冠状动脉闭塞后的早期再灌注可减少急性心肌梗死(AMI)的范围和死亡率。然而，再灌注本身也可能对存活心肌造成损伤，即所谓的"再灌注损伤"。中性粒细胞在缺血和再灌注后被激活并浸润心肌。大量实验研究表明，中性粒细胞在不可逆再灌注损伤的发展中扮演重要角色。激活的中性粒细胞能够释放对心肌有害的物质。例如，如弹性蛋白酶等蛋白水解酶可诱导活性氧(ROS)和细胞因子的形成。髓过氧化物酶(MPO)是一种存在于中性粒细胞嗜天青颗粒或初级颗粒中的溶酶体酶，可作为中性粒细胞活化的标志物。血浆中该酶的活性是评估中性粒细胞浸润缺血心肌的既定测量指标。位于中性粒细胞特异性或次级颗粒中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是另一种中性粒细胞活化的血浆标志物。
动物研究支持这一假说：缺血和再灌注期间产生的ROS会导致细胞功能紊乱。ROS的半衰期极短，介于10⁻⁶至10⁻⁹秒之间，因此在体内难以检测和定量。因此，临床研究者仅限于采用间接方法来检测ROS形成。丙二醛(MDA)是脂质过氧化链式反应的终产物，是最常用的标志物。然而，MDA并非ROS生成的完全特异性标志物，因为它也通过血小板中前列腺素的酶促反应形成。异前列腺素是通过自由基对花生四烯酸的过氧化直接在体内形成的生物活性前列腺素样化合物，被视为更特异的ROS产生标志物。Reilly等学者已证明在急性冠状动脉成形术中异前列腺素形成增加。本研究旨在调查首次发生AMI并接受原发性PCI治疗的患者的炎症反应和ROS形成情况。研究了血清MPO和S-NGAL浓度作为中性粒细胞活化的标志物。基质金属蛋白酶-9(S-MMP-9)被测量为调节基质重塑的蛋白水解系统的标志物。通过测量P-MDA和血浆异前列腺素(P-Iso-P)来研究脂质过氧化。细胞因子白细胞介素-6(P-IL-6)、白细胞介素-8(P-IL-8)和肿瘤坏死因子α(P-TNFα)，以及高敏C反应蛋白(S-hsCRP)被分析为炎症的血清或血浆标志物。
材料与方法
纳入49例首次出现AMI症状的非连续患者。该样本反映了正常的AMI人群。临床特征见表1。所有受试者血流动力学稳定。他们直接从救护车或急诊室转入导管室。纳入标准为通过心电图标准诊断的持续性ST段抬高型心肌梗死，≥2个连续胸前导联ST段抬高≥2mm或≥2个标准肢体导联ST段抬高≥1mm，持续性或复发性胸痛最长持续12小时，以及经冠状动脉造影证实的完全闭塞的梗死相关动脉，TIMI血流0级(TIMI=心肌梗死溶栓，一种既定的血流估计，等级0-3，0级表示无血流，3级表示完全灌注)。本研究的排除标准是PCI术前给予溶栓治疗。在冠状动脉造影前获得口头知情同意，所有研究对象在住院第一日获得书面同意。研究获得当地伦理委员会批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。
所有患者在PCI术前均接受300mg乙酰水杨酸(ASA)和300mg氯吡格雷(Plavix® BMS/Sanofi-Synthelabo, Bromma, Sweden)预处理。所有纳入患者均接受原发性PCI并至少植入1个支架。所有患者均接受血小板糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)受体抑制剂阿昔单抗(Reopro® Lilly, Indianapolis, Indiana)，在PCI术中以每公斤体重0.25mg的剂量静脉注射，术后以相同物质持续10μg/分钟输注12小时。在PCI术中给予普通肝素以达到约250秒的活化凝血时间(ACT)。ACT使用Hemochron®系统(Vingmed, Järfälla, Sweden)测量。
诊断性冠状动脉造影在PCI术前立即进行。识别罪犯病变后，通过股动脉途径使用6Fr导管开始PCI术。根据操作者评估，手术结束时通过造影证实梗死相关动脉治疗区域的再灌注，TIMI血流分级为2-3级。
在手术过程中，所有患者均接受0.2mg硝酸甘油的冠状动脉内推注以扩张血管。所有患者也接受了静脉注射β受体阻滞剂(Metoprolol Seloken® AstraZeneca, Södertälje, Sweden)，剂量为5-15mg。为镇痛和镇静，所有患者接受了静脉注射盐酸吗啡(Morfin®, AstraZeneca, Södertälje, Sweden)，同时给予地西拉嗪(Esucos®, UCB, Malmö, Sweden)和低剂量地西泮(Stesolid®, Alpharma, Stockholm, Sweden)。为维持血流动力学平衡，所有患者接受了静脉输注林格氏醋酸盐或葡萄糖。
在打开闭塞的梗死相关血管前以及再灌注后1.5、3和24小时获取血液样本进行生物标志物分析。样本为静脉血，除第一个样本为动脉血外。该样本通过动脉鞘管在血管再灌注前获取(基线)。由于技术原因，P-MDA在29名患者的亚组中进行分析。所有其他标志物在全部49名患者中分析。所有血液样本均采集于含乙二胺四乙酸(EDTA)的试管、含柠檬酸盐的试管或无添加剂的试管(Becton Dictinson, United Kingdom)中。EDTA试管用于P-MDA、P-Iso-P、P-MPO和细胞因子分析。无添加剂的试管用于S-hsCRP、S-NGAL和S-MMP-9的检测。所有样本均在4℃下以2000×g离心，冷却后在-70℃保存，待相应检测时使用。
P-MDA在数周内进行分析。用于分析P-MPO、P-Iso-P、细胞因子、S-hsCRP、S-NGAL和S-MMP-9的样本在分析前保存1至最多4年。
通过固相夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定人血浆MPO循环水平(OxisResearch, Portland, Oregon)。S-NGAL通过夹心ELISA(Antibody Shop, Gentofte, Denmark)测量。S-MMP-9通过商业可用的ELISA(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)分析。
P-MDA在隆德大学医院临床化学实验室使用实验室内部高效液相色谱法进行分析，P-Iso-P在马尔默大学医院Wallenberg实验室使用ELISA分析(8-Isoprostane EIA Kit Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan)。P-TNFα和P-IL-6通过酶联免疫吸附法(R&D Systems)分析。P-IL-8水平通过CXCL8/IL-8 Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)测定。S-hsCRP通过超敏颗粒增强免疫浊度测定法(Orion Diagnostica, Espoo, Finland)在Konelab 20自动分析仪(Thermo Clinical Labsystems, Espoo, Finland)上测量。S-CKMB和S-TnT在隆德大学医院临床化学实验室使用电化学发光免疫分析法(Hitachi Modular-E, Roche)通过标准程序测定。S-hsCRP、S-MMP-9、S-NGAL、P-IL-6、P-IL-8和P-TNFα在瑞典哥德堡Sahlgrenska大学医院Wallenberg实验室分析。
统计学。统计计算使用Microsoft® Office Excel 2003和配对双尾Student's t检验进行。p值<0.05被认为具有统计学显著性。
结果
研究人群的临床特征、AMI的血清标志物、梗死后心力衰竭的发生率以及PCI术前AMI症状的持续时间见表1。从基线(闭塞血管)到再灌注后1.5、3和24小时，中性粒细胞活化标志物、炎症标志物和ROS标志物浓度的变化见表2。平均P-MPO水平在观察期间显著下降。S-NGAL未观察到显著变化，尽管在再灌注后3小时可检测到下降趋势(p=0.09)。
与基线相比，S-MMP-9在1.5和3小时显著增加。与基线相比，P-MDA水平在24小时时显著下降。在观察期间，P-Iso-P水平未见显著变化。观察到细胞因子P-IL-6和P-IL-8早期显著增加，而P-TNFα在24小时时较晚出现显著增加。如预期，急性期反应物S-hsCRP在24小时时显著增加。
讨论
本研究的主要发现是原发性PCI后的炎症反应解离。血浆中P-MPO和S-NGAL（两种中性粒细胞活化标志物）的浓度分别下降或保持不变，而3种细胞因子(P-IL-6、P-IL-8和P-TNFα)和急性期反应物S-hsCRP在再灌注24小时内增加。此外，我们显示调节基质重塑的蛋白水解系统标志物(S-MMP-9)在原发性PCI后增加，而脂质过氧化标志物(P-Iso-P和P-MDA)分别保持不变或下降。
中性粒细胞活化理论。活性中性粒细胞具有损伤心肌的工具(ROS、蛋白酶)。无再灌注的缺血与中性粒细胞缓慢流入相关，在2-4天达到峰值，主要位于边缘区，坏死中心中性粒细胞较少。然而，再灌注加速了中性粒细胞的浸润和积聚，如在LAD结扎的犬模型中所示，比较闭塞血管与3小时再灌注。
Mullane等证明MPO活性可作为中性粒细胞浸润心肌的定量测量指标。鉴于AMI后中性粒细胞浸润的时间过程如上所述，人们会预期中性粒细胞活化血浆标志物早期但持续升高。相比之下，本研究中血浆MPO水平在PCI前最高，随后在观察期间逐渐下降。值得注意的是，这种下降与已知触发中性粒细胞活化的3种不同细胞因子的同时增加相关。NGAL是一种位于中性粒细胞所谓特异性或次级颗粒中的蛋白质，其血清水平在再灌注后也显示出无显著性的下降趋势。这些结果表明，接受包括阿昔单抗治疗的PCI治疗的患者与接受溶栓治疗的患者相比，中性粒细胞的活化/浸润不同。多项研究者已证明AMI溶栓后来自中性粒细胞嗜天青颗粒的弹性蛋白酶血浆水平迅速升高。
中性粒细胞、炎症和阿昔单抗。Vinten-Johansen讨论了迄今为止将实验条件下成功的抗中性粒细胞治疗转化为临床实践的失败。他提出了临床试验中特定抗中性粒细胞治疗结果为阴性的几个原因，其中之一是AMI的标准辅助治疗可能具有抗中性粒细胞效应。因此，AMI中任何特定抗中性粒细胞治疗的效果必须是阿昔单抗和肝素等药物作用的补充。普通肝素和GP IIb/IIIa抑制剂阿昔单抗均与中性粒细胞的Mac-1受体结合。Neumann等证明阿昔单抗减少了血小板-白细胞相互作用和白细胞Mac-1表面表达，同一研究组先前已证明激活的血小板与中性粒细胞的结合诱导促炎细胞因子的表达、氧化爆发和Mac-1表达增加。Lincoff等在EPIC研究中描述了阿昔单抗治疗对炎症标志物的抑制。我们的结果支持这一观点：采用肝素和阿昔单抗的PCI程序导致的中性粒细胞活化/浸润少于溶栓治疗。如果PCI治疗抑制炎症反应，我们的数据表明中性粒细胞活化受到的抑制比细胞因子产生更大。
也有可能再灌注本身可能减少中性粒细胞的活化/浸润，尽管普遍认为再灌注是中性粒细胞活化的触发因素。这些发现与Bell等报告的结果一致。他们测量了¹¹¹In标记中性粒细胞的摄取，发现接受溶栓治疗的患者心肌中中性粒细胞积聚少于未接受再灌注治疗的患者。然而，溶栓治疗患者的再灌注状态未报告。
ROS理论。还研究了两种脂质过氧化标志物：P-MDA和P-Iso-P。根据先前的实验研究已证明该条件下存在ROS，人们会预期心肌缺血再灌注后P-MDA或P-Iso-P增加。然而，在本研究中，再灌注后P-MDA和P-Iso-P均未显示显著增加。这可能是因为两种标志物都不足以检测心肌中的自由基形成，或者再灌注后未形成显著量的ROS。与中性粒细胞标志物一样，我们先前已观察到PCI患者与溶栓治疗患者的P-MDA时间进程不同。P-MDA在溶栓后增加，但在AMI发生并接受原发性PCI治疗的患者中下降。如果P-MDA浓度反映ROS形成，我们的结果表明PCI后的氧化应激低于溶栓治疗。这种氧化应激降低的可能解释是中性粒细胞活化减少导致ROS形成减少。另一种解释是PCI过程中血小板活化少于溶栓治疗，导致酶促MDA产生减少。在任何观察时间点均未发现P-MDA和P-Iso-P之间存在显著相关性，表明它们可能代表不同的脂质过氧化机制。
梗死后MMP-9。MMP-9属于锌依赖性内肽酶家族。它以其对细胞外基质蛋白的蛋白水解作用及其在长期重塑过程中的参与而闻名。已在AMI患者的冠状动脉斑块碎片中证明MMP-9表达增加。我们在AMI PCI后发现S-MMP-9增加，与Eckhart等先前的报告一致。本研究中血清MMP-9水平升高的来源尚不清楚。MMP-9可来源于心肌、冠状动脉病变或循环中或浸润梗死区域的中性粒细胞。
研究局限性
研究人群规模较小。仅有49名患者具有完整的观察期。在本研究中，未直接比较接受PCI治疗的患者与接受溶栓治疗的患者的中性粒细胞活化，出于伦理原因，未纳入无再灌注治疗的对照组患者。梗死持续时间从45分钟到12小时不等，这无疑会影响炎症反应。
结论
我们发现AMI的PCI后炎症反应存在解离现象，包括：(1)再灌注后细胞因子和CRP增加，但(2)P-MPO减少，(3)S-NGAL无变化，以及(4)P-MDA减少。这些结果与先前对接受溶栓治疗的患者的研究结果不同，后者导致MDA和几种中性粒细胞活化标志物的血浆水平升高。可以设想，PCI过程中使用阿昔单抗和肝素的辅助治疗具有抗中性粒细胞效应，值得进一步研究。
致谢：我们向Maria Hansson和Barbro Palmqvist致以诚挚的谢意，感谢他们出色的技术协助。
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