衰老显著影响人体免疫系统的功能，增加了对免疫介导疾病易感性的风险。虽然基因表达程序准确反映了免疫功能，但它们与生物免疫衰老和健康状况之间的关系仍不清楚。在这项研究中，我们利用1,081名年龄在18至97岁之间的健康个体的单细胞RNA测序数据，为循环血液中的髓系和淋巴系免疫细胞群体开发了稳健的、细胞类型特异性的衰老时钟（sc-ImmuAging）。将sc-ImmuAging应用于COVID-19患者的转录组数据，发现单核细胞在感染后表现出显著的年龄加速，在恢复期间有所下降。此外，还发现了疫苗接种引起的个体间免疫衰老差异，基线干扰素反应基因表达水平较高的个体在BCG疫苗接种后CD8+ T细胞显示出年龄逆转。sc-ImmuAging提供了一个强大的工具来解码免疫衰老动态，提供了关于与年龄相关的免疫改变及其潜在干预措施以促进健康老龄化的见解。
为了验证我们的标记基因，我们将它们与之前报道的人类全血衰老相关基因进行了比较。在共享的标记基因中，相当一部分在不同细胞类型中表现出相同的方向，尤其是在CD4+ T细胞（75%）和CD8+ T细胞（62%）中。进一步检查鉴定出的标记基因随年龄变化的表达轨迹，支持了我们的发现，显示了相应细胞类型中标记基因预期的年龄依赖性表达模式。例如，CD4+ T细胞中的标记基因CAMK4因其在免疫反应和炎症中的作用而闻名，其表达动态与先前报告一致。同样，B细胞衰老时钟的顶级标记基因MACROD2在B细胞中表现出增加的衰老依赖性表达，被认为是老化相关B细胞的重要特征。这些结果强调了建立细胞类型特异性衰老时钟的重要性，并验证了我们选择的标记基因的准确性。
接下来，我们应用sc-ImmuAging来研究感染期间和之后单细胞水平上的免疫衰老改变。使用来自四个独立队列的COVID-19患者的单细胞转录组数据，我们首先估计了转录组年龄改变（TAA），定义为患者与同龄对照组之间的预测年龄差。分析显示，感染导致所有免疫细胞类型的转录组年龄加速（TAA > 0），尤其是在重症COVID-19患者中。值得注意的是，单核细胞在所有队列中表现出最强且最一致的年龄加速。鉴于这些发现，我们专注于单核细胞，并比较了同龄对照组、轻症和重症患者的TAA。观察到所有COVID-19患者的单核细胞均出现年龄加速，重症患者的加速程度高于轻症患者。
为了探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染导致的年龄加速背后的生物学途径，我们对既是标记基因又在患者中差异表达的基因进行了富集分析。发现在轻症COVID-19患者中，通过核因子-κB（NF-κB）的TNF信号通路上调，这与感染后的验证激活一致。重症COVID-19患者表现出促炎细胞因子浓度升高，这通常伴随着对二次刺激的不良反应，与观察到的白细胞介素信号通路的上调一致。此外，轻症和重症COVID-19患者中上调的基因都富含凋亡途径，提示这些上调可能有助于衰老加速。重症COVID-19患者中下调的I型干扰素信号通路证实了先前关于重症病例中I型干扰素生成受抑制的报道。
进一步的Pearson相关性分析显示，世界卫生组织（WHO）严重程度评分与TAA之间存在显著正相关（P = 6.66 × 10^-6；图4d）。将sc-ImmuAging应用于两个独立的时间序列COVID-19队列，发现症状开始消退后的几天内单核细胞的年龄加速减少（图4e）。这一模式在另一个长期COVID队列的单核细胞数据集中得到了复制，其中TAA在急性期最高，并随时间逐渐下降。大多数样本即使在感染开始后90天仍表现出年龄加速，可能是由于长期COVID对免疫系统的影响，因为这些患者均表现出肺功能障碍（图4f）。
总之，我们将sc-ImmuAging应用于COVID-19患者，发现单核细胞中显著的衰老加速，并进一步识别了参与COVID-19发病机制的相关途径。观察到的年龄改变随着时间的推移逐渐减少，表明生物年龄正在逐渐恢复到健康状态。
接下来，我们使用sc-ImmuAging研究了BCG疫苗接种前后免疫细胞的衰老时钟动态。分析显示，BCG诱导的TAA在各种免疫细胞中存在显著的个体间变异（图5a），一些个体表现出加速（AA）或逆转（AR）的TAA。值得注意的是，我们发现CD8+ T细胞中的BCG诱导TAA与疫苗效力之间存在显著负相关（Pearson相关系数=-0.4，P = 0.025；图5b）。疫苗效力通过BCG疫苗接种前后结核分枝杆菌刺激下的IFNγ生成倍数变化来衡量，这是BCG效力的一个公认标志。这些发现与之前的研究一致，表明CD8+ T细胞在BCG诱导的生物学过程中活跃参与。
为了探究BCG诱导的转录组年龄改变背后的生物学途径，我们对CD8+ T细胞中同时作为转录组衰老时钟标记基因和差异表达基因（DEGs）的基因进行了富集分析。分析显示，能量相关途径如氧化磷酸化在TAA降低组中下调，这与之前的研究所示BCG给药后氧化磷酸化减少相一致，表明细胞代谢的重置。相反，细胞毒性相关途径在TAA增加组中上调，这可能表明这些途径对相对较差的疫苗反应有贡献（图5c）。
为了更深入地了解BCG疫苗接种后AR组和AA组之间的差异，我们系统地分析了每个组中CD8+ T细胞的表达动态。我们的研究表明，AR组的个体在疫苗接种前表现出更高的抗病毒和IFN反应基因表达水平，而在AA组中则没有这种现象（图5d）。BCG疫苗接种后，这些基因在AR组中显著下调，可能导致疫苗接种后转录组年龄的逆转。相比之下，AA组的个体在BCG疫苗接种后表现出明显的细胞毒性相关基因上调，而在AR组中这些基因仍然低表达。这一观察结果通过基于差异表达基因的富集分析进一步得到确认（图5e,f）。
为了进一步验证AA组中更高的细胞毒性，我们测试了CD8+终末分化效应记忆T细胞重新表达CD45RA（TEMRA）的比例倍数变化是否与TAA相关。我们发现存在显著正相关（P = 0.0074），表明表现出年龄加速的个体在BCG疫苗接种后CD8+ TEMRA细胞比例增加。这一发现与AA组CD8+ T细胞中细胞毒性途径表达水平升高的情况一致。
我们的后续目标是确定潜在调控疫苗诱导TAA变化的转录因子。通过转录因子富集分析，我们在AR组中发现了IRF7与其IFN反应基因之间的独特关联，突显了IRF7的关键作用（图5g）。许多经过BCG疫苗接种后下调的IFN途径基因受到IRF7的控制，可能有助于观察到的年龄逆转。相反，在AA组中，我们观察到BCG疫苗接种后IRF7及其预测靶点的上调。进一步检查AA组中的基因调控网络，发现IRF1是调控细胞毒性基因的主要转录因子（图5h）。值得注意的是，先前的研究已经强调了IRF1在诱导T细胞细胞毒性中的重要性。同时，我们观察到AR组在疫苗接种后IRF1及其靶基因下调。
如图5i所示，根据我们的衰老时钟计算的年龄改变（即TAA），BCG疫苗接种后个体可以分为AA组和AR组。在AR组中，BCG给药导致IRF7依赖的IFN反应基因表达水平下降，同时IRF1依赖的细胞毒性基因下调。相反，AA组的模式则相反，表现为高IRF1依赖的细胞毒性基因。这些发现揭示了BCG给药后年龄改变背后的复杂调控机制，IRF7和IRF1分别在调节IFN反应和细胞毒性中发挥不同的作用，可能对TAA的不同结果有贡献。
为了验证这些发现，我们使用了来自九名个体在接受MMR疫苗或安慰剂前后的单细胞RNA测序数据进行了类似的分析。在安慰剂接种组中，正如预期的那样，我们没有观察到任何显著的年龄改变，从而确认了sc-ImmuAging的有效性（扩展数据图4a）。比较CD8+ T细胞在MMR疫苗接种前后的预测年龄，我们发现4名个体中有3名表现出较低的TAA，相当于免疫年龄逆转（扩展数据图4b）。值得注意的是，我们观察到MMR疫苗接种后IFN反应基因的表达水平显著下降（扩展数据图4c和方法），这与BCG诱导的AR组的结果相似。
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