摘要
慢性伤口，尤其是糖尿病患者的伤口，由于微血管受损和愈合延迟，构成了重大的临床挑战。本研究提出了一种名为Exo-Q的新型热响应水凝胶，该水凝胶由工程化Q蛋白纳米纤维与外泌体（一种囊泡细胞间通讯介质）共凝胶化形成。Exo-Q在生理温度下从凝胶转变为粘弹性溶液，实现了外泌体的局部、局部递送，先有爆发性释放后持续释放。在糖尿病小鼠伤口模型中，Exo-Q有效将人骨髓多能基质细胞来源的外泌体直接递送到伤口床，外泌体在肉芽组织内皮细胞中积累而无明显的系统性分布。在严格且可复制的细胞培养条件下产生的外泌体始终携带富含miRNA的生物大分子货物，这些miRNA在血管生成相关基因中有经验证的靶点，表明其具有治疗潜力。Exo-Q的局部应用导致了广泛的血管化肉芽组织，显著加速了伤口闭合，达到与非糖尿病伤口相当的水平。重要的是，该水凝胶的模块化设计保持了Q蛋白纳米纤维和外泌体的功能完整性，展示了与全层人伤口的兼容性。该平台允许定制化调整，以解决糖尿病伤口愈合的关键阶段，同时确保低剂量下的有效性，可能使患者能够自行治疗。通过利用先进的生物材料，Exo-Q提高了基于外泌体的糖尿病伤口干预的治疗效果，为慢性、不愈合的伤口提供了一种局部、非侵入性的解决方案。这种创新的水凝胶平台代表了一种模块化治疗策略，在再生医学的临床应用中具有巨大潜力。
引言
将小细胞外囊泡(sEVs)递送到慢性皮肤伤口，特别是糖尿病溃疡的实验治疗，已引起广泛关注。慢性或不愈合的皮肤伤口保持开放超过一个月，并停滞在炎症阶段，而不是典型的向闭合的多相进展。严重的皮肤微血管受损是糖尿病的特征，也是哺乳动物皮肤伤口愈合时空性质所需分子相互作用的主要障碍。尽管慢性伤口的患病率与心脏病相似，5年死亡率与癌症相当，但临床上有效的慢性伤口治疗方法仍然难以捉摸。这些统计数据强化了迫切需要有效的治疗方式，以可预测地解决不愈合伤口的复杂病理，特别是那些包括严重受损微血管的伤口。EV赋予的愈合优势表明了一种有希望的组织工程替代方案，如全球大量近期转化科学研究所示。
小EV或外泌体是直径30–150纳米的质膜结合分泌纳米囊泡，携带来自源细胞的RNA、蛋白质和其他生物物质；这种货物在与受体细胞相互作用时影响多种生化和细胞过程。我们和其他人已经使用人骨髓多能基质细胞(BMSCs)及其外泌体成功促进严重受损愈合的动物模型中的伤口闭合。基于MSC外泌体的糖尿病伤口疗法协调组织水平变化，表现出比单一细胞因子方法更好的疗效。这种相对较新的组织工程途径的安全临床转化需要科学严谨性，从严格验证的BMSC细胞培养到EV制备表征开始。
确保外泌体制备在糖尿病伤口部位有效且可用需要优化的递送方法。将EVs作为治疗的研究大多报告皮下点状注射，但此类注射后的保留和分布高度可变。水凝胶提供了持续递送的潜力，因为它们可以吸收和捕获EVs，就像它们对三维聚合物链网络中的小分子所做的那样。我们先前报道了Q蛋白，它们自组装成高阶纳米纤维，物理缠结形成热响应水凝胶，重要的是，不含可能干扰所需递送的交联剂。可塑的Q水凝胶在达到哺乳动物温度时经历凝胶到溶液的转变，表现出上临界溶液温度(UCST)行为。这些特性使Q区别于大多数非蛋白质水凝胶，后者在哺乳动物组织相关温度下经历溶液到凝胶的转变。这种区别使Q成为将外泌体货物递送到糖尿病伤口床和外围的不均匀伤口表面和细胞环境的理想选择。Q水凝胶中携带的外泌体可以提供一种临床可转化的材料，可以减少慢性或延迟伤口的病理特征。
在本研究中，我们展示了两种纳米级构建块——BMSC外泌体和Q蛋白纤维——的整合，生成了一种称为Exo-Q水凝胶的新实体。Exo-Q水凝胶是一种独特的治疗性热响应聚合物水凝胶，其中外泌体与纳米纤维相关联，而不是在基质中。它非常适合皮肤上的局部给药，并延长伤口中外泌体的寿命。与传统的水凝胶材料（例如壳聚糖、甲基纤维素、透明质酸）不同，传统水凝胶材料在加热到体温时从溶胶转变为凝胶以形成凝胶库（即LCST行为），Q在较低温度下凝胶并在体温下恢复为溶胶状态（即UCST行为）。这种相变使其适应糖尿病伤口的不规则地形，并对伤口环境做出反应，同时保持治疗效力。我们还建立了一个严格的框架，用于源人BMSCs和外泌体制备的可重复性和广泛表征。我们证明了在异种移植模型中，有限的局部局部应用Exo-Q水凝胶在促进小鼠糖尿病伤口闭合过程中的血管新生的影响和可行性，以及在异种移植物模型中对人皮肤的兼容性和血管递送。受有效治疗的临床需求启发，我们的研究提供了一种新颖的、非侵入性的组织工程治疗选择，可以减少糖尿病伤口病理——采用从床边到实验室，再回到床边的方法。
正文片段
小EV/外泌体制备在人类捐赠者之间可重复且一致
为评估BMSCs和外泌体的一致性，我们对来自多个人类捐赠者的两者进行了表征。表型表征显示BMSCs为CD31⁻ CD45⁻ CD11b⁻ CD19⁻ HLA-DR⁻。超过99%的细胞表达CD44、CD73、CD105、CD90，超过78%表达CD106，而少于5%表达CD36。我们先前发现小鼠BMSCs的多能性与其促进LepRᵈᵇ/ᵈᵇ 2型糖尿病模型伤口愈合的能力密切相关。
讨论
慢性不愈合的糖尿病溃疡常常导致下肢截肢，在美国占非创伤性截肢的近70%以及25%的住院率，并且是全球致残的主要原因。当前的护理标准包括：评估疾病和社会史、反复进行侵入性措施如物理或生化清创、减重、抗生素和频繁换药。这些方法的各种组合...
外泌体制备
我们从塑料贴壁人BMSCs的条件培养基中分离外泌体制备物。我们采用已发表的方案并进行了修改，以优化从我们的细胞类型和培养条件中获得的外泌体的产量和质量。经过一系列差速离心去除死细胞、细胞碎片和中大型囊泡后，我们通过200纳米PES滤器过滤上清液。我们在Sorvall Wx超速离心机中以100,000×g离心90分钟沉淀外泌体制备物...
作者贡献声明
Bibi S. Subhan：数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、初稿撰写、审阅与编辑。Sydney Hanson：数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、初稿撰写、审阅与编辑。Dianny Almanzar：数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、初稿撰写、审阅与编辑。Juan F. Cortes Troncoso：调查、方法学、撰写...
资金支持
美国国立卫生研究院K01HL155234 (PR)。
国家科学基金会2203664（合作研究：JKM, PR）。
纽约大学临床与转化科学研究所，作为美国国立卫生研究院国家推进转化科学中心UL1 TR001445的一部分 (PR)。
纽约大学教务长办公室Mega Grant种子基金 (JKM, PR)。
美国国立卫生研究院/国家癌症研究所5P30CA016087（Laura和Isaac Perlmutter癌症中心支持补助，部分支持EP、显微镜、CCS、GTC、PCI）。
共享仪器补助S10 OD021747 (EP)。
NIBIB生物医学...
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能被认为影响本文报道工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢纽约大学医学院实验病理学(EP)、显微镜、细胞分选与细胞计数(CCS)、基因组技术中心(GTC)和临床前成像(PCI)核心实验室的专业知识、支持和对此工作的协助。我们还要感谢前NanoView Biosciences公司对ExoView数据的帮助。我们感谢Shane Liddelow博士及其实验室促进安装...
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