摘要
天然化合物，如蜂蜜衍生的黄酮类和酚类化合物，因其减轻皮肤衰老和预防氧化应激诱导的细胞损伤的潜力而日益受到关注。在此背景下，本研究采用动态细胞培养模型评估了蜂蜜预处理对紫外线(UV)诱导衰老后干细胞相关基因和Wnt信号通路的保护作用。通过使用生物反应器，对从健康皮肤活检中获得的皮肤干细胞(SSCs)和人皮肤成纤维细胞(HFF1)进行1%蜂蜜预处理48小时，随后暴露于UV下。对Wnt信号传导和抗衰老分子反应进行了实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析。蜂蜜预处理增强了多能性标志物(Oct4；Sox2)的表达，并降低了SSCs中与衰老相关的细胞周期调节因子(p16；p21；p53)的表达。在UV损伤的SSCs中，蜂蜜也显著增加了Wnt3a的表达。在成纤维细胞中，蜂蜜预处理上调了热休克蛋白70(Hsp70)和透明质酸合成酶2(HAS2)的表达，同时下调了caspase-8(CASP8)的表达，表明其对UV介导的细胞应激具有保护作用。我们还分析了处理后细胞的NO释放和总抗氧化能力。综上所述，这些发现表明蜂蜜可能通过调节多能性和衰老相关基因以及通过Wnt信号通路的改变来调节分化，从而保护皮肤干细胞免受UV诱导的衰老。此外，成纤维细胞中Hsp70的上调似乎增强了细胞应激反应并支持稳态稳定性。
关键词：干细胞；衰老；生物活性分子；再生医学
1. 引言
皮肤作为人体最大的器官，充当着抵御外部环境因素的第一道防线，其中紫外线辐射是最有害的因素之一[1]。紫外线暴露，特别是UVB和UVC，会导致细胞水平的显著损伤，通过DNA损伤、氧化应激和降低细胞更新能力加速皮肤衰老过程[2]。这种损伤不仅表现为皱纹和色素沉着等美学问题，还增加了皮肤癌和其他疾病的风险。间充质干细胞(MSCs)对于维持皮肤稳态至关重要，因为它们能够分化并替代受损细胞[2,3]。干细胞数量或活性的减少（这些细胞对于维持皮肤稳定性至关重要）与早衰和皮肤癌相关。紫外线诱导的应激可导致这些细胞过早衰老，降低其再生潜力并影响整体皮肤健康[4]。最近的研究强调了保护MSCs免受此类损伤以维持其多能性并确保有效组织再生的重要性。
蜂蜜已被用于医疗目的超过2000年。它含有生物活性成分，如糖、水、蛋白质、维生素、矿物质和天然抗氧化化合物，包括酚类化合物和黄酮类[5,6]。先前研究表明，蜂蜜衍生的植物化学物质可以调节衰老的基本分子通路。如乙酰丙嗪、松属素、黄岑素、丁香酸和咖啡酸等化合物已被报道可以激活干细胞相关信号(Oct4/Sox2, Wnt/β-catenin)，刺激与长寿相关的酶(去乙酰化酶)，并减轻氧化应激和DNA损伤[7-11]。此外，蜂蜜具有通过氧化应激、炎症和细胞凋亡治疗多种疾病的治疗潜力，并可能在皮肤再生和癌症中发挥作用[6]。此外，蜂蜜通过维持干细胞活力支持组织稳态，可作为基于干细胞疗法的有用生物材料。其对脂肪和脐带来源干细胞的积极影响也已被确定[12,13]。Oryan等同事在大鼠烧伤模型中表明，脂肪干细胞和蜂蜜的组合降低了促炎细胞因子(IL-1β; TGF-β1)，增加了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达，促进了血管生成、再上皮化和肉芽组织发育。第28天较高的bFGF水平显示了抗疤痕效果，并揭示了蜂蜜提供脂肪干细胞活力支持的能力，增强了对氧化应激的抵抗力和其再生能力[12]。Das等指出，由于蜂蜜具有抗氧化和抗炎作用，它降低了脐带来源间充质干细胞中的活性氧和相应的衰老指标。他们的研究表明，在聚乙烯醇(PVA):蜂蜜基质上生长的细胞比纯PVA上的细胞具有更高的细胞增殖和更低的β-半乳糖苷酶(β-gal)阳性衰老率[13]。除了这些细胞效应外，蜂蜜还可能影响塑造干细胞行为的细胞内信号通路。其中最重要的是Wnt信号通路，它在控制干细胞增殖、维持稳态和指导分化方面发挥核心作用，因此可能是蜂蜜支持再生过程的机制之一[14-16]。其他研究表明Wnt3a可以增强干细胞存活和增殖，而Wnt/β-catenin通路通过影响活性氧(ROS)的产生来调节干细胞衰老[17-19]。此外，非经典Wnt信号在皮肤细胞的定向迁移、细胞极性和微环境敏感性等过程中起基本调节作用[20]。在其他通路中，Hsp70和B淋巴瘤Mo-MLV插入区域1(Bmi1)对于成人干细胞保护和癌症调控至关重要[21]，抑制引发衰老和凋亡的基因[21,22]，并诱导DNA修复和维持细胞外基质(ECM)完整性，可能减少皱纹形成[23]。
在此背景下，本研究调查了来自土耳其东部安纳托利亚的多花蜂蜜对皮肤干细胞中UV诱导衰老的保护作用。使用模拟皮肤环境的生物反应器，我们评估了蜂蜜对干细胞维持、ECM产生和细胞衰老机制的影响。具体来说，我们分析了参与干性和自我更新的关键基因，如Oct4和Sox2，以及与细胞增殖和分化相关的Wnt信号通路基因(Wnt3a, Wnt5a)。我们还评估了蜂蜜的抗氧化特性，测量了细胞中一氧化氮(NO)的产生和总抗氧化能力(TAC)。本研究的目的是探索天然化合物在保护皮肤健康和减轻衰老方面的潜力，为开发创新治疗方法做出贡献。
2. 材料和方法
2.1. 干细胞分离、培养和其他细胞类型的制备
人皮肤干细胞(SSCs)是从获得伦理委员会批准(伦理许可编号0059862, 2017年9月21日-国家研究委员会伦理委员会)的成年男性和女性患者的活检样本中获取的。收集的样本按照先前发表的方案进行机械分离和培养[24]。人皮肤成纤维细胞1(HFF1)和人皮肤角质形成细胞(HaCaT)购自ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并在含10%胎牛血清(FBS)(Life Technologies, 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)、2 mM L-谷氨酰胺(Euroclone, 意大利米兰)和1%青霉素/链霉素(Euroclone, 意大利米兰)的低糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Life Technologies, 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中培养[25]。
2.2. 蜂蜜制备
通过将蜂蜜溶解在DMEM中以达到10% w/v的浓度来制备蜂蜜溶液。在精密天平上称取1克蜂蜜，溶解在10 mL DMEM中，装入15 mL无菌锥形管。每次实验前，使用公式M1 × V1 = M2 × V2从主储备溶液制备不同浓度的蜂蜜溶液。
2.3. 植物化学化合物UHPLC-Orbitrap®-HRMS分析
原始蜂蜜于2022年秋季直接从土耳其东部安纳托利亚地区的养蜂人处收获。蜂蜜储存在室温(20-25°C)下，确保其免受光照。使用UHPLC-Orbitrap® HRMS(Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)在正离子和负离子化模式下进行植物化学分析。色谱分离在3C18-EB (COSMOSIL, 100 × 2 mm)柱上使用甲醇-水(0.5%乙酸)梯度进行。样品制备和仪器设置遵循与先前描述相同的方案[26,27]。分析由外部认证实验室服务执行。同时，在安卡拉食品控制实验室局(报告编号: 2400415684/00)，一个ISO/IEC 17025认证设施，分析了理化参数和糖谱。根据官方结果，蜂蜜的脯氨酸含量为943.8 mg/kg，显著高于欧洲(IHC)最低要求180 mg/kg[28]和土耳其食品法典(300 mg/kg)。总转化糖(果糖+葡萄糖)为71.5%，果糖与葡萄糖的比例为1.3。此外，C4糖含量低至1.0%，未检测到蔗糖/麦芽糖，证实了样品的高纯度。
2.4. 蜂蜜对HFF1细胞和SSCs的细胞毒性效应
使用MTT法进行细胞毒性分析。在96孔板中以每孔5000个细胞的密度接种HFF1和SSCs。将96孔板中的孔分组，细胞用浓度范围为0.02%至4% w/v的蜂蜜溶液处理24和48小时。在培养期结束时，去除蜂蜜溶液，向每个孔中加入100 µL MTT溶液(5 mg/mL PBS)，在37°C下培养2小时。培养后，加入100 µL DMSO溶解形成的甲臜晶体。使用微孔板读数器(Akribis Scientific, 英国克纳奇福德WA16 0JG)在570 nm处测量吸光度。根据MTT结果，确定了蜂蜜的最佳时间间隔和浓度。
2.5. 生物反应器设置和细胞培养条件
生物反应器是一种技术，它可以通过连续的流体流动使不同细胞类型的单独培养成为可能，同时确保细胞环境的混合。为了复制皮肤层，细胞在使用Live Box2 (IVTech, 意大利比萨)室的动态流生物反应器中培养。
如表1所示，将每种细胞类型样本分为若干组，并在不同时间进行每组实验。使用自动细胞计数器(LUNA, Logos biosystems, 韩国京畿道)计数细胞，并根据人体皮肤组织的等距比例接种。在生物反应器的室中种植80,000个HaCaT、40,000个HFF1和10,000个SSCs(图1)。允许它们附着在室中24小时。24小时后，生物反应器的室相互连接，培养基通过连接管流动(图2)。角质形成细胞用于在动态培养系统内建立生理上更相关的微环境，该系统更准确地模拟了皮肤的体内细胞组织。
细胞通过连接室和0.45 µm膜(ipCELLCULTURE™, it4ip, 比利时奥特尼-卢万拉内夫)相互关联培养。蠕动泵[25]连接各室。将培养基的流速调整为0.1 mL/min后，细胞在培养中放置48小时。
在拆卸生物反应器设置后，将预处理(紫外线+蜂蜜)和未处理(紫外线C)1%蜂蜜48小时的细胞所在的室，直接暴露在波长范围为280至320 nm的紫外线灯下，距离10 cm，持续2-3分钟。
2.6. 基因表达分析
对于基因表达研究，从上述条件下培养的每组细胞中提取RNA。我们随后分析了SSCs和HFF1细胞中干性(Oct4, Sox2, Bmi1, TERT)、细胞周期(p16, p21, p53)、细胞外基质(HAS2, Hsp70, CASP8)和Wnt信号相关基因(Wnt3a, Wnt5a, Wnt7b, Wnt16, β-catenin, Dvl1, Dvl2, Dvl3, Axin1, Axin2, APC, GSK3β)的表达水平，为它们在干细胞功能、细胞外基质调节和细胞衰老中的作用提供见解(表2)。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, 德国希尔登)根据制造商的方案，从表1中所示组(C, UvC, 和H + Uv)的细胞团中分离总mRNA。使用Nanodrop (Thermo Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)通过OD 260/280 nm测量RNA的量和纯度。为了检测基因表达水平，使用Luna One-Step RT-qPCR试剂盒(Euroclone, 意大利米兰)在实时PCR (RT-qPCR)设备(Bio-Rad, 美国加利福尼亚州赫库莱斯)上将每个样品一式三份扩增。将得到的Ct(阈值周期)值使用GAPDH作为参考基因进行标准化，并将mRNA水平表示为与未处理对照(C)相比的倍数变化(2−∆∆Ct)。
2.7. 亚硝酸盐定量
为了测试不同培养条件下细胞NO产生的变化，使用Griess试剂硝酸盐测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific, 美国)。简要地，将20 μL Griess试剂加入96孔板中含150 μL硝酸盐的样品中，并根据制造商的方案在室温下孵育30分钟。使用微孔板读数器(Akribis Scientific, 英国巴罗)在548 nm波长下读取硝酸盐浓度，作为含硝酸盐样品的吸光度。分析相对于光度参考样品。
2.8. 总抗氧化能力
使用总抗氧化能力比色测定试剂盒(Abcam, 英国剑桥)测量抗氧化蛋白。收集上述条件下培养的每个样品的细胞培养基。根据制造商的方案，将100 μL Cu2+工作溶液加入所有标准品和样品孔中，并在轨道摇床上室温孵育90分钟，避免光照。使用微孔板读数器(Akribis Scientific, 英国)在OD 570 nm处读取吸光度。样品总抗氧化能力计算为：(Ts/Sv) * D，其中Ts = 从标准曲线计算的样品孔中TAC量(nmol)；Sv = 加入样品孔的样品体积(μL)；D = 样品稀释因子。
2.9. 统计分析
本研究的统计分析使用GraphPad Prism 9.3.0软件进行。每个处理进行两次实验，每次有三个技术重复。对三个不同的样本组进行了双向ANOVA，得到了统计学上显著的结果(p < 0.05)。
3. 结果
3.1. 蜂蜜对SSCs的细胞毒性效应
我们观察到，在24和48小时用蜂蜜处理后，对每个分析浓度的干细胞均未观察到细胞毒性效应，细胞活力普遍提高(图3)。1%浓度的蜂蜜显著上调了干细胞代谢活性。因此，后续实验使用此1%浓度的蜂蜜。
3.2. 蜂蜜对HFF1的细胞毒性效应
我们观察到，在24和48小时用蜂蜜处理后，对每个分析浓度的HFF1均未观察到细胞毒性效应，细胞活力普遍提高(图4)。根据干细胞的MTT结果，选定的1%浓度显示HFF1活力显著增加，因此被选用于后续实验。
3.3. SSCs和HFF1细胞的基因表达分析
3.3.1. 干细胞和细胞周期相关基因的基因表达分析
RT-qPCR结果显示，与UvC相比，H + Uv SSCs中干细胞相关基因Oct4、Sox2和TERT的表达显著增加(p < 0.05)，而Bmi1表达显著降低(图5)。与C相比，UvC中干细胞相关基因的表达显著增加。与C相比，UvC显示所有衰老和细胞周期相关基因的表达显著增加。与UvC相比，H + Uv中p16、p21和p53(衰老和细胞周期相关基因)的表达显著降低。
3.3.2. 干细胞中Wnt信号通路的基因表达分析
RT-qPCR结果显示，与UvC相比，H + Uv中Wnt3a、Wnt5a和Wnt7b的表达显著增加(图6)。Wnt16表达没有显著变化。与UvC相比，H + Uv中β-catenin的表达显著降低。与C相比，UvC中除Wnt16和β-catenin外的其他Wnt基因表达显著降低。在UvC中，Dvl1基因表达与C相比显著增加，而Dvl2表达降低。H + Uv SSCs与UvC相比，Dvl1水平显著降低(p < 0.05)。与Dvl1相反，与UvC相比，H + Uv干细胞中Dvl3显示出显著增加。在UvC和H + Uv SSCs之间，Dvl2未观察到显著差异。关于降解复合物，与UvC相比，H + Uv显示Axin1表达显著降低，而它们也显示出GSK3表达的类似降低，尽管统计学上不显著。与UvC相比，H + Uv显示出Axin2和APC表达的显著增加。UvC显示出Axin和GSK3表达的显著增加，同时抑制了APC的表达。
3.3.3. HFF1中细胞外基质和应激相关基因的基因表达分析
RT-qPCR结果显示，与C相比，UvC HFF1中HAS2和Hsp70表达显著抑制(图7)。另一方面，与UvC相比，H + Uv HFF1中HAS2和Hsp70基因表达显著增加(p < 0.005)。与C相比，UvC显示出CASP8表达显著更高，而与UvC相比，H + Uv显示出其表达的显著降低。
3.3.4. HFF1中Wnt信号通路的基因表达分析
RT-qPCR结果显示，与UvC相比，H + Uv中Wnt3a和Wnt5a表达显著更高(图8)。另一方面，HFF1细胞中Wnt7b、Wnt16和β-catenin表达较低。与C相比，UvC显示出β-catenin、Wnt7b和Wnt16表达的显著增加，同时抑制Wnt3a和Wnt5a表达。在UvC中，HFF1细胞中Dvl1表达与C相比显著降低，而Dvl2表达增加。在H + Uv中，Dvl1和Dvl3表达显著增加，而Dvl2表达与UvC相比显著降低。与C相比，UvC中降解复合物基因的表达显著降低。在H + Uv中，Axin2、APC和GSK3β表达与UvC相比显著增加。与其他基因相反，Axin1表达在H + Uv中与UvC相比降低。
3.4. UHPLC-Orbitrap®-HRMS对蜂蜜植物化学特征的分析
UHPLC-Orbitrap®-HRMS分析显示，所检查的蜂蜜样品特别富含酚酸和黄酮类。在酚酸中，4-羟基苯甲酸(879.35-1075.68 ng/g)、丁香酸(216.90-536.78 ng/g)和咖啡酸(290.87-312.20 ng/g)的浓度相对较高。关于黄酮类，乙酰丙嗪(19,292.94 ng/g)、松属素(479.94 ng/g)和黄岑素(441.12 ng/g)最为丰富。这些化合物的存在突显了它们对蜂蜜抗氧化潜力的主要贡献32-38。
在本研究中重新分析了蜂蜜样品，以确认先前报告数据的可重复性和可靠性。某些化合物在一个分析中出现但在另一个分析中未出现，或以不同的浓度水平存在。这种差异可能是由于样品制备的差异、仪器灵敏度的变化或随时间推移蜂蜜基质的自然变化所致。然而，总体植物化学特征在两次分析中保持一致，支持了研究结果的可靠性。对于某些关键酚类化合物，包括乙酰丙嗪，由于缺乏分析标准，在当前分析中定量确认有限；因此，包括了先前对相同蜂蜜样品分析的数据作为参考。尽管两次分析之间观察到定量差异，但它们的潜在生物影响未直接评估，并且在本研究范围内未改变结果的解释。
3.5. SSCs中的抗氧化活性
评估了在上述条件下培养的SSCs中的NO浓度(图9A)和TAC(图9B)。结果显示，(H + Uv) SSCs与UvC相比NO水平降低，表明预处理调节了NO的酶合成，增强了细胞抗氧化能力。TAC测定证实了这些发现，显示H + Uv SSCs与UvC相比总抗氧化能力显著增加，改善了细胞对UV暴露引起的氧化应激的反应。
4. 讨论
皮肤完整性通过驻留干细胞的再生能力和真皮细胞外基质(ECM)提供的结构支持之间的复杂相互作用来维持。紫外线(UV)辐射是一种关键的外部应激因素，通过诱导DNA损伤和氧化应激以及破坏干细胞生态位来加速皮肤衰老[4]。在本研究中，使用动态生物反应器模型调查了东部安纳托利亚多花蜂蜜的保护作用，该模型与静态培养相比提供了生理上更相关的环境。
近年来，天然化学物质，特别是富含多酚的物质如蜂蜜，已被广泛用于预防UV诱导的光损伤。蜂蜜是一种复杂的溶液，包含转化糖、酚酸、黄酮类和许多生物活性成分，表现出强大的抗氧化和抗炎活性[39,40]。先前研究表明，蜂蜜衍生的植物化学物质可以调节衰老的基本分子通路[7-11]。如乙酰丙嗪、松属素、黄岑素、丁香酸和咖啡酸等化合物已被报道可以激活干细胞相关信号(Oct4/Sox2, Wnt/β-catenin)，刺激与长寿相关的酶(去乙酰化酶)，并减轻氧化应激和DNA损伤。同时，它们下调衰老相关效应物，包括p16、p21和p53，从而将其皮肤保护特性与更广泛的抗衰老机制联系起来[10,11]。除了这些广义的抗衰老过程(表4)外，蜂蜜植物化学物质还在皮肤细胞中诱导强大的保护作用(表5)。具体来说，它们抑制UV诱导的胶原分解，激活细胞内抗氧化防御(例如SIRT3, Nrf2)，抑制炎症介质(NF-κB, NLRP3, MMPs)，并诱导胶原形成和生长因子信号传导，总体提供抗衰老和再生皮肤终点[41]。本研究评估了蜂蜜对暴露于UV下的SSCs和成纤维细胞的保护作用，使用模拟体内环境的动态培养技术。
已知具有抗氧化和抗炎特性的塔拉蜂蜜已被证明可抑制皮肤细胞中UV诱导的DNA损伤并抑制p65[42]，这是细胞周期蛋白E表达的重要因素[43]。在本研究中，使用代表皮肤再生(SSCs)和结构(HFF1成纤维细胞)完整性的两种关键细胞群，进一步表征UV诱导的衰老反应和蜂蜜的保护作用。在SSCs中，蜂蜜预处理显著增加了关键干性基因Oct4、Sox2和TERT的表达，这些基因对多能性和自我更新至关重要。同时，蜂蜜直接干预细胞衰老的分子通路，抑制UV诱导的衰老标志物p16、p21和p53的激活。尽管Bmi1和Wnt信号通路在干细胞保护和衰老中的作用在文献中已有广泛描述[21,22]，但本研究获得的发现表明，蜂蜜以情境特异性方式调节这些通路，支持在应激条件下维持干细胞功能，而不是广泛的增殖激活。
Wnt信号通路成分的分析支持这一解释。UV暴露破坏了Wnt配体和β-catenin之间的平衡(图6)[44-46]，而蜂蜜应用与某些Wnt配体(主要是Wnt3a)表达的部分恢复以及β-catenin积累的限制相关。这种调节与在衰老组织中维持再生和基因组稳定性的需要一致。
相比之下，在HFF1成纤维细胞中，UV暴露通常导致ECM变性和成纤维细胞凋亡[47]。这通过我们UV对照组中HAS2和Hsp70的减少以及CASP8的增加得到证实(图7)。蜂蜜预处理有效地逆转了这些影响，增加了HAS2表达(表明透明质酸产生增加)并提高了Hsp70水平(支持蛋白质稳态和DNA修复)[23]。CASP8的抑制表明外部凋亡信号减少并维持真皮框架(图7)。
动态系统的使用使我们能够在同一环境中同时评估这些细胞类型特异性反应。0.1 mL/min的连续流速支持HaCaT(表皮屏障模拟)、SSC和HFF1室之间培养基和潜在信号分子的交换。观察到的整体"抗衰老"效应(SSCs中再生能力的保留和HFF1中支持性生态位的维持)可能与动态模型提供的协调细胞反应相关。
蜂蜜的生物活性可能与其独特的植物化学特征相关，其中含有高浓度的乙酰丙嗪(19,292.94 ng/g)、松属素和咖啡酸(表3)，以及高脯氨酸含量(943.8 mg/kg)。在此背景下，研究中观察到的"成分-靶点-表型"关系在Wnt信号通路中属于某些成分的特别值得注意。观察到UV辐射通过减少配体(Wnt3a和Wnt5a)的表达并破坏信号平衡对Wnt通路调节产生负面影响(图6和图8)。蜂蜜应用后，我们观察到这些配体的表达被部分保留，并且可以观察到恢复通路平衡的趋势以及Axin2和APC等调节成分表达的变化(图6)。Wnt/β-catenin轴的这种受控调节表明，蜂蜜衍生的酚类化合物可能有助于减轻细胞衰老反应并支持更新过程。然而，根据当前数据，无法将这种效应归因于单一化合物或单一通路机制。此外，蜂蜜显著调节了TAC水平并降低了NO产生(图9)，增强了抗氧化防御。
这些发现表明，蜂蜜对Wnt信号通路激活的影响根据损伤类型和生物背景进行精细调节。虽然Wnt信号通路在急性组织修复背景下的治疗潜力已得到充分确立[44-46,48]，但其在皮肤衰老过程中的作用需要更精细和稳态的调节[17]。最近关于生物活性肽(如RL-QN15)的研究表明，FZD8-β-catenin轴的强烈激活支持伤口再生[49]。类似地，整合素激动剂FZ1已被报道通过增强血管生成和组织修复来促进愈合过程[50]。然而，在与衰老相关的慢性UV暴露中，过度或不受控制的Wnt激活可能会不利地影响干细胞功能并增加异常增殖的风险[13,20,51]。
我们的结果表明，多花蜂蜜的效果可以被视为调节性调节，而不仅仅是Wnt激活。与伤口愈合模型中观察到的急性激活不同，蜂蜜预处理产生了部分保留Wnt配体(Wnt3a, Wnt5a)表达的反应谱，同时增加了降解复合物成分(Axin2和APC)的水平以及平衡的β-catenin水平。
5. 结论
总之，我们的研究结果表明，蜂蜜处理通过上调多能性相关基因Oct4和Sox2显著维持细胞稳态，Oct4和Sox2是再生潜力的关键调节因子。此外，Wnt3a信号通路的激活在介导组织修复中起关键作用，而Hsp70表达的增加为抵抗应激提供了强大的防御。这些整合的通路共同构成了蜂蜜细胞保护特性的机制基础，为其在再生医学中的应用铺平了道路。
局限性
本研究的一个重要局限性是，尽管动态系统允许通过连续培养基流动进行旁分泌串扰，但不同细胞类型(SSCs和HFF1)之间的细胞间通信并未被特别研究或量化。我们目前的研究结果集中在共享动态环境中细胞类型特异性的分子反应上。未来的研究需要利用分泌组分析或代谢分析来充分阐明这种动态共培养设置所促进的协同效应和信号通路。虽然通过调节关键分子标志物(p16, p21和p53)验证了细胞衰老，但未进行功能性测定，如SA-β-gal染色。我们承认这是一个局限性；因此，未来的研究将包括这些表型评估，以补充我们在当前动态模型中观察到的分子保护效应。
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