1. 引言
2型糖尿病(T2DM)是一种以高血糖、高脂血症和胰岛素抵抗为特征的代谢紊乱疾病。重要的是，T2DM越来越多地被认识到是认知功能障碍和阿尔茨海默病(AD)的风险因素，部分是通过诱导神经元细胞死亡机制，如受损的胰岛素信号传导、氧化应激和淀粉样蛋白-beta(Aβ)积累。Aβ积累被广泛认为是AD的病理标志和诊断标志(Arnold et al., 2018; Artasensi et al., 2020; Biessels et al., 2014)。
Aβ积累下调磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，这可能导致突触功能障碍、神经元损伤和细胞死亡，最终导致神经退行性疾病(Rad et al., 2018; Rajmohan & Reddy, 2017)。在T2DM模型中，升高的海马体Aβ水平与胰岛素信号传导受损和氧化应激相关联，这两者可能通过激活神经元细胞中与凋亡相关的进程而导致认知能力下降(Butterfield et al., 2014; Sharma et al., 2020)。此外，抗氧化防御系统，特别是核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)，在维持氧化还原平衡中起着关键作用。T2DM中受损的Nrf2活性与大脑中抗氧化能力降低和对氧化损伤的易感性增加相关(David et al., 2017; Gao et al., 2020)。过量活性氧(ROS)的积累可能进一步导致线粒体功能障碍并激活凋亡相关信号通路，通过在促凋亡蛋白(如Bax)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2)之间转移平衡，增加Bax/Bcl-2比率，最终导致神经元功能障碍和细胞损伤(Fricker et al., 2018; Soleymaninejad et al., 2017)。
多项研究表明，植物和草药来源的生物活性化合物可能减少与T2DM和神经退行性疾病相关的风险因素，主要是通过抗氧化和抗炎特性(Dabhekar et al., 2022; Soheili et al., 2021)。在泰国，南瓜(Cucurbita属，葫芦科)广泛种植，其种子含有富含不饱和必需脂肪酸的油，包括亚油酸和油酸(Srbinoska et al., 2012; Stevenson et al., 2007)。南瓜籽油(PSO)已被报道具有抗高血糖、抗高脂血症、抗氧化和抗炎活性(Abd-elnoor, 2019; Stevenson et al., 2007; Yadav et al., 2010)。这些生物特性表明PSO可能影响与T2DM相关神经元功能障碍相关的代谢和氧化通路。
尽管PSO已显示出有益的代谢效应，但其在T2DM诱导的认知功能障碍中潜在的神经保护作用，特别是通过协调调节氧化应激、Aβ/BACE-1信号传导和凋亡相关通路，在体内尚未得到系统评估。此外，PSO治疗的T2DM模型中认知结果与海马体氧化和凋亡改变之间的直接关系仍表征不足。
因此，本研究的目的是调查PSO给药是否能够减轻T2DM大鼠模型中的认知功能障碍，并阐明海马体中的潜在分子机制。为了解决这个问题，我们评估了代谢参数、使用新物体识别(NOR)和莫里斯水迷宫(MWM)测试的认知表现、海马体氧化应激标志物、Aβ42和BACE-1表达以及凋亡相关蛋白，其中吡格列酮作为药理学参考对照。
2. 材料和方法
2.1. 材料和试剂
链脲佐菌素(STZ)、吡格列酮(PG)、放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物、辣根过氧化物酶偶联抗兔(Cat. No. A9044)和辣根过氧化物酶偶联抗小鼠IgG二抗(Cat. No. A2074)购自Merck (Billerica, MA, USA)。Bcl-2 (Cat. No. ab59348)、Bax (Cat. No. ab32503)、procaspase-3 (Cat. No. ab184787)、BACE-1 (Cat. No. ab183612)和Nrf2 (Cat. No. ab92946)购自Abcam (Cambridge, UK)。β-actin的一抗(Cat. No. MAB1501)购自Merck (Billerica, MA, USA)。果糖粉末购自P.S. Foods and Chemicals (曼谷, 泰国)。
2.2. 南瓜籽油制备和成分测定
南瓜籽购自泰国楠府Santisuk区的一个社区农业企业。开始提取前，植物样本与泰国Srinakharinwirot大学药学院获得的存储植物材料进行鉴定和比较。所有方法均按照泰国1999年《植物品种保护法》(B.E. 2542)执行。PSO使用Soxhlet程序(AOAC 1995, 920.85)提取，方法如Srbinoska et al., 2012所述。脂肪酸组成使用气相色谱(GC)进行评估，而α-生育酚含量则使用高效液相色谱进行评估。分析由泰国Kasetsart大学食品研究与发展研究所进行。
2.3. 2型糖尿病大鼠模型的诱导和PSO给药
雄性Sprague–Dawley (SD)大鼠(N = 32; 年龄6周; 体重150–180 g)购自泰国曼谷的Nomura Siam International。大鼠饲养在塑料笼中(每笼3只)，环境条件受控(20 ± 2 °C, 60%湿度, 12:12小时明暗循环)。适应环境一周后，大鼠随机分为四组(n = 8每组)：正常对照组(CON)、2型糖尿病(T2DM)组、用吡格列酮治疗的T2DM大鼠组(10 mg/kg B.W./天; T2DM-PG)和用南瓜籽油治疗的T2DM大鼠组(200 mg/kg B.W./天; T2DM-PSO)。CON大鼠自由饮用正常饮用水，而所有T2DM亚组则饮用10%果糖水直到实验的第15周。在果糖喂养的第二周，按照Shannon and Islam (2012)描述的方案诱导2型糖尿病。简言之，向T2DM亚组单次静脉注射链脲佐菌素(STZ; 30 mg/kg溶于0.9%生理盐水)，而CON组接受0.9%生理盐水(Mekseepralard et al., 2015)。48小时后，使用血糖仪(Roche, 德国)测量空腹血糖(FBG)水平，FBG ≥ 250 mg/dL的大鼠被视为糖尿病。随后，南瓜籽油(PSO)和吡格列酮(PG)分别通过将PSO悬浮在1%(w/v)羧甲基纤维素(CMC)中和将PG溶解在饮用水中来制备，最终给药体积为每只大鼠0.5 mL。PSO(200 mg/kg B.W./天)和PG(10 mg/kg B.W./天)的每日口服灌胃从实验的第三周开始，并持续12周。所有治疗均每天上午9:00给药一次。
本研究中使用的南瓜籽油(200 mg/kg体重/天)剂量是基于先前报道的在代谢紊乱啮齿动物模型中有效的剂量范围选定的。先前研究表明，PSO以大约100-400 mg/kg体重的剂量给药可在糖尿病啮齿动物中产生抗高血糖、抗高脂血症和抗氧化效果，且无毒性证据(Abd-elnoor, 2019; Yadav et al., 2010)。因此，选择200 mg/kg体重/天作为此实验验证范围内具有代表性的中等剂量，以确保生物功效。
2.4. 新物体识别测试
新物体识别(NOR)测试用于在实验的第13周基于啮齿动物探索新或熟悉物体的先天倾向来评估非空间学习和记忆。NOR由一个黑色木质开放场箱(宽度: 100 cm × 长度: 100 cm × 高度: 50 cm)、两个熟悉物体(A1和A2)和一个不同或新物体(B)组成。这些物体颜色相同(长度: 3 cm × 宽度: 8 cm)。测试包括三个阶段：适应、熟悉和测试。在测试阶段，评估分为短期和长期记忆评估。在第1天(适应阶段)，每只大鼠被放入空箱中适应环境，允许自由探索10分钟。在第2天(熟悉阶段)，将两个熟悉物体(A1和A2)放置在距离箱壁20 cm的位置。每只大鼠被放入箱中并允许自由探索5分钟。同一天，间隔2小时后(短期记忆测试)，一个熟悉物体被替换为新物体(B)。每只大鼠随后被放入箱中探索5分钟。在第3天，熟悉后24小时(长期记忆测试)，每只大鼠被放入包含两个物体(A和B)的箱中探索5分钟。数字摄像机在所有测试阶段跟踪每只物体的探索持续时间。识别指数(%RI)使用以下公式计算：
%RI = [TN/(TN+TF)] × 100%
其中TN和TF分别表示探索新物体和熟悉物体的时间(Lueptow, 2017)。
2.5. 莫里斯水迷宫测试
莫里斯水迷宫(MWM)测试用于评估空间学习和记忆。技术上，MWM由一个圆形水池(直径: 214 cm × 高度: 50 cm)和一个平台(直径: 15 cm × 高度: 30 cm)组成。水池平均分为四个象限，充满水，并向不透明水中添加无毒白色染料。水温在实验过程中控制在25 ± 2 °C。隐藏平台位于一个象限的中心，距水面1.5英寸。MWM测试包括两个测试：学习(训练试验)和记忆(探测试验)测试(Vorhees & Williams, 2006)。对于学习测试，每只大鼠随机从四个象限之一释放入水作为起点。为逃离水域，大鼠游动寻找平台并登上平台。到达平台所需时间计算为逃避潜伏期。每只大鼠接受五次连续每日训练试验，每次试验间隔四次。如果大鼠在120秒内无法找到平台(最长时间)，则手动引导至平台并允许在平台上停留20秒。在间隔期间，大鼠每轮休息120分钟。在第6天，学习测试后，移除隐藏平台以进行记忆测试。为使每只大鼠有机会游泳一分钟，从与原平台象限相对的起始位置将其释放入水。在60秒内停留在第一象限的时间被记录为探测试验时间。整个研究过程中使用数字摄像机记录游泳行为。
2.6. 代谢参数检测
实验结束时，评估所有组的代谢参数，包括FBG、血胆固醇(CHOL)、血甘油三酯(TG)、血浆HbA1c、血清胰岛素和血清游离脂肪酸(FFA)。FBG、CHOL和TG分别使用血糖仪和胆固醇/甘油三酯Accu-trend® GCT计(Merck, 德国)测量。血浆HbA1c水平使用浊度免疫抑制试验测定(Professional Laboratory Management Corp, Co., Ltd., 泰国)。血清胰岛素和FFA水平使用胰岛素测定试剂盒(Merck, Billerica, MA, USA)和FFA测定试剂盒(Cayman Chemical, USA)按照制造商说明进行评估。用于评估胰岛素敏感性的胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)指数使用以下公式计算：
HOMA-IR = [FBG (mmol/L) × 胰岛素 (mU/L)] / 22.5 (Guo et al., 2007)。
2.7. 口服葡萄糖耐量测试
在实验的第14周进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。大鼠过夜禁食12小时。将50%(w/v)葡萄糖溶液溶于蒸馏水中，并以2 g/kg体重(B.W.)的剂量通过口服灌胃给药。在口服葡萄糖给药前(0分钟)和给药后30、60、90和120分钟，从大鼠尾部采集静脉血样，测量血糖和血清胰岛素水平。
2.8. 海马体匀浆制备
在实验的第15周，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠将大鼠安乐死(Pang & Laferriere, 2020)。迅速取出大脑，将海马体组织从整个大脑中分离出来。海马体组织在含有1%蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中匀浆。海马体匀浆在4 °C下以12,000 rpm离心15分钟。收集上清液并储存在-80 °C直至使用。
2.9. 海马体氧化和抗氧化测定
在本研究中，海马体丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性代表氧化应激。使用硫代巴比妥酸反应物质(TBARs)测定试剂盒(Cayman Chemical, USA)检测MDA水平。使用SOD活性测定试剂盒(Cayman Chemical, USA)检测海马体SOD活性。
2.10. 海马体Aβ42水平测定
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)按照制造商说明(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)测量海马体Aβ42水平。
2.11. 蛋白质印迹分析
使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad, USA)测量海马体匀浆中的总蛋白浓度。随后，30 μg蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck, Billerica, MA, USA)。膜在室温(25 °C)下用5%脱脂牛奶在Tween-20 Tris缓冲盐水(TBST)中封闭1小时。封闭后，膜用针对Nrf2(1:1000)、BACE-1(1:1000)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、procaspase-3(1:1000)和β-actin(1:40,000)的一抗在4 °C下孵育16小时，然后在室温(25 °C)下与辣根过氧化物酶偶联的抗兔或抗小鼠IgG二抗(1:5000)孵育1小时。使用增强化学发光系统(Thermo Fisher Scientific, USA)可视化蛋白条带，并通过X射线胶片曝光检测。使用Scion Image软件(Scion Corporation, USA)分析蛋白条带的密度。
2.12. 统计分析
所有数据使用GraphPad Prism软件(版本7.0)进行分析，并表示为平均值±标准误差(SEM)。代谢参数、生物标志物、NOR数据和在目标象限中花费的时间的平均变化使用单因素方差分析(ANOVA)后跟Tukey事后检验进行分析。逃避潜伏期时间使用双因素方差分析(ANOVA)后跟Bonferroni事后检验进行分析。OGTT的曲线下面积(AUC)使用单因素方差分析后跟Tukey事后多重比较检验进行分析，以评估所有实验组之间的成对差异。使用所有实验组汇集的单个动物数据进行相关性分析。使用双尾Pearson相关性评估氧化应激标志物(MDA、SOD活性和细胞质Nrf2表达)之间以及行为结果(识别指数和逃避潜伏期时间)与海马体分子标志物(MDA、SOD、Nrf2、Aβ42、BACE-1和Bax/Bcl-2比率)之间的关联。相关性强度以系数(r)表示，并附带相应的p值和95%置信区间。统计显著性定义为p ≤ 0.05。
3. 结果
3.1. PSO中脂肪酸组成
使用气相色谱法测定了南瓜籽油(PSO)的脂肪酸组成，如方法部分所述。结果显示，PSO含有饱和和不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸是油的主要成分。在鉴定的成分中，亚油酸(C18:2n6c)是主要脂肪酸(39.11 g/100 g)，其次是油酸(C18:1n9c)(28.10 g/100 g)。饱和脂肪酸比例较低，主要是棕榈酸(C16:0)(19.30 g/100 g)和硬脂酸(C18:0)(8.02 g/100 g)，而花生酸(C20:0)以微量检测到(0.37 g/100 g)。此外，还鉴定出少量α-亚麻酸(C18:3n3)(0.27 g/100 g)。
使用高效液相色谱法评估了PSO的α-生育酚含量，如2.2节所述。然而，在分析的PSO提取物中未检测到α-生育酚。用于油制备的Soxhlet提取程序在相对高温(80–100 °C)下进行，可能导致热敏生育酚降解，这可以解释最终提取物中未检测到维生素E的原因。
总体而言，这些结果表明，本研究中使用的PSO以不饱和脂肪酸为主，特别是亚油酸和油酸，这些脂肪酸先前已被报道具有抗氧化和代谢调节特性。这种脂肪酸组成与先前报道的南瓜籽油组成一致。
3.2. PSO对代谢参数和胰岛素抵抗的影响
评估了CON、T2DM、T2DM-PG和T2DM-PSO组的代谢参数、血清胰岛素水平、血清FFA水平和胰岛素抵抗。在血糖参数方面，与未经给药的T2DM大鼠相比，200 mg/kg PSO和10 mg/kg PG给药均能降低空腹血糖(FBG)和血浆HbA1c水平(p < 0.001)，PSO和PG给药之间无显著差异。同样，T2DM-PG和T2DM-PSO组的血TG和CHOL水平显著降低(p < 0.001)，PSO的效果与PG相当(TG: 162.60 ± 1.08对162.20 ± 1.28 mg/dL; CHOL: 246.80 ± 2.42对244.00 ± 2.45 mg/dL)。抗高血糖和降脂参数的比较分析显示T2DM-PSO组和T2DM-PG组之间无显著差异。
为评估T2DM患者的胰岛素抵抗，测量了血清胰岛素、血清FFA和HOMA-IR指数。使用血清胰岛素和FBG水平计算HOMA-IR指数，如方法部分所述。这些观察显示，T2DM-PSO组的血清胰岛素和FFA均低于T2DM组(26.10 ± 0.73对51.68 ± 1.58 mU/L和10.98 ± 0.31对17.98 ± 0.53 μM，分别，p < 0.001)。此外，T2DM-PSO组和T2DM-PG组之间的HOMA-IR指数无显著差异(13.19 ± 0.39对12.17 ± 0.26)，表明PSO和PG给药组的胰岛素抵抗均有改善。
3.3. PSO对T2DM大鼠口服葡萄糖耐量状态的影响
为评估T2DM大鼠的葡萄糖耐量，在实验第14周通过单剂量灌胃给予50%葡萄糖溶液(2 g/kg B.W.)给CON和各T2DM组(实验时间线见图1)。在口服葡萄糖给药后0(基线)、30、60、90和120分钟采集血样。T2DM-PSO组在每个时间点的血糖水平和曲线下面积(AUC)均显著低于T2DM组(p < 0.001)。此外，T2DM-PSO组和T2DM-PG组之间的血糖水平或AUC无差异。
3.4. PSO对非空间学习和记忆表现的影响
为调查PSO是否改善T2DM大鼠的非空间学习和记忆障碍，在实验第13周后进行NOR测试。熟悉训练后，用一个新物体替换一个熟悉物体。在2小时和24小时后测量CON和各T2DM组大鼠的新物体探索时间和识别指数(%RI)，以评估短期和长期记忆。结果显示，CON、T2DM-PG和T2DM-PSO大鼠在短期和长期条件下均花费更多时间探索新物体(物体B)。相比之下，T2DM大鼠探索新物体的时间最少。此外，T2DM大鼠在短期和长期记忆评估中的%RI均显著低于接受PSO或PG的大鼠(p < 0.001)。此外，PSO组和PG组之间%RI无显著差异，表明PSO产生的记忆表现改善与PG治疗组相当。
3.5. PSO对空间学习和记忆表现的影响
对所有组进行MWM测试以确认NOR实验的结果。图4A显示了每组代表性大鼠的到达策略和所花时间。逃避潜伏期显示，T2DM组大鼠到达隐藏平台所需时间显著长于CON组大鼠(p < 0.001)。相比之下，T2DM-PSO和T2DM-PG组大鼠到达隐藏平台的时间显著短于T2DM组(p < 0.001)。此外，PSO组到达平台的总体时间更短，特别是在第2-5天，比T2DM组长(p < 0.001)，且时间与PG组相当。为进一步评估空间记忆，记录了在目标象限中花费的时间。如图4C所示，T2DM组大鼠在目标象限中花费的时间显著少于其他组大鼠(p < 0.001)。T2DM-PSO和T2DM-PG组在目标象限中花费的时间显著更长。此外，PSO组和PG组之间无显著差异，表明T2DM大鼠接受PSO或PG后空间记忆得到改善。因此，这些发现表明，通过果糖饮用水结合低剂量STZ注射诱导的T2DM大鼠模型表现出学习和记忆能力受损。值得注意的是，PSO给药与这些T2DM大鼠的长期学习和记忆表现改善相关。
3.6. PSO给药对T2DM大鼠海马体Aβ42和BACE-1表达的影响
脑中Aβ42的积累会破坏突触活性并降低突触可塑性，最终导致学习和记忆障碍。为评估PSO对Aβ产生的影响，在PSO给药12周后(实验第15周)使用ELISA定量Aβ42水平，并通过蛋白质印迹评估海马体BACE-1表达。如图5A所示，T2DM-PSO和T2DM-PG组的海马体Aβ42水平均显著降低，与T2DM组相比(p < 0.001)，表明两种给药均有效减轻了糖尿病大鼠中的Aβ42积累。相比之下，T2DM-PSO组的Aβ42水平仍略高于T2DM-PG组(p < 0.05)。关于海马体BACE-1表达(图5B)，PSO给药相对于T2DM组显著降低了BACE-1表达(p < 0.001)，T2DM-PG组也观察到类似的显著降低(p < 0.001)。PSO组和PG组之间BACE-1表达无显著差异。
3.7. PSO给药对氧化和抗氧化生物标志物的影响
评估了CON和T2DM组的海马体氧化状态，以评估PSO对氧化和抗氧化生物标志物的影响。代表氧化应激的MDA水平在T2DM组中显著高于其他组(p < 0.001)，而代表抗氧化状态的SOD活性和海马体Nrf2表达在T2DM组中显著较低(p < 0.001)。T2DM-PSO组显示氧化平衡改善，MDA水平较低，SOD活性和Nrf2表达较高，与T2DM组相比。相关性分析证实了这些生物标志物之间的关系：细胞质Nrf2表达与SOD活性呈强正相关(r = 0.86, p < 0.0001)，而MDA水平与SOD活性(r = -0.87, p < 0.0001)和Nrf2表达(r = -0.73, p < 0.0001)呈负相关，表明升高的氧化应激与降低的抗氧化防御机制相关。
3.8. PSO给药改变凋亡生物标志物
凋亡性细胞死亡是导致糖尿病中学习和记忆缺陷的关键病理机制。为研究PSO的抗凋亡作用，通过蛋白质印迹分析评估了所有组的促凋亡蛋白Bax和procaspase-3以及抗凋亡蛋白Bcl-2的海马体表达。在T2DM-PSO组中，Bax和procaspase-3表达水平显著低于T2DM组(p < 0.001)。PSO在降低Bax蛋白表达方面效果较差，但对procaspase-3水平的降低与PG相当。此外，PSO增强了抗凋亡特性，表现为Bcl-2表达增加。相比之下，T2DM组大鼠与CON组相比表现出显著更高的Bax和procaspase-3表达和显著更低的Bcl-2表达。还评估了Bax与Bcl-2的比率，以评估所有实验组中凋亡极化的程度。这些结果表明，PSO可能调节海马体中的凋亡相关蛋白，这可能有助于改善与2型糖尿病相关的学习和记忆缺陷。
3.9. 行为表现与海马体分子标志物之间的相关性
相关性分析显示MDA水平与逃避潜伏期时间呈强正相关(r = 0.9387, p < 0.0001)，表明增加的脂质过氧化与较差的空间学习相关。相比之下，Nrf2表达与逃避潜伏期呈负相关(r = -0.7317, p < 0.0001)，表明增强的抗氧化信号与改善的表现相关。24小时的识别指数与海马体Aβ42水平(r = -0.8484, p < 0.0001)和Bax/Bcl-2比率(r = -0.8017, p < 0.0001)呈负相关，表明增加的Aβ积累和促凋亡信号与识别记忆受损相关。
4. 讨论
本研究调查了南瓜籽油(PSO)是否可以减轻以胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症为特征的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型中的认知功能障碍。通过在同一动物中评估系统性代谢参数以及海马体氧化应激标志物、淀粉样蛋白相关改变、凋亡相关信号传导和认知表现，本工作旨在阐明外周代谢紊乱如何转化为神经元功能障碍和认知能力下降。越来越多的证据表明，T2DM相关的认知功能障碍是多因素的，涉及受损的胰岛素信号传导、氧化应激和淀粉样蛋白生成过程，这些过程最终可能导致神经元功能障碍和突触功能障碍。
在本模型中，长期果糖暴露结合低剂量链脲佐菌素产生了持续性高血糖，伴有循环胰岛素水平升高和HOMA-IR指数增加。这些代谢特征与系统性胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症一致，这在果糖/低剂量STZ的T2DM实验模型中经常观察到。与主要诱导β细胞破坏的高剂量STZ方案不同，本模型保留了部分胰腺胰岛素分泌，同时促进外周胰岛素抵抗，从而更接近早期T2DM的代谢表型。
系统性胰岛素抵抗和慢性高血糖已知通过几种相互关联的机制导致神经元功能障碍。脑中受损的胰岛素信号传导会破坏海马体突触可塑性和线粒体功能，而持续的代谢应激促进神经元组织中活性氧(ROS)的过度产生和氧化损伤。增加的氧化应激可能进一步通过刺激BACE-1活性和Aβ积累来增强淀粉样蛋白生成，这一过程在糖尿病相关的认知功能障碍中越来越被认可。同时，氧化和代谢应激可以通过在促凋亡和抗凋亡蛋白之间转移平衡(包括Bax/Bcl-2信号轴)来激活涉及线粒体功能障碍的凋亡相关信号通路，最终导致神经元丢失和突触功能障碍。
与糖尿病和神经退行性疾病模型中的先前发现一致，本研究中的未治疗T2DM大鼠表现出明显的海马体氧化应激证据。这表现为脂质过氧化增加(以MDA升高为指标)，以及降低的抗氧化防御，包括SOD活性和Nrf2表达降低。Nrf2作为控制抗氧化反应元件表达和维持细胞氧化还原平衡的主要转录调节因子。Nrf2信号的损伤与糖尿病和神经退行性疾病中氧化损伤增加和神经元凋亡易感性升高相关。在本研究中，PSO给药改善了代谢指标，并伴有海马体氧化标志物的减轻。虽然不能明确建立直接因果关系，但代谢和氧化参数的平行改善表明，改善的系统性代谢状态可能有助于改善海马体氧化还原状态。
氧化应激也被广泛认为参与淀粉样蛋白生成的调节，并且越来越被认为是代谢功能障碍和神经退行性信号通路之间的关键联系。活性氧可上调BACE-1表达并增强淀粉样前体蛋白向Aβ生成的切割。Aβ的积累可能反过来加剧氧化应激，形成一个放大神经元损伤的正反馈循环。与糖尿病模型中的先前研究一致，本研究中的未治疗T2DM大鼠表现出增加的海马体BACE-1表达和升高的Aβ42水平。PSO给药相对于未治疗的糖尿病动物显著降低了这两个标志物。当考虑到氧化应激参数的同时改善时，这些发现表明PSO可能减轻与氧化应激相关的淀粉样蛋白生成信号，表现为Aβ42和BACE-1水平降低，而不是直接抑制淀粉样蛋白形成。相比之下，吡格列酮对海马体Aβ42水平的抑制作用略强，这可能反映了其公认的胰岛素增敏作用及其调节已知影响淀粉样蛋白处理的葡萄糖代谢和胰岛素信号通路的能力。然而，PSO治疗组在代谢参数和认知表现方面的改善幅度与吡格列酮相当。此外，PSO在海马体中持续改善氧化应激标志物和凋亡相关信号，表明其效果不仅限于单一分子通路。因此，尽管吡格列酮在特定淀粉样蛋白相关参数上表现出稍强的效果，但PSO在代谢、氧化和凋亡相关过程方面表现出协调调节，表明更广泛的多靶点生物影响。然而，PSO和吡格列酮之间的直接比较应谨慎解释，因为这些干预措施在药理机制上不同，且本研究未设计用于直接功效比较。
PSO的生物活性可能部分与其脂肪酸组成有关。本研究中进行的气相色谱分析表明，不饱和脂肪酸构成了PSO的主要部分，亚油酸(C18:2)和油酸(C18:1)被确定为主要成分。这些发现与先前报道的南瓜籽油组成谱一致。因此，本研究中的PSO含有高比例的不饱和脂肪酸，特别是亚油酸和油酸。据报道，这些脂肪酸具有抗氧化、抗炎和代谢调节作用，可能有助于神经保护。亚油酸衍生的脂质介质已被证明影响脑中的神经元信号和氧化平衡，而油酸已被报道保护神经元和内皮细胞免受氧化损伤。因此，观察到的氧化应激标志物和凋亡相关信号的改善可能反映了PSO中存在多种脂质生物活性成分的综合作用，而不是单一分离化合物的作用。
持续的氧化应激和增加的Aβ积累已知会激活凋亡相关信号通路，特别是涉及线粒体功能障碍的通路。在本研究中，未治疗的T2DM大鼠表现出增加的Bax/Bcl-2比率，表明向促凋亡信号谱的转变。PSO给药通过降低Bax表达同时增加Bcl-2水平来调节这种不平衡，降低了Bax/Bcl-2比率。由于未评估裂解的caspase-3，本研究结果主要反映凋亡相关信号的调节，而不是神经元凋亡的直接量化。然而，氧化应激、淀粉样蛋白相关标志物的减轻以及Bax/Bcl-2平衡的恢复表明海马体中凋亡相关信号通路的调节。
在功能层面，这些分子改变伴随着可测量的认知功能障碍。未治疗的糖尿病动物在新物体识别测试中显示出降低的识别指数，在莫里斯水迷宫中表现出延长的逃避潜伏期，表明海马体依赖的识别记忆和空间学习受损。这种行为障碍与先前将胰岛素抵抗和氧化应激与海马体功能障碍和认知能力下降联系起来的研究一致。重要的是，PSO给药显著改善了两种行为测试中的认知表现，这些功能改善伴随着代谢、氧化、淀粉样蛋白相关和凋亡相关标志物的减轻。由于行为测试是按顺序进行的，因此仔细考虑了实验时间表，以尽量减少潜在的疲劳效应。认知测试在第13周开始，首先进行为期三天的新物体识别(NOR)测试。NOR任务完成后，动物被允许24小时恢复期，然后进行莫里斯水迷宫(MWM)测试。这种测试顺序与实验认知研究中常用的测试方案一致。在MWM测试期间，密切观察动物，未检测到任何实验组中异常行为或过度疲劳的明显迹象。此外，PSO和吡格列酮治疗组在NOR和MWM测试中观察到的行为改善模式相似，表明测试顺序或疲劳不太可能完全解释观察到的认知结果。
为进一步探索分子改变与行为结果之间的关系，使用单个动物数据进行了相关性分析。识别指数与MDA水平、BACE-1表达、Aβ42浓度和Bax/Bcl-2比率呈负相关，同时与包括SOD活性和Nrf2表达在内的抗氧化参数呈正相关。逃避潜伏期显示相反的模式。虽然相关性分析不能建立直接因果关系，但这些关系的一致方向支持一个生物学上连贯的框架，将代谢失调与氧化应激、淀粉样蛋白生成信号(Aβ42和BACE-1)以及凋亡相关信号和最终认知功能障碍联系起来。
综上所述，本研究结果支持一个概念框架，将系统性代谢紊乱与海马体功能障碍和认知能力下降联系起来。在PSO治疗的动物中，代谢参数的改善伴随着氧化应激的减轻、淀粉样蛋白生成信号的调节、凋亡相关信号标志物的调节以及认知表现的改善。虽然这些观察结果并未建立每个阶段之间的直接因果关系，但在代谢、分子和行为水平上观察到的平行变化表明相互关联的生物过程，而不是孤立的效果。未来的研究将需要采用靶向机制干预来阐明所涉及的精确信号通路。
5. 研究局限性
本研究的一些局限性值得注意。未评估裂解的caspase-3和神经元凋亡的组织学确认；因此，关于凋亡的结论主要基于信号标志物，而不是直接的结构证据。此外，尽管行为测试是按顺序进行的并有适当的恢复期，但未来使用平衡测试设计的研究可能会进一步减少潜在的任务交互效应。
6. 结论
总之，南瓜籽油减轻了以胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症为特征的T2DM大鼠模型中的认知功能障碍。保护作用与改善系统性代谢状态、减少氧化应激、调节Aβ/BACE-1信号以及调节海马体中的凋亡相关信号相关联。这些发现共同表明，南瓜籽油作为功能性食品衍生的生物活性干预措施，在糖尿病相关认知功能障碍中具有靶向相互连接的代谢和神经退行性机制的潜力。
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