摘要
背景
放射性食管炎是头颈部癌症放疗的常见不良反应，其特征是食管肌肉组织的不可逆损伤和纤维化。虽然间充质干细胞(MSC)疗法作为一种有前景的组织再生方法正在兴起，但由于细胞在体内的存活率和分化问题，临床转化仍具挑战性。本研究使用辐射诱导的食管纤维化小鼠模型，评估了转染肌源性基因(MyoD、Myogenin、Myf6，称为Myo-MIX)的MSC衍生外泌体的再生功效。
方法
通过电穿孔将人类脂肪来源的MSCs转染Myo-MIX质粒，并使用ExoQuick从条件培养基中收集外泌体。采用纳米颗粒跟踪分析和透射电子显微镜对这些外泌体的大小和形态进行表征。建立局部辐射诱导的食管损伤小鼠模型(10 Gy × 2剂量)，随后通过肌肉内注射Myo-MIX外泌体。通过Masson三色染色、免疫组织化学(α-SMA、Calponin、CD68)和定量RT-PCR检查再生和抗纤维化效果。
结果
与PBS处理对照组和普通MSC-外泌体组相比，Myo-MIX外泌体治疗导致纤维化和炎症反应明显减少。观察到肌肉结构的恢复增强，伴随着Calponin和α-SMA表达的升高，以及CD68+巨噬细胞浸润的减少。基因表达谱分析显示，Myo-MIX外泌体治疗组中肌源性和抗纤维化标志物的水平增加。
结论
肌源性基因转染的MSCs产生的外泌体显著增强放射损伤后食管肌肉的再生并减轻纤维化。这种无细胞治疗方法有望成为解决接受头颈部恶性肿瘤放疗患者放射性食管炎的新颖而实用的策略。
引言
头颈部癌症目前是全球第七大常见癌症类型，平均五年生存率仍仅为50%。鳞状细胞癌约占头颈部癌症的90%，主要发生在口腔、咽部和喉部。尽管质子治疗和化学放射治疗已有进步，但放射治疗(RT)仍然是标准且最有效的治疗方法。然而，RT可能触发氧化应激和炎症，导致食管粘膜下层和肌肉组织的微环境发生病理变化。这些变化可能导致持续的副作用，显著影响患者的生活质量。辐射诱导的损伤始于电离辐射从细胞内水分子产生羟基自由基，造成细胞DNA损伤。这一过程触发细胞因子和趋化因子的释放，引发组织炎症和成纤维细胞的活化。随后，巨噬细胞和免疫细胞的活化促进促炎介质TGF-β的产生，降低组织氧饱和度，导致组织溃疡。此外，胶原蛋白和其他细胞外基质分子的过度积累最终导致不可逆的组织瘢痕，即纤维化。
辐射诱导的DNA损伤包括对关键肌源性基因的损害，导致持久性吞咽困难。因此，恢复这些基因对功能恢复至关重要。在我们之前的研究中，我们确定了食管肌肉层中的关键基因，包括MyoD、Myogenin和Mrf-6，将它们克隆到非病毒载体中，并引入人类来源的间充质干细胞。然后将这些修饰细胞植入辐射诱导的食管纤维化动物模型中，以评估基因治疗效果。在本研究中，我们旨在强调基因转染MSCs衍生外泌体作为新型治疗方法的治疗潜力。
先前研究表明间充质干细胞(MSCs)在辐射损伤组织中具有免疫调节和再生潜力。我们的研究小组还表明，包埋在透明质酸(HA)水凝胶中的间充质干细胞球体(MSC-SPs)可以再生功能性食管肌肉和粘膜上皮。然而，由于在体外扩增后局部微环境中的分化和增殖能力不足，其全部治疗潜力仍然有限。当前研究旨在通过预处理策略和基因工程来增强MSC功能。预处理涉及通过暴露于低氧条件、细胞因子和生长因子来开发改进的MSCs。此外，基因修饰正在被探索以进一步增强MSCs的治疗特性。最近，我们的研究小组证明，与移植普通MSCs相比，将与肌再生相关基因Myo D、Myo G和Myf-6非病毒共转染的MSCs移植到小鼠辐射损伤食管肌肉中，可显著改善肌肉再生。尽管功能强大的MSCs具有相当大的治疗前景，但其有限的可用性、固有的异质性和苛刻的处理要求继续阻碍临床应用。这突显了需要替代策略，仍能提供基于MSC疗法的固有特性。
最近研究表明，MSCs的有益效果，如免疫调节和组织再生，是通过外泌体介导的——这些是小的细胞外囊泡，通过携带各种生物活性分子(包括脂质、细胞因子、生长因子、蛋白质等)在细胞间通讯中发挥关键作用。与基于细胞的治疗方法相比，MSC衍生的外泌体具有治疗优势，因为它规避了致瘤性和不当分化等风险。MSC衍生外泌体的给药已被证明通过抑制TH17细胞和诱导Tregs来增强存活并减少cGVHD模型中的病理损伤。此外，MSC衍生的外泌体已被发现通过递送miR-18来减轻小鼠模型中的心肌缺血再灌注损伤，这改变了巨噬细胞的极化状态。此外，MSC衍生的外泌体增强了血管内皮细胞的增殖和迁移，从而支持组织愈合并改善心肌细胞的再生和功能恢复。
虽然高功能MSCs显示出免疫调节和组织再生的潜力，但其异质性、分离、培养、储存的复杂技术要求以及增加的成本限制了其广泛的治疗应用。在本研究中，我们通过引入Myo-mix基因生成了高功能MSCs，随后分离了它们的外泌体，并将其移植到小鼠辐射诱导的食管病变中，以评估修复效果。
方法和材料
细胞准备
骨髓来源的间充质干细胞(BMMSCs)购自Lonza(Basel, Switzerland)，并在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素(PS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM, LONZA, BioWhittakerTM, USA)中培养。每2天更换培养基，并使用0.05%胰蛋白酶-EDTA(1X, 酚红, Gibco, USA)进行亚培养以分离细胞。
Myo-mix表达质粒克隆用于转染
通过PCR扩增Myo-MIX基因。将扩增的序列和pEGFP-C1表达载体进行克隆，由BIONICS(Seoul, South Korea)进行，得到整合Myf6、Myo D和G表达质粒的Myo-MIX质粒。
电穿孔和转染效率确认
使用Neon™转染系统(Invitrogen™, Neon™, USA)将Myo-MIX质粒转染到BMMSCs中。最佳转染参数设定为1000 V、40 ms脉冲宽度和2次脉冲。转染24小时后，通过荧光显微镜(LEICA, DMI4000B)和流式细胞仪(BD LSR II)评估转染效率。
ExoQuick外泌体分离
使用基于聚合物沉淀的方法ExoQuick-TC从组织培养基中分离外泌体。将指定体积的ExoQuick-TC与培养基混合，在4°C下孵育过夜。随后通过在1500 xg下离心30分钟回收外泌体，将所得沉淀重悬于合适的溶液中。
纳米颗粒跟踪分析
使用NanoSight NS300(Malvern Instruments Ltd., UK)和纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术表征外泌体的大小分布和浓度。在分析前，将外泌体样品按1:100比例稀释于1 mL过滤的PBS中。在定义的捕获参数下进行NTA，并在流动模式下进行数据采集。使用NTA 3.0软件(Malvern Instruments)处理结果数据，确定外泌体浓度和粒子大小分布。
透射电子显微镜(TEM)准备
进行透射电子显微镜(TEM)以评估分离的外泌体的形态。样品制备包括固定外泌体并通过TEM成像。对于TEM分析，将外泌体沉积到碳膜支撑的镍网格上。将1 μg/mL等分试样(10 μL)应用于膜上，然后在空气中干燥10分钟以上。干燥的样品随后通过TEM进行形态评估。
肌肉分化和免疫荧光染色
为了进行肌肉分化，将1×10^6个BM-MSCs暴露于含有载体的外泌体(Vector Exosome)或来自转染了三个基因的MSCs的外泌体(Myo-MIX Exosome)中。在细胞增殖两天后，将培养基更换为肌源性诱导培养基(高葡萄糖DMEM补充5%马血清、100 mM地塞米松和10 ng/mL碱性FGF)，并维持分化三周。在三周过程中，每三天更换一次培养基，然后对细胞进行针对calponin和myogenin的免疫荧光染色。简言之，样品用1×PBS冲洗，用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.1% Triton-X 100透化，然后使用兔单克隆抗calponin(1:200; Santa Cruz Biotechnology)和鼠抗myogenin抗体(1:200; Santa Cruz Biotechnology)染色；使用的二抗包括Alexa Fluor® 488山羊抗兔(Abcam, UK)和Alexa Fluor® 488山羊抗鼠(Invitrogen)。使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI; Vector Laboratories)进行核染色。使用共聚焦显微镜(LSM510 META; Carl Zeiss, Germany)进行成像。
实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)
使用TRIzol®试剂(Thermo Fisher Scientific)从分化细胞中分离总RNA。使用Nanodrop® ND-1000评估RNA样品的浓度和纯度。随后使用RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems, USA)进行cDNA合成。使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master(Roche, Switzerland)通过实时PCR评估两个实验组的基因表达。使用ΔΔCt方法量化每个靶基因的相对表达水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部参考。使用的引物序列见补充表1。
辐射诱导的食管纤维化动物模型
所有动物实验均按照首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会制定的指南进行(批准号：24-0134-S1A0)。通过照射8周龄C57BL/6小鼠(orientbio, Korea)开发食管纤维化动物模型。40只雄性小鼠随机分配到五个组：1)正常组，2)盐水注射(对照组)，3)Vector-Exo，4)MSC-Exo，和5)myo-mix Exo注射组。在实验前，所有动物接受5 mg/kg甲苯噻嗪和20 mg/kg Zoletil 50的皮下麻醉。在照射前，每只小鼠的颈部毛发被剃除。对于辐射暴露，使用Truebeam直线加速器(Varian Medical Systems, Palo Alto, CA, USA)产生的6-MV X射线。每只小鼠以750MU的剂量率接受照射，目标是仰卧位时距10 cm处的颈部中央区域。照射过程包括两个疗程，总剂量为10 Gy，间隔一周。
基因转染MSC衍生外泌体向食管肌肉层的注射
第二次照射后一天，小鼠使用5 mg/kg甲苯噻嗪和20 mg/kg Zoletil 50的皮下注射进行麻醉。手术区域用酒精消毒后用碘伏，动物仰卧位固定。创建颈部中央切口，通过小心分开带状肌肉将食管与气管分离。在手术显微镜下，使用带有26G针头的100 μl注射器(Hamilton, Reno, NV, USA)将20 μl基因转染MSC衍生的外泌体直接注射到食管肌肉层中。使用5-0 Vicryl缝线闭合肌肉层和上覆皮肤，并以1.6 mg/kg剂量皮下注射美洛昔康进行镇痛。小鼠每天观察一周，检查呼吸困难和体重减轻等临床症状。四周后，对所有动物实施安乐死进行后续组织学分析和qPCR。
qPCR分析
为表征各组的基因表达谱，在注射后四周收集食管组织并在LN2中快速冷冻。使用Qiazol®裂解试剂(QIAGEN Sciences, MD, USA)从彻底匀浆的组织中提取总RNA。使用LeGene Premium Express First Strand cDNA Synthesis System(LeGene Bioscience, USA)按照制造商协议将提取的RNA逆转录为cDNA。对于qPCR，每份样品使用1 μg RNA与Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific, USA)在Step One Plus RT-PCR系统(Thermo Fisher Scientific, USA)上进行。GAPDH作为内部参考基因用于标准化。使用的引物序列可在补充表1中获得。
组织学检查
为进行组织学评估，所有实验动物在注射后四周通过CO2气体吸入实施安乐死。固定包含目标区域的食管组织于4%多聚甲醛中。组织随后脱水并包埋在石蜡块中，从中切割5 μm厚的切片。切片去石蜡并经过梯度乙醇系列脱水。随后，按照制造商说明使用H&E和Masson三色染色。使用弹性纤维染色试剂盒(Catalogue # ES4807, Azer Scientific, USA)按照提供的方案可视化弹性纤维。使用ImageJ软件通过选择黑色和棕色颜色量化弹性含量(%)。在每张幻灯片的六个区域上进行定量测量，重复三次，由盲法观察者进行。使用光学显微镜(Olympus, Japan)以200×和400×放大倍率获取每个切片的组织学图像。使用ImageJ(NIH; n=5每组)量化内食管层(IEL)厚度。
免疫组织学分析
使用CD68抗体和DAB染色检测巨噬细胞，而肌肉和食管上皮层则通过组织免疫荧光染色(抗-Calponin、抗-α SMA、抗-CK5)进行评估。实验程序如下。将组织切片浸入3%过氧化氢(H2O2)中15分钟，以抑制内源性过氧化物酶。用PBS洗涤后，切片在室温下用3% BSA封闭非特异性结合位点1小时。对于CD68染色，切片在4°C下与一抗孵育1小时。随后在室温下与生物素化二抗孵育1小时，然后用PBS洗涤。使用ABC溶液形成Abidin-生物素复合物30分钟，并使用DAB(Vector, Catalogue # PK-7800, Vector Laboratories, USA)进行显色检测。使用苏木精进行核复染。在五个随机选择的视野中(200×放大倍率)(n=6)对CD68阳性细胞进行量化。Calponin、CK5和α-SMA免疫荧光遵循相同协议。一抗在3% BSA中于4°C孵育24小时，二抗在1% BSA中于室温(RT)孵育1小时。经过三次PBS洗涤后，用DAPI染色细胞核。用于Calponin、CK5和α-SMA的抗体分别为鼠单克隆Calponin抗体(Catalogue # sc-58707, Santa Cruz Biotechnology, USA)、鼠多克隆CK5抗体(Catalogue # ab3525, Abcam, UK)和鼠单克隆α-SMA抗体(Catalogue # ab8352, Abcam, UK)。使用的二抗依次为(Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor® 488, Catalog # ab150077, Abcam, UK)、(Goat Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor® 569, Catalog # ab654255, Abcam, UK)和(Goat Anti-mouse IgG Alexa Fluor® 569, Catalog # ab330459, Abcam, UK)。使用ImageJ软件确定Calponin阳性肌肉层的厚度(n=4每组)。此外，每份样本分析六个独立视野进行计算(n=4每组)。
统计分析
通过单因素方差分析(ANOVA)评估统计显著性。适当时应用Tukey-Kramer事后检验。使用GraphPad Prism 5(La Jolla, CA, USA)进行统计分析。数据以平均值±标准差表示。p<0.05，p<0.01，和p<0.001表示统计显著差异。
结果
肌源性基因转染
在我们之前的研究中，我们证明了转染Myo-mix基因的MSCs促进了食管肌肉再生。在本研究中，我们的目标是评估转染Myo-mix基因的MSCs分泌的外泌体介导的肌肉再生潜力。对于Myo-mix基因克隆，将MyoD、MyoG和Myf6基因插入非病毒载体EGFPN中，随后通过非病毒转染方法引入MSCs。通过显微镜和流式细胞术确定这些基因转染到MSCs的效率。显微镜分析表明基因转染到MSCs的效率大于80%。相应地，流式细胞术结果证实MSCs中对照载体和Myo-mix构建体的转染效率均超过84%。这些结果表明Myo-mix基因可以高效转染到MSCs中。
外泌体分离和分析
通过透射电子显微镜(TEM)检查了从转染野生型质粒载体和Myo-mix载体的MSCs分离的外泌体的形态。通过纳米颗粒跟踪分析确定了外泌体的定量特性，包括大小分布和浓度。评估显示，从转染Myo-mix载体的MSCs中分离的外泌体具有高浓度，平均直径为146 nm。
Myo-mix外泌体对MSCs体外肌肉分化潜能的增强
为评估转染Myo-mix基因的MSCs衍生的外泌体对肌肉分化的影响，将这些外泌体引入MSCs的肌肉分化诱导过程中。分析了与平滑肌分化相关的标记物calponin和肌肉生成过程中关键调节因子myogenin的表达水平。结果显示，在用转染Myo-mix的MSCs衍生的外泌体处理的组中，calponin和myogenin的表达显著增加。
此外，对分化相关基因calponin、α-SMA和SM22-alpha进行了基因表达分析。三个基因的平均表达水平在Myo-mix外泌体处理组中比载体-外泌体组高超过三倍。总体而言，这些结果表明，转染Myo-mix基因的MSCs衍生的外泌体显著增强了MSCs在体外的肌肉分化能力，表现在基因和蛋白质表达水平上。
食管层的组织学变化
注射后四周，使用H&E染色评估食管组织的粘膜下层和上皮层的形态变化。盐水组表现出食管上皮层不规则结构和增加的基底细胞数量。相比之下，所有三个外泌体处理的实验组均显示出上皮层排列趋向改善。
注射部位的内食管层(IEL)厚度和弹性纤维含量
在辐射后食管粘膜下层中发现显著的病理改变，特别是胶原层的积累，如Masson三色染色所示。盐水组表现出粘膜下层明显增厚和过度增殖。相比之下，Vector-Exo (30.1±4.2)、MSC-Exo (28.6±3.8)和Myo-mix (35.6±4.6)实验组的粘膜下层厚度(IEL)明显低于盐水组(50.2±4.5)。
作为食管组织弹性指标的弹性纤维分布通过弹性特异性染色进行评估。在400×放大倍率下，粘膜下层中的弹性纤维呈黑棕色，对其分布进行量化。在辐射暴露后的盐水处理组中，食管内皮形成厚而不规则的纤维层，导致弹性纤维数量减少。相比之下，Myo-mix Exo组(6.04±0.65)与盐水(2.04±0.81)和vector-Exo组(3.84±0.33)相比，弹性纤维数量显著增加。
食管再生
通过CK5免疫荧光染色评估辐射后受损上皮层的再生情况。在盐水组中，上皮基底细胞表达呈散在不一致。定量分析显示，与盐水对照组相比，所有外泌体处理组的基底细胞再生平均增加一倍以上。
使用Calponin免疫染色观察每组食管肌肉层的组织学变化。盐水组表现出内环形和外纵行肌肉结构破坏(黄色箭头)，导致明显的肥大形态。值得注意的是，Myo-mix Exo组(116.7±11.9)表现出恢复的肌肉层结构，与vector-Exo组(163.0±16.2)和MSC-Exo组(149.5±15.6)相比，食管肌肉厚度显著降低。这些结果表明Myo-mix Exo组实现了约87%的正常组织恢复。
巨噬细胞数量变化和粘膜肌层再生
使用CD68免疫染色评估了注射转染Myo-mix基因的MSCs衍生外泌体四周后靶组织中巨噬细胞的存在情况。通常，辐射诱导的食管组织纤维化导致巨噬细胞表达升高。各组之间的定量比较表明，与正常组相比，盐水组中巨噬细胞分布显著增加。盐水处理组中的CD68阳性巨噬细胞数量(26±3)比正常组织(2.5±1)平均增加了十倍以上。相反，包含遗传物质的三个外泌体组与盐水组相比，巨噬细胞表达显著降低。这些发现证实外泌体给药有效抑制了纤维化组织环境中的M1巨噬细胞。
通过α-SMA免疫染色检查辐射暴露后食管粘膜肌层的再生情况。在辐射一个月后，盐水组中通常无法检测到粘膜肌层。Vector-Exo和MSC-Exo队列中明显看到粘膜肌层的再生特征。有趣的是，Myo-mix外泌体组与Vector-exosome和MSC-exosome组相比，粘膜肌层表达显著增加，大约翻倍。
肌源性和平滑肌标志物的qPCR分析
食管组织的上层由横纹肌组成，下层靠近胃的部分由平滑肌组成。此外，注射基因修饰外泌体的中央区域表现出横纹肌和平滑肌的形态特征。因此，本研究选择了这两种肌肉类型的特定分子标志物，使用qPCR进行基因表达分析。关键转录因子Mrf4在Myo-基因混合外泌体组中比vector外泌体组显著上调1.7倍。Myf5作为肌肉特异性靶基因表达和肌源性分化的关键调节因子，在所有三个外泌体组中比盐水对照组增加了四倍以上。此外，对骨骼肌发育和肌肉形成与修复至关重要的Myogenin在Myo-mix Exo组中比其他两个实验组(Vector-Exo & MSC-Exo)显著上调。这些结果表明，基因修饰MSC衍生外泌体传递的三个基因显著促进了食管骨骼肌层的发育。此外，平滑肌的典型标志物Calponin和SMA22α在携带三个基因的外泌体处理组中显示出比缺乏这些基因的两组显著增加。特别是，calponin基因在Myo-基因混合外泌体组中比vector外泌体组显著平均增加了1.64倍。这提供了证据表明Myo-mix Exo组对平滑肌再生产生分子效应。
讨论
放射性食管炎患者经常经历脱水、营养不良或治疗中断，这可能会降低放射治疗和药物治疗的疗效。初始辐射暴露后，出现明显的食管组织水肿和显著炎症，导致吞咽困难。在随后的数月到数年中，急性期转变为持续、复发的炎症，其特征是胶原沉积和细胞外基质(ECM)的重塑逐渐进行，最终导致治疗后的食管狭窄。最近的研究集中于辐射损伤后食管组织再生的策略。一项使用大鼠模型的研究表明，牙髓干细胞移植促进了辐射诱导的食管损伤修复，并支持食管上皮层和肌肉层的再生。另一项报告确定了一组持久存在的角蛋白15阳性祖细胞，它们在辐射暴露后持续存在，并在包括肌肉层在内的食管组织再生中发挥积极作用，促进组织稳态和启动损伤后修复机制。此外，应用基于脱细胞细胞外基质的水凝胶结合3D打印食管支架导致辐射损伤后食管结构和功能的显著恢复，特别是肌肉完整性的改善和纤维化的减少。研究放射治疗引起的组织纤维化的研究表明，己酮可可碱和维生素E可能逆转各种组织中的纤维化，暗示它们对食管肌肉纤维化也可能有治疗相关性。其他研究评估了肉毒杆菌毒素和大豆异黄酮的抗纤维化特性，发现它们对粘膜肌层和平滑肌成分具有保护作用。
最近，MSCs作为细胞治疗的中心焦点受到关注，许多临床试验正在研究它们解决各种挑战性疾病的能力。MSCs的治疗益处主要与它们分泌的旁分泌因子有关，这些因子对免疫抑制、抑制细胞凋亡、抗炎反应和促进组织再生至关重要。多项研究表明MSCs释放的称为外泌体的细胞外囊泡具有治疗作用。因此，大量研究集中在了解MSC外泌体的特性以及阐明它们在组织再生中作用的途径上。
先前的研究通过转染肌源性基因—MyoD、MyoG和Myf6—单独或各种组合产生了高功能间充质干细胞(MSCs)。虽然每个基因单独提供抗纤维化和再生益处，但所有三个基因的共转染(Myo-mix)实现了最显著的抗纤维化和肌肉再生效果。基于这些先前结果，本研究使用Myo-mix–转染的MSCs作为治疗，评估它们减轻辐射诱导的食管肌肉纤维化的能力。
临床前研究表明，内食管层(IEL)的肥大是辐射治疗后吞咽困难的主要因素，通常在辐射后四周变得明显。粘膜下层水肿和炎症细胞浸润是辐射诱导食管损伤最常见的表现。当暴露于电离辐射时，上皮细胞和巨噬细胞经历活性氧(ROS)生成的显著增加。这种DNA损伤激活凋亡信号通路并上调促炎细胞因子如NF-κB和TNF-α，进而增强炎症相关基因的表达。随后，TGF-β和COL1A1等纤维化相关基因的过度表达促进了成纤维细胞活化和胶原沉积，最终导致组织纤维化。在本研究中，对辐射食管的组织病理学检查显示组织损伤特征为结构层破坏和基底细胞肥大。此外，盐水组中观察到的食管粘膜下层明显增生在三个实验组(Vector-Exo、MSC-Exo、Myo-mix Exo)中显著减弱。这些发现似乎源于TGF-β通路激活抑制导致的成纤维细胞活化抑制。
食管运动受多种因素影响，如内上皮层、粘膜肌层和食管肌肉层的弹性纤维含量。三个实验组(Vector-Exo、MSC-Exo、Myo-mix Exo)中弹性纤维明显保留，而由于广泛的纤维化改变，这些纤维在盐水组中几乎不存在。食管肌肉层的calponin免疫组织化学分析表明，Myo-mix Exo组不仅保持了典型结构，而且与vector-Exo和MSC-Exo组相比，肌肉层厚度降低。粘膜肌层是位于食管粘膜下层的平滑肌层，对食管的蠕动运动至关重要。使用α-SMA免疫组织化学评估辐射对粘膜肌层的影响。在盐水组中，粘膜肌层几乎不可见，而在所有三个实验组中，特别是Myo-mix Exo组，观察到明显的粘膜肌层。向辐射食管给予MSC衍生的外泌体显著减少了对食管运动至关重要的因素的损伤。有报道称外泌体中发现的抗氧化相关miRNA抑制活性氧(ROS)的生成。这反过来减少了IL-6和TNF-α等炎症基因的表达，可能有助于防止食管纤维化的进展。总体而言，这些发现表明MSC衍生外泌体治疗可能改善辐射诱导食管炎中的食管运动功能恢复。
与辐射食管炎相关的病理改变包括食管粘膜上皮的破坏。在本研究中，我们使用CK5免疫荧光染色评估了辐射暴露后粘膜上皮层的再生情况。在盐水组中，上皮中的基底细胞表达显得零散不一致。相反，定量分析显示，与盐水组相比，所有三个外泌体处理组的基底细胞再生均有显著增强。这些结果突显了外泌体治疗在辐射诱导损伤后促进上皮再生的潜力。
辐射暴露诱导的炎症介质释放促进了巨噬细胞等免疫细胞的浸润，进而激活上皮-间质转化(EMT)通路。随后，成纤维细胞增殖和胶原合成导致的细胞外基质积累导致组织纤维化。在本研究中，我们在注射Myo-MSCs衍生的外泌体四周后使用CD68免疫染色评估了靶组织中巨噬细胞的表达。我们的定量分析显示，与正常组相比，盐水组中巨噬细胞分布显著增加。相比之下，所有三个实验组(Vector-Exo、MSC-Exo、Myo-mix Exo)与盐水组相比，巨噬细胞表达显著降低。这表明在纤维化组织环境中给予外泌体抑制M1巨噬细胞活性，为外泌体在调节炎症反应和可能减轻纤维化方面的治疗潜力提供了证据。
食管组织具有独特的区域特性，上部由横纹肌组成，下部靠近胃的部分由平滑肌形成。这表明注射基因修饰外泌体的中心区域具有横纹肌和平滑肌的特征。在本研究中，我们通过分析选择性标志物表达使用qPCR评估了两个肌肉层的分子变化。接受Myo-mix外泌体的实验组显示出横纹肌细胞标志物(Mrf4、Myf5、Myogenin)的基因表达显著增加。此外，Myo-mix外泌体在实验组中的应用导致平滑肌细胞标志物(Calponin、SM22-α)的表达水平升高。MSC衍生外泌体同时促进骨骼肌和平滑肌再生的能力可能对管理辐射诱导的吞咽困难具有重要意义。因为受损的食管肌肉功能会加剧吞咽困难，支持两种肌肉类型的再生可能会恢复或增强有效吞咽所需的肌肉协调性，正如多项研究所示。这种策略可能使针对肌肉损伤的疗法的开发成为可能，为缓解辐射诱导的吞咽困难和提高患者生活质量提供有希望的选择。
与直接移植肌源性基因转染的MSCs相比，使用MSC衍生外泌体代表了一种显著更安全的策略，用于缓解辐射诱导的食管损伤。首先，作为无细胞载体的外泌体大大降低了与基于干细胞疗法相关的致瘤性和免疫排斥风险。例如，Lai等人(2015)报告说，外泌体缺乏复制能力，从而减轻了与不受控制的细胞增殖和恶性肿瘤发展相关的风险。此外，Vader等人(2016)描述了外泌体定位到损伤组织的内在能力，促进了治疗货物的靶向递送，同时避免了MSC疗法固有的细胞植入和分化等挑战。此外，Kamerkar等人(2017)证明外泌体可以被工程化以递送特定的RNA分子或蛋白质，为个性化治疗干预提供了一个适应性强的平台。总体而言，这些研究证明了与直接MSC移植相比，MSC衍生外泌体具有更优越的安全性和治疗潜力，支持进一步探索基于外泌体的疗法用于辐射诱导的食管损伤。
然而，必须承认本研究的几个局限性。虽然电穿孔比病毒载体风险更低，但质粒DNA仍可能在转染细胞中引发炎症反应，且诱导突变的潜在可能性不能完全排除。此外，疗效评估仅限于相对较短的一个月观察窗口。需要延长评估以确定纤维化基因治疗的长期结果。此外，由于本研究中使用的外泌体来自基因修饰的MSCs，因此需要进一步研究以了解基因转移如何影响其分子组成和生物功能。虽然认为MSC衍生外泌体的治疗效果是由蛋白质、miRNAs和其他生物活性分子介导的，但基因修饰对外泌体货物的影响尚未完全理解。未来的研究应特别检查抗纤维化信号是否发生改变，以及基因相关核酸是否整合到外泌体中。这将有助于阐明基因修饰MSCs衍生外泌体的机制和转化潜力。
结论
总之，我们的研究提供了有力证据，支持肌源性基因转染MSC衍生外泌体在减少辐射诱导食管纤维化方面的有效性。这些结果不仅证实了MSC外泌体已确立的再生潜力，还为扩展其治疗应用提供了见解，特别是针对辐射损伤的食管组织。未来的研究应旨在阐明所涉及的分子途径，并评估这些外泌体在再生医学中的转化潜力。
【全文结束】