体外三维人工皮肤模型（3D-HSMs）在药物测试、疾病建模和化妆品评估领域带来了革命性突破。然而，在长期培养过程中保持3D-HSM的稳定性和质量仍然是一个挑战。本研究基于先前关于低分子量岩藻多糖（LMW-F）对成纤维细胞抗增殖作用的研究，开发了含有LMW-F的生长和分化培养基，以延长3D-HSM的保质期。
我们设计了两种特定类型的培养基，均添加了LMW-F成分：（1）生长培养基（DFR-GM），由DMEM（低葡萄糖）、Ham’s F-12 K和RPMI 1640按2:2:1比例精确混合而成，分为含LMW-F（LMW-F-DFR-GM）和不含LMW-F（con-DFR-GM）两组；（2）分化培养基（DFR-DM），成分与DFR-GM相同，但额外添加了CaCl2，同样分为含LMW-F（LMW-F-DFR-DM）和不含LMW-F（con-DFR-DM）两组。利用这些培养基对基于人体细胞的3D全层皮肤等效模型（3D-FT-HSEM）进行了28天的培养实验。
与对照组相比，使用含LMW-F培养基的3D-FT-HSEM在直径上减少了47%，厚度保留了25%（而对照组直径减少94%，厚度几乎完全降解）。此外，Ki67增殖标志物的表达在第21天增加了约20%，同时细胞死亡显著减少。总体而言，该研究表明LMW-F-DFR-DM不仅能增强3D-FT-HSEM的稳定性，还能延缓表皮分化的进程，从而提高整体质量。
为了进一步验证LMW-F-DFR-DM的效果，我们通过免疫组化染色（IHC）、HE染色和Masson三色染色分析了组织学特征和功能健康状况。结果表明，LMW-F-DFR-DM使表皮厚度在第7天增加了三倍，并在第28天仍保持结构完整性。此外，LMW-F-DFR-DM显著减缓了真皮层厚度的下降速度，并抑制了胶原蛋白支架的降解。IHC染色显示，LMW-F-DFR-DM组中的K10和兜甲蛋白表达较慢，而Ki67表达则持续较高，表明该培养基促进了细胞增殖和表皮再生。
Western blot分析进一步揭示了LMW-F-DFR-DM对分化、功能和凋亡相关生物标志物的影响。例如，与对照组相比，LMW-F-DFR-DM组的K14表达更稳定，LC3和p53水平较低，而α-SMA和纤连蛋白的表达则显著增加。此外，与细胞凋亡相关的PARP和裂解型caspase-3在对照组中显著升高，但在LMW-F-DFR-DM组中维持较低水平。这些数据表明，LMW-F-DFR-DM可能通过调控生物标志物来支持3D-FT-HSEM的长期培养。
在单细胞转录组测序分析中，我们发现LMW-F-DFR-DM处理组的HaCaT和CCD-986sk细胞中有562个差异表达基因（DEGs）。GO富集分析显示，这些基因主要涉及凋亡过程、细胞周期、胶原结合、细胞迁移、细胞外基质、炎症反应、血管生成、自噬、表皮发育和溶酶体代谢等功能。火山图显示，LMW-F-DFR-DM显著改变了多个基因的表达模式，其中clusterin、decorin和LRP1基因的表达下调，这与Western blot结果一致。
讨论部分指出，LMW-F是一种来源于褐藻的硫酸化多糖衍生物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗糖尿病等多种生物学特性。我们的研究表明，LMW-F-DFR-DM不仅能够抑制成纤维细胞的增殖和衰老，还能减缓表皮细胞的分化速度，从而延长3D-FT-HSEM的保质期。这一发现为开发低成本、高效的体外皮肤模型提供了新思路，有助于替代动物实验并推动皮肤组织工程的发展。
材料与方法部分详细描述了3D-FT-HSEM的制备过程、培养条件以及相关实验技术，包括活死染色、β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术分析和免疫荧光染色等。
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