多组学揭示维生素D对炎症性肠病中免疫-肠道微生物组相互作用和耐受性途径的调控
摘要
对肠道微生物组免疫耐受的丧失在炎症性肠病（IBD）的发病机制中起着重要作用。饮食因素如何改变IBD中宿主免疫与肠道微生物组的相互作用尚不清楚。在此，我们应用多组学方法（免疫球蛋白A或G与16S rRNA测序[IgA-seq, IgG-seq]、血液单细胞RNA测序[scRNA-seq]和免疫组库测序），研究为期12周的维生素D对IBD患者宿主免疫微生物相互作用的影响。维生素D治疗与疾病活动度和炎症标志物降低、IgA结合肠道微生物群增加以及IgG结合肠道微生物群减少相关。维生素D改变了IgA结合（增加毛螺菌科、布劳特氏菌属）和IgG结合（减少变形菌门、肠球菌科）的肠道细菌谱。维生素D增加了浆细胞样树突状细胞与B细胞之间的B细胞活化因子（BAFF）信号传导，改变了与Ig结合肠道微生物群相关的BCR和TCR克隆型，并增加了α4β7+ B和T调节细胞。我们的结果表明，维生素D能促进IBD患者对肠道微生物群的免疫耐受。临床试验注册号：NCT04828031。
引言
炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，是一种胃肠道慢性炎症性疾病，被认为源于宿主遗传易感性和环境触发因素之间的复杂相互作用。对共生肠道细菌免疫耐受的丧失已被认识到在IBD的发病机制中起着关键作用。目前IBD的治疗策略主要侧重于针对失调的免疫反应，而没有直接解决肠道微生物组与肠道免疫的相互作用。理解调节宿主免疫-微生物相互作用的机制，并开发恢复对肠道微生物群免疫耐受的方法，可能会带来治疗或预防IBD的治疗策略。
免疫球蛋白A（IgA）作为一种二聚体抗体，分泌于包括胃肠道在内的粘膜表面。IgA与广泛的共生肠道细菌结合，在防御肠道感染方面发挥关键作用，并调节肠道微生物群的组成和共生关系，以维持肠道免疫稳态。IgA类别转换通过T细胞非依赖性（通过树突状细胞分泌B细胞活化因子[BAFF]和增殖诱导配体[APRIL]）和T细胞依赖性（通过CD4 T细胞表达转化生长因子β[TGF-β]和CD40配体[CD40L]）机制发生。IgA和IgG与肠道细菌的结合在IBD患者中增加，并与疾病活动度和炎症相关。先前的研究表明，IgA结合的肠道细菌谱在新发IBD中具有特异性，与IBD患者的手术时间相关，并靶向致结肠炎细菌。IgG结合的肠道细菌在溃疡性结肠炎中增加，并通过与肠道驻留巨噬细胞上的Fcγ受体（FcγRs）结合并随后激活下游白细胞介素（IL）-1β依赖性17型信号传导来传播炎症。此外，IgG结合的肠道细菌可能代表IBD患者中易位的肠道细菌或系统性免疫的靶标。目前缺乏在IBD中操纵IgA和IgG与肠道微生物群结合以恢复免疫耐受的临床策略，这部分是由于对其调节机制的理解不完整。
较高的维生素D水平和维生素D补充剂与健康成年人和IBD患者中肠道微生物组组成向增加多样性和富集有益肠道细菌的转变相关。此外，维生素D对B细胞和T细胞均有强大的免疫调节作用。维生素D可以减少B细胞增殖、浆细胞分化以及IgM和IgG分泌，这可能是通过其对树突状细胞和辅助性T细胞的间接作用介导的。维生素D可以减弱炎症性T细胞反应（TH1和TH17）并诱导FOXP3+ T调节细胞的分化。维生素D还与免疫细胞上肠道归巢整合素α4β7（在胃肠道运输中起作用）的表达相关，包括B细胞。
鉴于维生素D在肠道微生物组、B细胞免疫和抗体产生以及肠道归巢整合素α4β7界面上的作用，我们假设维生素D调节IBD患者中免疫球蛋白与共生肠道细菌的结合以及α4β7+ B细胞免疫表型。为了验证这一假设，我们在维生素D水平低的IBD患者中进行了一项维生素D治疗的干预性研究（NCT04828031）。在此，我们利用细菌荧光激活细胞分选、16S测序（IgA-seq, IgG-seq）研究了维生素D对IgA和IgG与肠道细菌结合的影响，并利用单细胞转录组学（scRNA-seq）以及B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）组库测序研究了对外周血免疫反应的影响。我们的研究揭示，维生素D与疾病活动度和炎症标志物降低、IgA结合增加以及IgG与肠道微生物群结合减少相关。维生素D对Ig结合的肠道细菌类群有不同的影响，包括增加IgA结合的毛螺菌科和布劳特氏菌属，以及减少IgG结合的变形菌门和肠球菌科。维生素D还导致浆细胞样树突状细胞（pDCs）与B细胞之间BAFF信号传导增加，不同地改变了与特定Ig结合肠道微生物群相关的BCR和TCR克隆型，并增加了α4β7+ CX3CR1 B调节细胞和T调节细胞。综上所述，我们的结果为IBD患者中宿主免疫-微生物相互作用以及维生素D对肠道微生物群免疫耐受的调节提供了见解。
结果
维生素D与IBD临床试验中疾病活动度和粪便炎症标志物的改善相关
48名IBD患者完成了临床试验，并提供了完整的一套维生素D治疗前后的血液和粪便样本，被纳入最终分析。表1总结了临床试验中患者的基线临床特征。患者的平均年龄为38.96岁，其中45.8%为男性，54.2%为女性。约56.3%的患者患有溃疡性结肠炎（UC），而43.7%患有克罗恩病（CD）。平均血清维生素D [25(OH)D] 水平为18 ng/mL，平均粪便钙卫蛋白为1,046.3 μg/g。在治疗前的IBD疗法方面，41.7%的患者使用抗TNF，10.4%使用抗α4β7，8.3%使用抗IL12/23生物制剂疗法。6名患者在开始维生素D试验前的4周内有过药物变更。在12周的维生素D治疗期间，没有患者有任何药物变更。每周口服50,000单位维生素D，持续12周，导致血清25(OH)D水平增加20点（p < 0.0001），粪便钙卫蛋白减少722 μg/g（p < 0.001），疾病活动度评分下降（溃疡性结肠炎部分Mayo评分，-3.2，p < 0.0001；克罗恩病Harvey Bradshaw指数，-3.3，p < 0.0001），以及生活质量评分增加10.8分（通过SIBDQ测量，p < 0.0001）。维生素D对血液C反应蛋白（CRP）水平没有显著影响（图1B）。
维生素D差异调节IgA-和IgG-结合的肠道微生物群组成和推断的宏基因组功能
维生素D与粪便上清液中分泌型IgA水平增加（+744.6 ng/mL, p < 0.01）和血清IgA水平增加（+0.90 ng/mL, p < 0.01）相关。维生素D治疗后，粪便IgG水平有非显著下降（-279.5 ng/mL, p = 0.18），血清IgG水平无差异（p = 0.77）(图S1A和S1B)。维生素D导致仅IgA（IgA+IgG−）与肠道细菌的结合增加（+17.9%, p < 0.001），以及总的IgG（IgG+IgA−和IgG+IgA+的组合）与肠道细菌的结合减少（-9.3%, p < 0.05）。在按IBD亚型进行的亚组分析中，维生素D导致溃疡性结肠炎中仅IgA结合的肠道细菌增加20%（p < 0.01），克罗恩病中增加15.2%（p < 0.05）。维生素D导致溃疡性结肠炎中总的IgG与肠道细菌的结合减少15.2%（p < 0.05），克罗恩病中非显著减少6.5%（图1C）。在用于测试药物混淆效应的敏感性分析中，不同IBD药物类别患者之间IgA结合和IgG结合的肠道细菌没有差异（表S1; 图S2A和2B）。在相关性分析中，仅IgA结合的肠道细菌与血清25(OH)D水平相关（Pearson rho = 0.408, p < 0.0001），而总的IgG结合的肠道细菌与疾病活动度（Pearson rho = 0.447, p < 0.0001）和粪便钙卫蛋白（Pearson rho = 0.439, p < 0.0001）相关（图1D）。维生素D未导致通过香农指数（Kruskal-Wallis, p = 0.48）测量的α多样性（图S3A）或β多样性（Bray Curtis相异性，R2 = 0.03, PERMANOVA, p = 0.32）有任何显著变化，在调整炎症状态后（图S3B）。就整个肠道微生物组组成而言，维生素D导致瘤胃球菌科、粪杆菌属、普氏粪杆菌、双形杆菌、罗氏菌属、颤螺菌属和毛螺菌属的丰度增加（Lefse LDA >3, Wilcoxon p < 0.05），以及肠杆菌科、乳杆菌科、片球菌属、玉米片球菌、棒状杆菌属和伯克霍尔德菌科的丰度降低（图S3C）。
维生素D未导致IgA结合（Kruskal-Wallis, p = 0.48）和IgG结合（Kruskal-Wallis, p = 0.48）肠道细菌的α多样性（通过香农指数）有任何显著变化。在对炎症进行多变量调整后，维生素D导致IgA结合的肠道细菌组成发生显著变化（Bray Curtis相异性，R2 = 0.04, PERMANOVA, p = 0.03）（图2A）。在基于Lefse的差异丰度分析中（LDA>3, Wilcoxon p < 0.05），维生素D导致IgA与毛螺菌科、梭菌目、布劳特氏菌属、拟杆菌门、乳酸菌和毛螺菌科瘤胃球菌属的结合增加。相反，维生素D导致IgA与包括变形菌门、假单胞菌目、维罗尼菌、梭杆菌门、玉米片球菌、放线菌科、乳杆菌目和酸杆菌门在内的几个类群的结合减少（图2A）。同样，使用Palm指数，维生素D与IgA与厚壁菌门、毛螺菌科、梭菌目和布劳特氏菌属的结合增加以及变形菌门的结合减少相关（图S4）。类似地，使用IgA-seq概率比，维生素D与IgA与厚壁菌门、毛螺菌科、梭菌目和布劳特氏菌属的结合增加以及变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门的结合减少相关（图S5）。对于IgG结合的肠道细菌，肠道细菌群落组成有差异趋势（Bray Curtis相异性，R2 = 0.04, PERMANOVA, p = 0.09）（图2B）。在基于Lefse的差异丰度分析中（LDA>3, Wilcoxon, p < 0.05），维生素D导致IgG与梭菌目、厚壁菌门、拟杆菌科、毛螺菌科瘤胃球菌属和乳酸菌的结合增加。相反，维生素D导致IgG与包括变形菌门、假单胞菌目、乳杆菌科、片球菌属、肠球菌科、长双歧杆菌、海拉诺菌和玉米片球菌在内的几个类群的结合减少（图2B）。同样，使用Palm指数，维生素D与IgG与变形菌门和乳杆菌科的结合减少相关（图S6）。类似地，使用IgG-seq概率比，维生素D与IgG与变形菌门、拟杆菌门、肠球菌属、乳杆菌科和片球菌属的结合减少相关（图S7）。
鉴于维生素D导致IgA和IgG结合的肠道细菌类群发生显著改变，我们接下来试图了解维生素D是否导致推断的细菌宏基因组功能（KEGG通路）发生变化，使用PICRUST2。维生素D改变了IgA结合的肠道微生物氨基酸代谢（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解减少；苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸的代谢减少；酪氨酸的代谢增加）、碳水化合物代谢（淀粉和蔗糖的代谢减少，磷酸戊糖途径减少，半乳糖代谢增加）、脂肪酸代谢（脂肪酸降解减少，短链脂肪酸丙酸代谢增加）以及芪类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成增加（图2C）。同样，维生素D改变了IgG结合的肠道微生物氨基酸代谢（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解减少；色氨酸的代谢减少；酪氨酸的代谢增加）、甲烷代谢减少、苯甲酸降解减少以及甜菜红素生物合成和己内酰胺降解增加（图2C）。
为了了解几种IgA和IgG结合的肠道细菌的临床意义，我们进行了相关性分析（图2D），以确定它们与IBD患者临床参数的关联。几种Ig结合细菌与疾病活动度（IgA-Gammaproteobacteria纲、IgA-变形菌门、IgG-变形菌门、IgG-片球菌属、IgG-乳杆菌科）和钙卫蛋白（一种粪便炎症生物标志物）（IgA-Gamm
IgA-Gammaproteobacteria纲、IgA-变形菌门、IgA-梭杆菌纲、IgG-Gammaproteobacteria纲、IgG-变形菌门、IgG-拟杆菌门、IgA-拟杆菌门、IgG-拟杆菌目）。相反，几种Ig结合肠道细菌与疾病活动度（IgG-厚壁菌门、IgG-乳酸菌、IgA-毛螺菌科、IgA-梭菌纲）和钙卫蛋白（IgA-梭菌纲、IgA-布劳特氏菌属、IgA-毛螺菌科）呈负相关（图2D）。
维生素D改变PBMC组成并促进浆细胞样树突状细胞与B细胞之间的BAFF信号传导
为了了解维生素D如何改变IBD患者的宿主免疫外周血细胞，我们对维生素D治疗前后获得的外周血单核细胞（PBMC）进行了scRNA-seq分析。最终经质量控制后的PBMC scRNA-seq数据集包含375K个细胞（图3A），涵盖了所有主要免疫细胞谱系（B细胞、T细胞、单核细胞、树突状细胞、血小板和红细胞）。在差异丰度分析中（图3B），12周的维生素D导致双阴性T淋巴细胞（dnT）（p < 0.0001）、常规1型树突状细胞（cDC1）（p < 0.01）和CD8 T效应记忆细胞（CD8 TEM）（p < 0.05）增加，同时CD8初始T细胞（p < 0.05）和自然杀伤（NK）细胞（p < 0.05）减少。为了了解Ig结合肠道细菌的免疫原性，我们进行了相关性分析以确定它们与外周血免疫细胞的关联（图3C）。IgA-变形菌门与NK增殖细胞、粘膜相关恒定T（MAIT）细胞、CD14单核细胞、CD4增殖细胞和CD4 CTL呈正相关。IgA-毛螺菌科与dnT、先天淋巴细胞（ILCs）和AXL+SIGLEC6+树突状细胞（ASDCs）呈正相关。IgG-肠球菌属与中央记忆CD8 T细胞（CD8 TCM）呈正相关。IgA-维罗尼菌和IgA-假单胞菌科均与T调节细胞呈正相关。IgG-Gammaproteobacteria纲与γδT细胞（gdT）呈负相关。
我们接下来使用CellChat来了解维生素D对IBD患者细胞间相互作用和信号通路的影响。与第0周相比，第12周维生素D治疗后，pDCs与B细胞亚群（初始B细胞、中间B细胞、记忆B细胞和浆母细胞）之间的细胞间相互作用数量和强度增加（图3D）。ASDC与B细胞亚群之间细胞间相互作用的强度也在第12周与第0周相比有所增加。系统通路分析揭示了在第12周与第0周相比显著改变的8条信号通路（IL-1, CCL, GALECTIN, TGFb, BAFF, GRN, ANNEXIN, 和 PARs）（图3E）。在这些通路中，只有B细胞活化因子信号通路定位于树突状细胞和B细胞（图3F）。进一步分析显示，在第12周与第0周相比，pDCs与B细胞亚群之间的BAFF信号传导增加（图3G），并且是通过pDCs与初始B细胞、中间B细胞和记忆B细胞之间的TNFSF13B-TNFRSF13C配体-受体相互作用，以及pDCs与浆母细胞之间的TNFSF13B-TNFRSF17配体-受体相互作用介导的（图3H）。
维生素D导致外周血BCR和TCR克隆型发生转变，这些克隆型与特定的Ig结合肠道细菌相关
鉴于维生素D导致Ig与特定肠道细菌的结合发生改变，并促进了涉及免疫耐受和抗原呈递的细胞相互作用（树突状细胞-B细胞相互作用），我们假设维生素D可以调节在IBD中对肠道细菌具有反应性的BCR和TCR克隆型。除了scRNA-seq，我们还对维生素D治疗前后的血液样本进行了配对的scBCR-seq和scTCR-seq。根据患者样本和克隆型组，BCR和TCR克隆型的相对丰度分别总结在图S8A和S9A中。维生素D治疗后，BCR克隆型数量（p = 0.1）和TCR克隆型数量（p = 0.2）有增加的趋势（图4A）。维生素D治疗后，BCR和TCR克隆多样性（通过Chao1测量）也有类似的增加趋势（图S8B和S9B）。维生素D没有改变大和超扩增的BCR（图S8C）和TCR（图S9C）克隆型的相对丰度。维生素D增加了IGHA1同种型使用频率（p = 0.02），但对其余同种型（IGHA2, IGHG1, IGHG2, IGHG3, 和 IGHG4）、BCR互补决定区（CDR3）长度或BCR体细胞高频突变（SHM）率没有显著影响（图S9D）。
为了确定维生素D对BCR和TCR克隆型的影响，我们对IBD患者临床试验队列中前200个公共（共享）BCR（表S2）和TCR克隆型（表S3）进行了差异丰度分析。维生素D导致12个BCR克隆型（CDR3可变编码区）发生差异变化（p < 0.01, 错误发现率[FDR] <0.1）（图4B; 表S2），包括增加CQQRSNWLYTF-IGKV3-11∗01 (FC = 6.73), CMQALQTSITF-IGKV2-28∗01 (FC = 6.03), CQSYDRSLSGSDVF-IGLV1-40∗01 (FC 5.94), CQVWDSSSDHYVF-IGLV3-21∗04 (FC 3.07), CQQANSFPYTF-IGKV1-12∗01 (FC 3.07), CQQYGSSPPTF-IGKV3-20∗01 (FC 2.86), CQQYDNLPPTF-IGKV1-33∗01(FC 2.73), CQQYNSYPYTF-IGKV1-5∗03 (FC 1.39), 和 CSSYTSSSTLYVF-IGLV2-14∗01(FC 1.19) 以及减少 CMQATQFPNTF-IGKV2-24∗01(FC -8.83), CSSYTTSSTLVF-IGLV2-14∗01(FC -5.31), 和 CQQYGSSLYTF-IGKV3-20∗01 (FC -3.52)。同样，维生素D导致18个TCR克隆型发生差异变化（p < 0.01, FDR <0.05）（图4C; 表S3），包括增加FRVTLTDKLIF-TRDV3∗01(FC 10.59), CAAWDTRLLVGSRY-TRGV10∗02(FC 10.34), CASTLLAGGHNTGELFF-TRBV6-7∗01(FC 8.60), CATWDGPGYYKKLF-TRGV2∗01(FC 5.76), HRQSQPPGKQCFQDNL-TRAV26-1∗01(FC 4.41), CASSPIAGTGKLGYTF TRBV7-2∗01(FC 4.07), HLPLSDSP-TRAV26-1∗01(FC 3.23), GHKKLF-TRGV9∗01(FC 2.98), CAAWGHTLYYKKLF-TRGV10∗02(FC 2.96), CASSLPMQETQYF-TRBV28∗01(FC 2.83), CATWDCRFWRAL-TRGV3∗01(FC 2.64), CSVNVGQGDSNQPQHF-TRBV29-1∗01(FC 2.63), CATWDEHNKKLF-TRGV2∗02(FC 2.62), CACDTVLGDTPTDKLIF-TRDV2∗01(FC 2.36), CASRRRGDHSNQPQHF-TRBV5-1∗01(FC 2.26), CAMSANFGNEKLTF-TRAV12-3∗01(FC 2.26), 和 CASSTPRTGTGRYEQYF-TRBV9∗01(FC 1.66)。只有一个TCR克隆型CASNPGQGSYEQYF-TRBV5-6∗01在维生素D治疗后显著减少（FC = -4.55）。
我们接下来进行了相关性网络分析，以确定差异表达的BCR和TCR克隆型与IBD患者中IgA和IgG结合肠道细菌的关联（图S8D和S9D; 表S4和S5; 图4D和4E）。在相关性网络分析中，CQQYNSYPYTF-IGKV1-5∗03与IgG-肠球菌属、IgG-肠球菌科和IgA-毛螺菌科呈正相关。两个BCR克隆型（CMQALQTSITF-IGKV2-28∗01 和 CQQANSFPYTF-IGKV1-12∗01）与属于拟杆菌门的IgG和IgA结合类群呈强正相关。CQSYDRSLSGSDVF-IGLV1-40∗01与IgA-布劳特氏菌属和IgA-毛螺菌科呈正相关。CQQYGSSLYTF-IGKV3-20∗01与IgG-玉米片球菌、IgG-毛螺菌科瘤胃球菌属和IgG-片球菌属呈正相关，与IgA-毛螺菌科和IgG-厚壁菌门呈负相关（图4D）。几个TCR克隆型也与Ig结合肠道细菌显著相关。GHKKLF-TRGV9∗01与IgA-乳酸菌、IgG-乳酸菌和IgG-梭菌目呈正相关。四个TCR克隆型（CATWDEHNKKLF-TRGV2∗02, FRVTLTDKLIF-TRDV3∗01, CASTLLAGGHNTGELFF-TRBV6-7∗01, 和 CAAWDTRLLVGSRY-TRGV10∗02）与属于拟杆菌门的IgG和IgA结合类群呈强正相关。CASNPGQGSYEQYF-TRBV5-6∗01与IgA-Gammaproteobacteria纲、IgA-变形菌门、IgG-假单胞菌目、IgG-Gammaproteobacteria纲、IgG-变形菌门和IgA-乳杆菌科呈正相关，与IgA-毛螺菌科和IgA-梭菌纲呈负相关。CASSTPRTGTGRYEQYF-TRBV9∗01与IgG-片球菌属呈正相关，与属于变形菌门的IgA和IgG结合类群呈负相关（图4E）。
scRNA-seq揭示维生素D诱导的α4β7+ B细胞异质性和α4β7+ CX3CR1 B调节细胞
我们接下来将分析重点放在通过表达肠道归巢整合素α4β7而运输到胃肠道的免疫细胞上。我们从主要的PBMC scRNA-seq数据集中创建了一个α4β7+细胞子集，产生了163.6K个细胞（图S10A）。在差异丰度分析中，α4β7+ cDC1、dnT和ILCs增加，而α4β7+ NK细胞在维生素D治疗后减少（图S10B）。
对α4β7+ B细胞（10.7K个细胞）进行亚聚类产生了12个转录上不同的α4β7+ B细胞亚群（图5A，左）。所有α4β7+ B细胞都强烈表达CD20（MS4A1），除了浆母细胞簇强烈表达CD319（SLAM7）。这些亚群（括号内为关键基因标记；图S11A）包括CXCR4初始B细胞（CD20, CXCR4, TCL1A, IGHM, IGHD, 和 JUND）、BACH2初始B细胞（MS4A1, BACH2, SLC38A11, 和 ZNF630）、CX3CR1+ B调节细胞（MS4A1, CX3CR1, PRF1, GZMA, GZMB, GZMH, TGFBR3, PRDM1, IL10RA, 和 TGFBI；图S11B）、CD28初始B细胞（MS4A1, CD28, LEF1, 和 INPP4B）、PPARG初始B细胞（MS4A1, PPARG, SMAD1, 和 IL1R1）、初始B细胞（MS4A1, IGHD, IGHM, 和 CD40）、初始IFN B细胞（MS4A1, CCR4, IL32, 和 TNFRSF25）、未转换记忆B细胞（MS4A1, CD1C, TNFRSF13B, 和 GPR183）、转换记忆B细胞（MS4A1, IGHE, ITGB1, CD27, CD82, 和 CD86）、过渡B细胞（MS4A1, IGHD, IGHM, MME (CD10), CD24, 和 CD38）、浆母细胞（SLAM7/CD319, SDC1/CD138, CD38, IGHA1, IGHA2, IGHG1, IGHG2, IGHG3, 和 IGHG4）和非典型记忆B细胞（MS4A1, CD19, TBX21, 和 ITGAX）。轨迹分析（图5A，右）揭示了B细胞亚群的伪时间（描述细胞在推断发育轨迹中相对位置的数字），表明CXCR4初始B细胞的伪时间较低；浆母细胞、BACH2和CD28初始B细胞具有中等伪时间；而CX3CR1+ B调节细胞具有最高的伪时间（表明其沿着分化/发育途径走得最远）。在差异丰度分析中，维生素D导致α4β7+ CXCR4 B初始细胞、BACH2 B初始细胞、B初始细胞和过渡B细胞减少，并增加α4β7+ CX3CR1+ B调节细胞、CD28初始细胞和初始IFN B细胞（图5B）。临床上，α4β7+ 浆母细胞与通过钙卫蛋白测量的肠道炎症呈正相关（Pearson R = 0.4331, p < 0.001）（图5C）。
鉴于scRNA-seq数据中B细胞和pDC相互作用的增加，我们接下来通过共培养实验评估了这些细胞相互作用和维生素D在刺激B细胞中IgA表达和促进B调节细胞诱导中的重要性。与仅B细胞组相比，B细胞+pDC+维生素D共培养组中IgA+ B细胞的平均荧光强度（MFI）显著增加，表明pDC和维生素D都是增加IgA+ B细胞所必需的。维生素D和/或pDC共培养组中IgG+和IgM+ B细胞的MFI没有差异（图5D）。我们还观察到，与仅B细胞+维生素D或仅B细胞+pDC相比，B细胞+pDC+维生素D共培养组中
α4β7+ CX3CR1+ B调节细胞的百分比增加。我们的结果表明，维生素D和pDCs可能协同作用，从外周血B细胞中诱导α4β7+ CX3CR1+ B调节细胞（图5E）。
我们进行了相关性网络分析（图S12A和5F；表S6），以确定α4β7+ B细胞亚群与Ig结合肠道细菌的关联。α4β7+ CX3CR1+ B调节细胞与IgG-厚壁菌门呈正相关，与IgA-变形菌门、IgG-Gammaproteobacteria纲和IgG-变形菌门呈负相关。α4β7+ 浆母细胞与IgA-维罗尼菌和IgA-假单胞菌科呈负相关。α4β7+ CXCR4初始B细胞与IgA-乳杆菌科、IgA-梭杆菌纲、IgG-乳杆菌科、IgG-肠球菌科和IgG-肠球菌属呈正相关。α4β7+ BACH2初始B细胞与IgG-玉米片球菌、IgG-毛螺菌科瘤胃球菌属和IgA-乳杆菌科呈正相关。α4β7+ 过渡B细胞与IgA-乳杆菌科、IgG-肠球菌科和IgG-肠球菌属呈正相关。
scRNA-seq揭示维生素D诱导的α4β7+ T细胞异质性和α4β7+ T调节细胞
鉴于T细胞在维持对肠道微生物群免疫耐受中的作用以及它们在肠道中T细胞依赖性IgA诱导中的作用，我们接下来检查了维生素D对α4β7+ T亚群的影响及其与Ig结合肠道细菌的关联。我们的α4β7+ T细胞scRNA-seq子集包含36.7K个CD4 T细胞和28.9K个CD8 T细胞。
我们使用先前发表的PBMC scRNA-seq参考，通过基因特征（前100个基因）注释了10个转录上不同的α4β7+ CD4 T细胞亚群：CD4初始细胞、CD4 Temra细胞、初始TReg细胞、CD4 Th17细胞、TReg KLRB1+RORC+细胞、TReg细胞毒性细胞、CD4 Tfh细胞、CD4 Th1/Th17细胞、CD4 HLA−DR + 记忆细胞和CD4 Th1细胞（图6A，左）。在轨迹分析中，α4β7+ CD4初始细胞具有最低的伪时间；CD4 Th1和CD4 Th1/Th17细胞具有中等伪时间；而CD4 Temra细胞、初始TReg细胞和TReg细胞毒性细胞具有最高的伪时间（图6A，右）。在差异丰度分析中，维生素D导致α4β7+ CD4 Temra细胞、初始TReg细胞和TReg细胞毒性细胞增加（图6B）。
我们确定了六个转录上不同的α4β7+ CD8 T细胞亚群：CD8 Temra细胞、CD8 Tem GZMK+细胞、CD8 Tem GZMB+细胞、CD8初始细胞、MAIT细胞和gdT细胞（图6C，左）。在轨迹分析中，α4β7+ CD8 Temra细胞和CD8 Tem GZMB+细胞具有最低的伪时间，而CD8 Tem GZMK+细胞具有最高的伪时间（图6C，右）。在差异丰度分析中，维生素D导致α4β7+ CD8 Tem GZMK+细胞增加，并减少α4β7+ γδT细胞（gdT）（图6D）。临床上，α4β7+ TReg细胞毒性细胞（Pearson R = -0.8022, p < 0.0001）和CD4 Th1细胞（Pearson R = -0.3123, p < 0.001）与疾病活动度评分呈负相关。α4β7+ gdT细胞与疾病活动度之间存在正相关趋势（Pearson R = 0.2006, p = 0.05）（图6E）。
在相关性网络分析中（图S12B和6F；表S7），α4β7+ 初始TReg细胞和α4β7+ TReg细胞毒性细胞与IgG-梭菌目、IgG-厚壁菌门和IgA-毛螺菌科呈正相关，与IgA-变形菌门和IgG-变形菌门呈负相关。α4β7+ CD4 Temra细胞与IgG-片球菌属呈正相关。α4β7+ CD4 Th17细胞与IgA-叶杆菌属、IgA-α变形菌纲、IgA-维罗尼菌、IgA-假单胞菌科、IgG-肠球菌属和IgG-肠球菌科呈正相关，与IgG-乳杆菌科呈负相关。α4β7+ gdT细胞与IgG-海拉诺菌、IgA-变形菌门、IgA-Gammaproteobacteria纲、IgG-Gammaproteobacteria纲和IgG-变形菌门呈正相关。α4β7+ CD8 Tem GZMB+细胞与IgG-海拉诺菌呈正相关。
讨论
IBD患者维生素D水平低与临床复发风险增加、疾病活动度和肠道炎症相关。在此，我们报道了在维生素D水平低的IBD患者中进行为期12周的维生素D干预与疾病活动度和粪便钙卫蛋白的改善相关，同时通过IgA和IgG与特定细菌类群的结合以及α4β7+外周血免疫表型的改变，改变了宿主免疫-微生物相互作用。虽然先前的横断面研究已经表征了IBD患者中IgA和IgG结合肠道细菌的组成及其与治疗和临床结局的关联，但我们的前瞻性多组学研究证明了通过特定的营养干预重新编程Ig与肠道微生物群的结合以及免疫耐受的能力。
粘膜IgA在肠道免疫稳态中起着关键作用。IgA缺乏可导致胃肠道自发性炎症、促炎肠道细菌富集和肠道微生物群系统性免疫反应增加。IgA结合的肠道细菌，如臭杆菌属，与UC患者粪菌移植（FMT）的疗效相关，并可直接限制结肠炎。因此，增加内源性IgA与肠道微生物群的结合可能具有保护性和抗炎作用。我们的前瞻性研究确定了维生素D治疗是一种增加IBD患者中IgA结合肠道微生物群的策略，并选择性地增加IgA与几种有益细菌类群（毛螺菌科、布劳特氏菌属）的结合。布劳特氏菌属可以通过产生短链脂肪酸（SCFA）刺激结肠粘液生长和肠道屏障完整性。毛螺菌科是SCFA产生菌，并已知通过7α-脱羟基作用将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，后者对IBD具有抗炎作用。我们的研究还揭示，维生素D增加了α4β7+ T调节细胞的比例。我们的发现与先前揭示维生素D在诱导T调节细胞分化中作用的研究一致，并将这些观察扩展到包括肠道归巢的α4β7+ T调节细胞。有趣的是，在我们的研究中，IgA-毛螺菌科（鞭毛细菌）与α4β7+ T调节细胞呈正相关。这与先前的研究相平行，这些研究表明T调节细胞通过共生调节环调节针对微生物抗原如鞭毛蛋白的IgA反应。综上所述，我们的数据表明，维生素D可能通过诱导T调节细胞来增加IgA与肠道微生物群的结合，并通过选择产生SCFA和次级胆汁酸的IgA结合肠道细菌产生额外的抗炎作用。
虽然IgA与肠道微生物群的结合是保护性和稳态性的，但IgG与肠道细菌的结合被认为是促炎性的，并通过与吞噬细胞上的Fcγ受体结合，在溃疡性结肠炎中触发17型炎症。在我们的研究中，IgG结合的肠道细菌，主要是IgG-变形菌门和IgG-拟杆菌门，与疾病活动度和炎症标志物（CRP、粪便钙卫蛋白）呈正相关。我们还发现IgG-肠球菌科与促炎性的α4β7+ CD4 Th17细胞相关。我们的维生素D干预减少了总体上IgG与肠道微生物群的结合，其中大多数属于变形菌门和肠球菌科的类群。变形菌门，包括具有粘附侵入能力的大肠杆菌，被认为是促炎性的，并在IBD中发挥致病作用。针对变形菌门子集（例如，大肠杆菌抗原）的抗体增加与克罗恩病患者的严重表型、频繁疾病进展、较长病程和更大的手术需求相关。肠球菌科在IBD患者中增加，并可在IBD小鼠模型中触发肠道炎症、发育异常和癌变。虽然我们的研究表明维生素D可以降低IBD患者中IgG-变形菌门和IgG-肠球菌科的水平，但还需要进一步的工作来确定这些特定的宿主免疫微生物相互作用的减少如何改变IBD表型和临床结局。在肠道炎症中，调节从稳态性IgA到促炎性IgG的同种型转换的机制尚不清楚。我们的BCR组库同种型使用分析显示，维生素D增加了BCR同种型IgA1的使用，但对IgG同种型的使用没有显著影响。因此，我们的数据可能表明，维生素D治疗后IgG与肠道细菌的结合减少可能是IgA与肠道微生物结合增加的一个间接效应，后者可能竞争性地结合细菌表位，而不是直接调节IgG同种型转换。
为了推断维生素D增加IgA与肠道微生物群结合的潜在机制，我们使用scRNA-seq进行了细胞-细胞相互作用和系统信号通路分析。我们的研究表明，维生素D增加了pDCs与B细胞亚群之间的BAFF信号传导。有趣的是，一项先前的研究表明，pDC与初始B细胞共培养可诱导IgA同种型转换，这依赖于pDCs表达的BAFF。为了阐明维生素D在pDCs诱导IgA+ B细胞中的作用，我们进行了B细胞和pDCs的共培养实验。我们发现，活性形式的维生素D（1,25(OH)D2）和pDCs都是增加IgA+ CD19+ B细胞所必需的。综上所述，我们的数据表明，维生素D也可能通过增加pDC-B细胞相互作用和BAFF信号传导来诱导IgA+ B细胞，从而增加IgA与肠道微生物群的结合。
我们使用scRNA-seq研究了外周肠道归巢α4β7+ B细胞的免疫景观。值得注意的是，我们发现维生素D增加了α4β7+ CX3CR1 B调节细胞的比例（同时减少了未成熟的α4β7+初始B细胞），这些细胞增加了细胞毒性基因（PRF1, GZMA, GZMB, GZMH）、TGFBR3和IL10RA的表达。耐受性B调节细胞已被证明可以减轻IBD中的慢性炎症，并且CX3CR1 B调节细胞可以有效抑制效应CD4 T细胞的活化。为了阐明维生素D是否可以直接诱导外周B细胞分化为α4β7+ CX3CR1 B调节细胞，我们进行了维生素D、B细胞和pDCs的共培养实验。我们发现，pDCs和1,25(OH)D2的存在对于在体外诱导α4β7+ CX3CR1 B调节细胞分化是必要的。先前的研究表明，肠道微生物组及其代谢物支持胃肠道中B调节细胞的发育和功能。为了推断B调节细胞-肠道微生物组的相互作用，我们进行了相关性分析，结果显示α4β7+ CX3CR1 B调节细胞与IgG-厚壁菌门（已知的SCFA产生菌）呈正相关。尽管这种相互作用的功能意义尚不清楚，但一项先前的研究表明，微生物组来源的SCFA丁酸盐通过激活芳烃受体支持B调节细胞的功能。未来的工作有必要探索B调节细胞-肠道微生物组相互作用的机制以及维生素D诱导的α4β7+ CX3CR1 B调节细胞在IBD患者中的治疗潜力。
总之，我们的研究表明，维生素D可以通过增加IgA和减少IgG与肠道细菌的结合来促进IBD患者对共生肠道微生物群的免疫耐受。具体来说，我们的研究证明了维生素D富集了IgA结合的有益细菌（具有已知的SCFA和次级胆汁酸产生表型），并减少了先前与IBD发病机制相关的IgG结合的促炎细菌。此外，我们的研究揭示了维生素D调节耐受性途径，包括pDCs与B细胞之间的BAFF信号传导，以及通过诱导抗炎性α4β7+ B和T调节细胞。我们的研究还生成了前瞻性免疫组库数据集，并鉴定了与特定Ig结合肠道细菌类群相关的BCR和TCR克隆型。我们的研究强调了免疫组库的可塑性以及通过饮食干预如维生素D补充来重新编程BCR和TCR克隆型的能力。总体而言，我们的结果揭示了一种在IBD中调节对肠道微生物群免疫耐受的策略，并为操纵宿主免疫-微生物相互作用以增强免疫耐受和解决IBD发病机制中的关键组成部分提供了基础。
研究的局限性
由于固有的局限性，在解释我们的结果时需要谨慎。尽管我们对一个表型明确的IBD患者队列进行了维生素D治疗的前瞻性研究，但我们的维生素D干预并非随机或安慰剂对照。相反，维生素D治疗与同一组患者的低维生素D状态基线进行比较，这避免了基线肠道微生物组组成和免疫组库的个体间异质性。尽管如此，外部混杂效应被最小化，因为在维生素D治疗期间没有药物变更或新的抗生素暴露。此外，我们包含了维生素D的体外共培养研究（包括维生素D安慰剂对照），这补充并支持了我们在IBD患者中的临床观察。此外，我们的研究没有考虑来自饮食来源或阳光照射的维生素D。需要进一步的研究来评估是否通过饮食和/或阳光照射提高维生素D水平可以重现口服维生素D补充剂的效果。我们还只评估了维生素D治疗的两个时间点，因此我们的发现超过12周的效应大小和持久性仍不清楚。最后，我们的研究使用了16S rRNA测序而不是宏基因组测序，无法考虑肠道微生物组群落内病毒和真菌的影响或宏基因组功能。尽管存在这些固有的局限性，但我们的研究揭示了通过特定的营养干预如维生素D补充，在IBD中调节对肠道微生物群免疫耐受以及免疫组库-肠道微生物组关系的机制见解。鉴于高质量前瞻性人类宿主免疫-肠道微生物组研究的稀缺性，我们的研究具有重要的临床意义，并可为未来旨在通过个性化营养调节慢性炎症和自身免疫性疾病患者免疫反应的研究提供信息。
资源可用性
主要联系人
有关资源和试剂的进一步信息和请求应直接联系并将由主要联系人John Gubatan完成。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。
数据和代码可用性
所有数据均可根据要求向主要联系人John Gubatan索取。本研究期间生成的所有scRNA-seq和免疫组库数据均可在基因表达综合数据库（GEO）中以登录号GSE319270获取。本研究下生成的所有IgA-SEQ和IgG-SEQ数据均可在基因表达综合数据库（GEO）中以登录号GSE319142获取。本研究下生成的所有全粪便16S数据均可在基因表达综合数据库（GEO）中以登录号GSE319268获取。本研究中未生成自定义代码。重新分析本工作论文中报告的数据所需的任何其他信息均可根据要求向主要联系人获取。
致谢
我们感谢患者参与者的参与和努力，使得这项研究得以进行。J.G.和本项目部分得到了Doris Duke医师科学家奖学金（资助号#2021091）、CZ Biohub医师科学家学者奖、NIH NIDDK LRP奖（2L30 DK126220）、斯坦福转化研究和应用医学（TRAM）学者奖以及斯坦福MCHRI儿科IBD和乳糜泻研究奖的支持。我们感谢BD Biosciences的Helen Smith博士在BD Rhapsody单细胞平台方面的技术支持。
作者贡献
J.G.构思并设计了研究，获得了资金，并撰写了手稿。R.S., J.H., T.F., 和 M.T.在斯坦福地点招募患者、获取和处理血液及粪便样本，并维护临床试验元数据。T.B.和O.H.N.在丹麦地点领导患者招募、样本收集和处理。S.R.和S.R.S.提供实验室和临床研究协调员支持。R.S., J.Y., 和 J.H.进行细菌FACS和Ig-seq实验。J.G., R.S., J.Y., 和 J.H.进行scRNA-seq实验。S.S.和J.S.提供肠道微生物组实验、数据分析和解释方面的指导。J.G.进行肠道微生物组分析。J.G.进行scRNA-seq和免疫组库分析。J.G.制作手稿图表和表格。P.K.协助BCR度量数据处理和分析。Y.R., P.K., 和 S.B.提供关于免疫组库和B细胞分析及数据解释的反馈。S.R., M.J.R., O.H.N., S.B., J.S., 和 S.R.S.提供关于数据展示和手稿的关键反馈。
利益声明
作者声明没有竞争性利益。
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