外泌体工程的新策略：从细胞预处理到杂交技术在靶向治疗中的应用
亮点
- •配体包被的外泌体显示出改善的组织特异性递送效果。
- •预处理的供体细胞产生的外泌体具有增强的功能。
- •杂交外泌体提高了稳定性和治疗递送效果。
- •工程化外泌体推动了精准纳米医学的应用。
- •缺乏统一的分离方法限制了临床转化。
摘要
外泌体是由所有细胞类型产生的纳米级细胞外囊泡。它们在细胞间通讯和治疗递送中扮演着重要角色。由于具有天然的生物相容性、低免疫原性以及能够跨生物屏障运输生物活性分子的能力，外泌体被认为是极具吸引力的候选载体。然而，天然外泌体的临床应用面临一些挑战。这些挑战推动了外泌体工程学的发展。表面修饰、载荷装载技术以及与合成材料的杂交是这些修饰的示例。本综述文章探讨了增强外泌体治疗潜力的创新策略。文章重点讨论了在培养阶段使用缺氧预处理、化学刺激和生物物理刺激等技术对干细胞进行修饰，这些技术已被证明可以优化外泌体的数量和生物活性。此外，生产后的修饰，包括表面功能化、与合成材料的杂交以及载荷增强，正在被研究以提高外泌体的稳定性、靶向特异性和治疗效果。这些见解共同为实现外泌体作为纳米医学中下一代递送工具的全部潜力提供了路线图。
引言
细胞外囊泡(EVs)是由几乎所有细胞类型分泌的纳米级膜结合颗粒，它们被脂质双层膜包裹，含有蛋白质、脂质和RNA或DNA等核酸。它们携带多种生物分子，参与生理和病理过程的调控。EVs通常根据其来源进行分类。细胞外囊泡一般分为三种主要类型：凋亡小体，即死亡细胞的碎片，大小为500–5000纳米；微囊泡，直接由质膜形成，大小范围为100至1000纳米；外泌体是最小的亚型，起源于细胞内细胞器，直径通常为30–150纳米。一些追踪外泌体生物标志物的科学家对这种EVs分类提出了质疑。在各种类型的EVs中，外泌体是研究最为广泛的，但其固有的异质性使得难以使用单一的标志物集来定义它们。因此，准确识别外泌体需要全面且特定的生物分子标志物，能够将它们与其他EV亚型区分开来。
大多数研究人员通常采用一系列分析技术和蛋白质标志物来确认外泌体的存在。最常用的方法是Western blotting，用于检测特定蛋白质。CD9、CD63和CD81是属于四跨膜蛋白家族的经典外泌体标志物。其他关键蛋白质包括Alix，这是一种参与外泌体生物发生的内体相关蛋白，以及TSG101，它是ESCRT（运输所需内体分选复合物）通路的一个组成部分，对外泌体形成至关重要。在外泌体中发现的其他结构和膜相关蛋白质包括HSP70和Syntenin-1，以及整合素和磷脂酰丝氨酸(PS)。这些分子不仅有助于识别外泌体，还在细胞靶向和囊泡-细胞相互作用中发挥功能作用。值得注意的是，PS通常位于外泌体的外膜上，可作为额外的标志物。除了Western blotting外，还有各种实验方法用于外泌体表征：
- •流式细胞术分析CD9和CD63等表面标志物
- •透射电子显微镜(TEM)用于观察外泌体形态和确认大小
- •纳米粒子追踪分析(NTA)用于量化样品中粒子大小分布和浓度
可以得出结论，单一方法不足以确认外泌体的存在。因此，应结合多种方法，如CD9、CD63、TSG101的Western blotting或流式细胞术、TEM和NTA，以提高诊断可靠性。还应注意，某些标志物可能在不同类型的EVs之间共享，以实现准确识别。用于外泌体识别的分子标志物可能与其他EVs表征所用的标志物重叠或不同。表1展示了外泌体和微囊泡标志物及其各自内容的比较分析。
尽管对外泌体生物学的认识不断增长，但几项重大挑战限制了天然外泌体的直接临床应用。这些限制包括非特异性靶向、在循环中稳定性有限以及对药物装载的控制不足。临床转化的主要障碍是缺乏外泌体分析和生产的标准化协议。寻找可靠且可重复的分离方法和质量控制方法对于满足监管和治疗需求至关重要。然而，迄今为止，关于最佳分离技术或用于临床应用的基于EV的产品的释放和表征标准尚未达成共识。表2展示了各种外泌体分离方法的比较概述。
为了克服这些限制，外泌体工程学通过表面修饰（如配体或抗体结合）和内部内容的操控，被定义为一种有前景的策略。这些修饰旨在增强外泌体在将治疗剂递送到特定病变组织时的精确性和效率。对外泌体在疾病进展中作用及其在治疗应用中潜力的日益深入理解，推动了细胞外囊泡(EVs)领域的发展。全球外泌体治疗市场预计将显著增长，从2021年的3310万美元增长到2026年的1.692亿美元。尽管在外泌体的生物学和应用方面取得了显著进展，但这些囊泡在商业和临床使用方面的全部潜力尚未完全实现。
本综述聚焦于外泌体工程学在靶向递送至病变或受损细胞和组织方面的最新发展。主要重点是分析外泌体表面修饰的各种策略，并评估这些方法如何增强治疗效果。此外，还详细讨论了这一快速发展的领域的当前挑战和未来展望。
外泌体具有从其母细胞吸收活性生物分子并将其传递给其他细胞的天然能力。这种独特功能鼓励科学家探索并开发各种策略来增强其治疗潜力。随着全球细胞治疗市场对外泌体产品需求的增加，公司正在积极寻求策略来修饰和增强外泌体产品。其中，母细胞的基因修饰、在外泌体释放前装载以及分离后的修饰是最常见的方法。然而，每种方法都有其自身的优点和局限性。例如，基因修饰供体细胞可以导致具有特定治疗功能的外泌体的持续产生。但这种方法并非没有担忧。这些外泌体也可能携带触发炎症甚至细胞死亡的不需要的分子，引发了严重的生物安全问题。相比之下，电穿孔或超声处理等分离后技术允许研究人员以更大的控制和精度将治疗剂装载到外泌体中。尽管如此，这些物理方法可能会损坏外泌体膜并损害其稳定性。最终，选择正确的方法取决于治疗载荷的性质及其在临床环境中的预期用途。这突显了设计不仅有效而且与特定治疗目标一致的工程策略的重要性。
对领先的工程化外泌体公司的回顾（见表3）显示，它们用于递送各种治疗有效载荷，包括蛋白质、反义寡核苷酸(ASOs)、微小RNA(miRNAs)、小干扰RNA(siRNAs)和信使RNA(mRNAs)。广义上，有三种主要策略用于工程化外泌体，包括：
- 供体（生产者）细胞的基因和代谢修饰，以诱导产生富含特定生物分子（如miRNAs或治疗性蛋白质）的外泌体。
- 将治疗有效载荷预装载到供体细胞中，随后刺激释放包裹有效载荷的外泌体。这种方法更为短暂，通常用于研究或短期生产。
- 将有效载荷外源性装载到纯化的外泌体中。采用电穿孔等技术将核酸或药物掺入分离的外泌体中。
这些策略各自提供了独特的优势。随着外泌体技术的不断发展，定制的工程方法正在为精准纳米医学铺平道路（图1）。
基因、代谢与环境预处理
干细胞的基因和代谢修饰可以显著影响外泌体的分泌速率和功能内容。这些改变不仅增强了它们的治疗潜力，还有助于更深入地理解它们在疾病生物学和细胞间通讯中的作用。通过调整这些过程，研究人员可以控制进入外泌体的内容，无论是微小RNA、蛋白质还是脂肪，使它们更适合医学测试或应用。
临床与实验室条件下的天然与修饰外泌体
无论是天然存在的还是在实验室中创建的外泌体，在医学治疗和科学研究中都显示出巨大的潜力。它们可以调节免疫系统，甚至以显著精确的方式递送药物。天然外泌体有广泛的应用。表4总结了天然外泌体在临床和实验室条件下的某些应用。
虽然天然外泌体本质上具有生物相容性，并且能够在不诱导...
超越先前综述的新颖性与进展
在过去十年中，治疗性外泌体经历了实质性变化。生物工程、靶向载荷装载和表面修饰技术的进步使得天然生物囊泡与工程化药物递送系统之间的界限越来越模糊。现在可以以显著精确度对外泌体进行精确优化。近年来的一个重大发展是外泌体表面生物偶联创新技术的出现。将外泌体...
讨论
外泌体已作为一种强大的生物纳米载体出现，在诊断、治疗和靶向药物递送方面具有潜力。它们固有的生物相容性、穿越生物屏障的能力以及携带生物分子的能力，使其成为下一代治疗平台的高度有希望的候选者。近年来，在工程化外泌体以提高其靶向精确性、治疗效果和体内稳定性方面取得了相当大的进展。
未来挑战
关于外泌体的临床使用，需要解决几个挑战。首先，需要建立外泌体分离、质量控制和识别的标准方法，以确保一致性和准确性。在这方面，正在探索微流体平台、基于大小的色谱优化和切向流过滤(TFF)等新兴技术，以提高纯度和大规模制造能力。其次，可扩展性和良好生产规范...
作者贡献声明
Rafie Belali：审阅与编辑、撰写初稿、调查研究。Maryam Jafar Sameri：审阅与编辑、撰写初稿、监督、项目管理、方法学、调查研究、资金获取、概念化。
利益冲突声明
无利益冲突需要声明。
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作期间，作者使用ChatGPT来提高稿件的可读性和语言，也用于翻译目的。使用此服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容；他们对已发表文章的内容负全部责任。
资金支持
本工作得到阿巴丹医科大学研究事务的支持。资助编号：2208。伦理委员会批准编号：IR.ABADANUMS.REC.1403.170。
竞争利益声明
作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能会影响本文报告的工作。
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