者的基线MMSE评分超出14-24范围，因此未包括在内。在中度AD参与者中，ADAS-Cog11未显示治疗相关的基线变化(图2a)。然而，在轻度AD参与者中，观察到剂量依赖性反应，布坦内塔普与基线相比显示出名义上统计学上显著的改善(图2b)。改善在治疗6周后即已观察到，尽管当时统计学上不显著。到12周时，安慰剂效应在安慰剂组中似乎减弱，而治疗组继续显示改善(补充图1)。ADCS-CGIC的亚组分析未显示与安慰剂相比的治疗相关改善(图2c, d)。
布坦内塔普在轻度AD中对不同人口统计学特征的参与者显示出类似治疗效果，包括APOE4携带者和非携带者(事后分析结果)
将30 mg布坦内塔普与安慰剂比较的进一步亚组分析显示在森林图中(图3)。这些分析评估了布坦内塔普对各种参与者亚组的效果，包括年龄、BMI、种族、性别、种族和伴随药物。令人鼓舞的是，布坦内塔普在所有组中显示出与安慰剂相比的一致良好效果。
布坦内塔普显示出降低神经毒性蛋白和炎症并增加轴突完整性的趋势(事后分析结果)
在生物标志物阳性的轻度AD患者(MMSE 21-24)和所有生物标志物阳性AD患者(MMSE 14-24)中检测了几种血浆生物标志物(Tau、TDP43、IL5、IL6、S100A12、IFN-γ、IGF1R、GFAP和NFL)，以评估布坦内塔普的靶点和通路参与(图4)。
为了测试布坦内塔普对神经毒性聚集蛋白的效果，我们检测了血浆t-Tau和TDP43(图4a, b)。在轻度AD患者中，安慰剂组在12周后血浆t-Tau水平较基线增加，而30 mg布坦内塔普组保持相对不变，表明可能降低了Tau。
虽然TDP43主要涉及肌萎缩侧索硬化症、额颞叶变性和与年龄相关的TDP-43脑病，但TDP43包涵体已在高达57%的AD病例中发现[14]。目前尚无检测脑源性TDP43的既定方法。我们使用Quanterix检测法检测血浆TDP43，该方法可识别蛋白的全长和病理截短形式。有趣的是，安慰剂组中血浆TDP43水平略有增加，而在30 mg布坦内塔普组中显著降低。
由于尚无AD特异性炎症标志物，检测了血浆IL5、IL6、S100A12、IFG-γ、IGF1R和GFAP(图4c-h)。
促炎通路，包括白细胞介素6(IL6)通路，已被充分证明在AD中发挥作用[42]。较高循环IL6水平的遗传易感性被报告与AD风险增加相关[43]。在动物模型中，降低IL6导致淀粉样蛋白负担减轻、炎症减弱和认知改善[44]。虽然研究较少，但研究也表明IL5在神经退行性疾病中的作用[45]。在轻度AD患者中，安慰剂组IL6略有下降，而30 mg组显示出约三倍的更大降幅。对于IL5，两组水平均升高，但安慰剂组的增幅几乎是30 mg组的两倍。
S100A12(也称为钙粒蛋白C)是一种属于S100钙结合蛋白家族的蛋白质[46]。它在包括炎症在内的几个细胞过程中发挥作用，并被报道为AD的潜在炎症生物标志物。在安慰剂组中，3个月后检测到显著增加，表明炎症升高。相比之下，与基线相比，30 mg布坦内塔普组几乎没有变化。
干扰素γ(IFN-γ)是一种可溶性细胞因子，在诱导和调节一系列免疫反应中发挥重要作用。在AD小鼠模型中，IFN-γ被证明增强淀粉样蛋白沉积并抑制小胶质细胞对淀粉样蛋白的降解[47]。在本研究中，IFN-γ水平在安慰剂组中增加，而在30 mg治疗组中降低。
胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)是一种受体酪氨酸激酶。在AD动物模型中，抑制此通路被证明可减弱不溶性淀粉样蛋白[48]。降低IGF1R蛋白也改善了AD小鼠的认知表现。与IFN-γ类似，其水平在安慰剂组中增加，在30 mg治疗组中降低。
血浆GFAP水平已被建议与AD病理生理学有强有力关联，特别是在早期阶段[49,50]。在本研究中，治疗组和安慰剂组的血浆GFAP水平均增加，未检测到治疗效果。
最后，测试了神经丝轻链(NFL)作为神经元损伤的标志物。据报道，它在包括AD在内的多种神经退行性疾病中升高[51,52]。如预期，血浆NFL水平随时间在安慰剂组中增加。值得注意的是，在30 mg布坦内塔普组中，血浆NFL水平与基线相比在12周时显示下降，表明可能减少了神经元损伤(图4i)。
在生物标志物阳性AD患者(MMSE 14-24)中观察到所有上述生物标志物的类似趋势(图4j-r)。
总体而言，生物标志物结果显示布坦内塔普治疗(30 mg)降低了血浆t-Tau、TDP43、IL5、IL6、S100A12、IFN-γ、IGF1R和NFL。
讨论
本剂量范围研究结果表明，布坦内塔普在轻中度AD参与者中具有良好的安全性。在ITT人群中，布坦内塔普未达到AD患者相对于安慰剂的主要和共同主要终点。然而，事后分析显示，在生物标志物阳性的轻度AD患者中，与基线相比，通过ADAS-Cog11测量的认知能力有名义上统计学上显著的剂量依赖性改善。
确定适当的患者群体对临床试验至关重要，本研究证实了这一点，其中约40%的参与者尽管符合纳入/排除标准，但不符合AD的生物学定义。这些数据与报告显示的30-40%临床诊断AD患者没有淀粉样蛋白病理一致[53]。此外，每组具有相对平衡数量的生物标志物阳性患者，这进一步支持差异主要是由于误诊造成的。这进一步强调了生物标志物在患者识别和分层中的重要性。
AD[54]的血浆生物标志物(pTau217)作为诊断工具的最新发现允许对人群进行事后分层，以仅关注具有确认疾病的人。尽管承认其局限性，但我们在此轻度AD组中进行了事后分析。令人鼓舞的是，布坦内塔普在所有亚组(年龄、BMI、性别、种族、APOE4携带状态、伴随药物)中均显示出治疗效果，无论基线特征如何。这与我们先前研究的结果一致。在我们的1b期Discover研究和2a期AD/PD研究中，尽管两项研究均未针对功效进行足够样本量设计，但布坦内塔普治疗在早期AD患者中显示ADAS-Cog改善[28]。我们正在一项针对760名早期AD患者的18个月关键研究中验证这些发现。
在轻度AD患者中未检测到ADCS-CGIC的治疗效果，这很可能是由于患者数量有限。由于该量表的主观性质，需要更多患者才能检测到任何有意义的差异。在我们最初的功效分析中，我们指定将所有三个布坦内塔普治疗组(N=240)合并，以检测标准差为0.5时0.22点的差异。在正在进行的早期AD研究中确保了适当的功效。
与我们之前观察到的一致，布坦内塔普在轻中度AD患者中具有良好的安全性，并且耐受性良好。APOE4是发展AD的领先遗传风险因素之一[34,35]。APOE4携带者易患AD，纯合子人群中概率超过90%[36]。此外，APOE4纯合子由于目前可用的单克隆抗体，对发生淀粉样蛋白相关成像异常(ARIA)(如肿胀(ARIA-E)和微出血(ARIA-H))的风险要高得多[6,55,56]。在我们的研究中，布坦内塔普治疗在所有AD患者中显示出与APOE4状态无关的相当安全性和疗效，使其成为这一高度脆弱人群的有希望的治疗选择。
由于布坦内塔普的独特作用机制，本研究中允许使用标准护理对症AD药物，超过84%的所有参与者使用了精神兴奋剂(抗胆碱酯酶抑制剂或其他抗痴呆药物)。布坦内塔普出色的安
全性支持其作为单一治疗以及与其他对症疗法联合使用。这对于患者继续现有药物同时添加布坦内塔普特别重要，无需停用任何一种药物。在我们未来的研究中，测试布坦内塔普与最近批准的淀粉样蛋白单克隆抗体一起的治疗效果将很有趣。
测试了几种血浆生物标志物以证明靶点和通路参与。首先，我们测试了神经毒性聚集蛋白的水平。目前用于AD诊断和分期的标准使用淀粉样蛋白和Tau作为定义AD的核心AD生物标志物，而TDP-43和突触核蛋白反映常见的并发病理或合并症。
由于血浆生物标志物的局限性，我们无法测量血浆APP，尽管我们之前的2a期研究显示布坦内塔普降低了CSF中的APP水平[28]。由于研究持续时间短，治疗组或安慰剂组中血浆Aβ42/40比率均未发生变化。血浆Aβ42/40比率已用作皮层淀粉样蛋白沉积的替代生物标志物，而非预后生物标志物。然而，我们观察到布坦内塔普治疗后血浆t-Tau降低。较高的血浆t-Tau被报告与AD痴呆相关，且与较高的CSF Tau相关，但相关性较弱[57]。最近的一项研究强调了一种新型生物标志物—脑源性Tau(BD Tau)，可用于评估AD相关的神经退行性过程[58]，我们计划在未来研究中评估BD Tau。TDP43是另一种与AD病理相关的标志物，与更严重的认知障碍相关，在APOE4携带者中尤为普遍[14]。尽管血浆TDP43与脑TDP43聚集体之间的关系尚不清楚，但我们的数据表明布坦内塔普降低了血浆TDP43。需要进一步研究以充分了解血浆TDP43与AD进展的相关性。
此外，我们评估了与阿尔茨海默病相关的六种炎症生物标志物(IL-5、IL-6、S100A12、IFN-γ、IGF1R和GFAP)。令人鼓舞的是，30 mg治疗组在除GFAP外的所有标志物上均显示出一致降低，表明可能具有抗炎作用。这些数据表明炎症减轻，这是AD的标志。
最后，我们测试了NFL，一种神经元健康的已确立生物标志物[51,52]。布坦内塔普治疗显示NFL降低的趋势，表明神经元损伤减少。
这些结果与我们之前观察到的一致。在Discover研究中，我们报告了CSF中新合成的APP和Aβ40实时下降[22]。在我们的2a期研究中，我们进一步观察到CSF中多种神经毒性蛋白的降低、多种炎症因子的降低以及神经元突触功能的保存[28]。这些生物标志物数据支持布坦内塔普作为神经毒性蛋白翻译抑制剂的作用机制和通路参与。
重要的是，我们在所有生物标志物阳性AD患者的血浆中也观察到了相同的趋势，而不仅仅是轻度AD患者，进一步验证了药物的作用机制。虽然布坦内塔普治疗显示中度AD患者炎症因子降低，但在此患者群体中未显示临床功效，这可能是由于研究持续时间短。我们计划在未来研究中进一步调查这一点。
如前所述，本研究未针对检测个体剂量与安慰剂相比对功能结果测量ADCS-CGIC的治疗效果进行充分功效设计。此外，缺乏AD病理的生物标志物确认导致约40%的入组参与者可能没有AD。我们的分析集中在具有确认或可能AD的事后亚组患者上，但这些分析不是预先指定的，也未针对多重性进行调整，尽管该亚组内的基线特征通常平衡。在我们当前的3期研究中，我们通过纳入基于生物标志物的患者选择、进行适当的功效计算以及应用严格的预先指定统计分析来解决这些局限性，以确保稳健和可解释的结果。
总体而言，在生物标志物阳性的轻度AD患者中，布坦内塔普显示出改善患者认知的有希望结果。由于其独特的作用机制，它有可能在改善认知功能的同时修改潜在的疾病病理。因此，我们正在一项针对760名早期AD患者的大型3期研究中验证本研究的症状学发现，并测试其潜在的疾病修饰效果，该研究目前正在开展中。这是一项双随机、安慰剂对照、多中心研究，针对生物标志物确认的早期AD患者，有6个月和18个月的数据读出(NCT06709014)。
方法
研究药物
布坦内塔普，(3aR)-1, 3a, 8-三甲基-1, 2, 3, 3a, 8, 8a-六氢吡咯(2, 3-b)吲哚-5-基苯基氨基甲酸酯酒石酸盐(研究性新药#72,654)，根据良好生产规范(GMP)法规制造(Wilmington PharmaTech, Newark, DE)。研究药物产品和匹配的安慰剂(含有标准制药辅料)作为速释固体口服剂型提供。它们在硬胶囊壳中制备，并由Frontida BioPharm(Philadelphia, PA)按照GMP法规制造。
参与者
应用以下纳入标准：(1)根据NIA和NIA-AA标准诊断为AD；(2)55至85岁个体；(3)MMSE 14-24；(4)有研究伙伴提供书面知情同意参与，与参与者频繁接触(每周至少10小时)，并陪同参与者参加研究访问；(5)具有生育能力的女性参与者必须尿妊娠试验阴性，非哺乳期，并同意在试验期间和最后一次给药后4周使用高效避孕方法；无生育能力包括手术绝育或绝经后无月经出血至少一年；(6)男性参与者必须绝育、无性生活，或同意在研究期间和最后一次给药后一个月不使人生育，并同意使用屏障方法避孕；男性参与者的女性伴侣必须采用高效避孕方法；(7)参与者可提供书面知情同意；(8)根据哥伦比亚自杀严重程度评定量表评估，无当前自杀意念或过去两个月内自杀尝试，过去六个月内无自杀行为；(9)允许药物在筛查前至少稳定4周；(10)足够的视力和听力能力(执行所有研究评估的身体能力)；(11)一般健康状况良好，无预期干扰研究的疾病。排除标准见补充方法1。从所有参与者及其研究伙伴获得书面知情同意，研究方案由中央机构审查委员会Advarra批准(2023年1月23日原始批准)。
随机化
签署知情同意并符合筛查资格要求的参与者以1:1:1:1比例随机分配到活性(三个布坦内塔普剂量水平：7.5 mg、15 mg和30 mg)和安慰剂治疗组，使用Rave RTSM系统通过置换块随机化。这是一项四盲(参与者、护理提供者、研究者和结果评估者)研究。
试验设计
针对12周治疗，计划招募320名轻中度AD患者。所有患者同意自愿参与临床试验。样本量确定用于评估当合并所有三个活性治疗组时布坦内塔普的功效和安全性。充分表征PK并支持潜在剂量比例分析，以及关注布坦内塔普作用机制和通路参与的血浆生物标志物，也在本研究中进行了探索。
参与者在家接受7.5 mg、15 mg或30 mg布坦内塔普QD或安慰剂治疗12周。共同主要(ADAS-Cog 11 & ADCS-CGIC)和关键次要(ADCS-ADL)功效终点在基线治疗前、6周和12周治疗后评估。在基线和试验结束访问前收集用于PK和生物标志物的血样，并在治疗后4小时内收集。
生物标志物检测
使用C2N的免疫沉淀-质谱(IP/MS)工作流程在血浆样本中测量pTau217和t-Tau肽浓度。对每个样本进行两次单独测量，一次测量pTau217特异性肽，一次测量t-Tau特异性肽。两种肽均从同一样本中测量，并在Waters Acquity M-Class液相色谱(LC)单元上以96孔板格式分析，该单元连接到Thermo Fusion Lumos Tribrid质谱仪(MS/MS)[59]。使用tau特异性抗体富集pTau217蛋白。LC-MS/MS用于分离、识别和量化人血浆中tau肽(氨基酸212-221)的浓度，这些肽在Thr-217处磷酸化(pTau217)或不在Thr-217处磷酸化。必要时合并血浆等分试样，并使用Hamilton STAR®液体处理仪和Kingfisher Flex设备准备最终样本体积。
血浆生物标志物神经丝轻链(NFL)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，以及TDP-43在美国马萨诸塞州比勒里卡的Quanterix进行了测试。NFL和GFAP使用其Simoa®神经学2-Plex B试剂盒(N2PB)进行测试。根据制造商说明使用商业可用的Simoa®神经学2-Plex B试剂盒。使用Simoa HD-X分析仪在Single Molecule Array (Simoa)技术上进行测定[60]。血浆样本按4×稀释，并以重复方式运行。计算每个样本重复的平均值，如果重复之间的变异系数<25%，则将结果包括在分析中。所有测量均在自动HD-X分析仪上进行(Quanterix, Billerica, MA, USA)。对于血浆TDP-43水平，将人类患者的样本(n=501)按4×稀释，并以重复方式测定。计算每个样本重复的平均值，如果重复之间的变异系数(%CV)<25%，则将结果包括在分析中。
血浆IL5和IL6由DiamiR Biosciences测试。使用Ella自动化免疫测定平台(Bio-Techne)进行测定，该平台在运行启动后无需手动干预即可操作。该系统通过气动方式与微流控Simple Plex™试剂盒接口，这些试剂盒预装有经验证的试剂，包括匹配的抗体对，从而简化了测定设置并消除了标准曲线准备的需要。对于每个测定，将50 μL稀释样本和洗涤缓冲液加入试剂盒指定的孔中，按照制造商说明。然后将试剂盒插入Ella仪器中进行全自动处理，包括试剂处理、洗涤和在严格控制条件下的孵育。每个试剂盒包含多个流体通道，每个通道容纳三个玻璃纳米反应器(GNRs)，每个GNR预涂有捕获抗体，从而实现IL5和IL6的三重测量。在分析过程中，样本流经微流控通道，目标分析物被捕获并通过预装的检测试剂检测。未结合的成分被洗掉，信号生成在GNRs内发生。通过嵌入每个试剂盒的预校准标准曲线进行量化，在不到90分钟内提供完全分析结果。
血浆IFN-γ、IGF-1R、S100A12由杜克大学Laurie Sanders博士的实验室测试。使用夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)在血浆样本中测量细胞因子和/或受体水平。使用人高灵敏度ELISA试剂盒测量IFN-γ水平(Abcam, ab46048)。使用人ELISA试剂盒测量IGF-1 R(RayBiotech, ELH-IGF1R)，使用人ELISA试剂盒测量S100A12(Abcam, ab282299)。为每个分析物和板执行并绘制标准曲线。所有测定均按照制造商说明进行。检测灵敏度分别为IFN-γ、IGF-1 R和S100A12的69 pg/mL、6 pg/mL、1.89 pg/mL。
药代动力学(PK)
为确定人血浆中布坦内塔普的浓度，在Charles River验证了高效液相色谱质谱检测方法。该方法后来转移到Sannova Analytical LLC，在那里进行了部分验证和样本分析。使用氘化布坦内塔普作为内标，以确保准确的浓度评估。生物分析方法按照当前FDA、行业指南和OECD原则执行。按照当前GCP和GLP原则进行人血浆中布坦内塔普的测定，并呈现实PK分析结果。
样本量
样本量确定为为主要功效终点ADAS Cog11提供足够的统计功效。假设双侧α为0.05，合并布坦内塔普和安慰剂组之间的平均差异为2.7点，共同标准差为6.0，需要总共280名参与者(210名活性，70名安慰剂)才能达到90%的功效。对于共同主要终点ADCS CGIC，此样本量提供了89%的功效来检测0.23点的差异。考虑到预计12.5%的退出率，计划招募约320名参与者(每臂80名)，采用1:1:1:1随机化设计。
统计分析
使用SAS版本9.4进行统计分析。共同主要终点是12周时ADAS-Cog11评分和ADCS-CGIC评分与基线相比的变化。ADAS-Cog11通过重复测量的混合模型(MMRM)进行分析。ADAS-Cog11模型包括治疗、时间点和治疗-时间点交互作为固定效应，基线ADAS-Cog11作为协变量，参与者作为随机效应。ADCS-CGIC模型包括治疗、时间点、治疗-时间点交互作为固定效应，参与者作为随机效应。使用非结构化协方差矩阵，并使用Kenward-Roger近似来调整分母自由度。假设主要分析中缺失数据随机缺失。为评估此MAR假设的稳健性，对两个共同主要终点分析的缺失数据应用了基于缺失非随机(MNAR)假设的保守控制型多重插补方法。亚组分析使用类似模型。与治疗差异变化相关的与基线相比的变化基于该模型的最小二乘均值。报告了治疗差异的双侧95%置信区间。PK终点基于对血浆中布坦内塔普水平的评估。在基线和试验结束访问前的0小时以及1、2和4小时收集样本。
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