摘要
循环血液中存在的极小胚胎样/上胚层样干细胞（VSELs）是一种小型非造血细胞，表达多能胚胎和原始生殖细胞的标记物。VSELs被认为有助于出生后组织和器官再生。我们报告了在儿科患者中对生长激素（GH）治疗反应的首次长期观察。对20名年龄在5.2-13.4岁之间的GH缺乏患者，在GH治疗的第一年内定期进行监测。其中8名患者在连续治疗八年后续进行了复查。使用流式细胞术分析外周血中选定的干细胞群体。长期GH治疗导致CD34+ VSELs数量增加，而CD133+ VSELs保持与基线相当。VSELs的增加伴随着循环造血干细胞、间充质基质细胞（MSCs）和内皮祖细胞的平行增加。我们观察到VSELs与MSCs之间，以及CD34+ VSELs和MSCs与餐后血糖水平之间存在显著的正相关。这些数据表明VSELs对GH治疗有反应。长期GH治疗似乎可以调节VSEL群体而不造成伤害，甚至可能增强GH缺乏患者的VSELs。与实验动物的研究结果不同，人类的GH治疗并未显示出对寿命或器官功能的不良影响。
引言
目前，生长激素（GH）对衰老和预期寿命的影响仍然存在争议。GH除了对生长的直接影响外，还提供多种益处，包括提高运动表现、骨密度和肌肉质量，以及减少体脂。这些效果使GH在抗衰老医学中受到关注。事实上，由于GH-1基因缺失导致的遗传性未经治疗的生长激素缺乏（GHD）患者观察到显著缩短的寿命。然而，其他数据表明未经治疗的GHD不会影响人类的寿命。
临床观察显示，高水平的GH可能加速衰老并增加心血管疾病风险。由于GH过量导致的未治疗巨人症患者，其预期寿命显著短于健康人群，主要是由于代谢并发症和癌症风险增加。相反，长期GHD与健康状况下降、焦虑和/或抑郁、能量水平降低、体脂增加和胰岛素抵抗相关，可能导致2型糖尿病。它还与肌肉张力降低、骨密度下降导致骨质疏松，以及低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平升高相关，所有这些都导致心血管风险增加。普拉德-威利综合征患者和慢性肾病患者不仅在重组人GH（rhGH）治疗期间表现出成人最终身高显著改善，还显示出多种代谢益处。此外，临床观察表明，长期rhGH治疗与致癌或 cardiometabolic 障碍风险增加无关，即使是在接受过肿瘤治疗的患者中也是如此。
GH参与衰老的机制可能包括GH/胰岛素/胰岛素样生长因子-1（GH/INS/IGF-1）信号对极小胚胎样/上胚层样干细胞（VSELs）的作用。VSELs存在于小鼠和人类骨髓及其他组织中，是表达多能胚胎和原始生殖细胞标记物的细胞，被认为在衰老和器官再生中发挥潜在作用。这些独特的细胞略小于红细胞，(1)在应激情况下动员到外周血中，(2)在小鼠中以Sca1+ Lin-CD45-细胞群和在人类中以(CD133+/CD34+)Lin-CD45-细胞群的形式存在，(3)表达多能干细胞标记物（如Oct-4、Nanog和SSEA），表征比骨髓来源的间充质基质细胞（MSCs）分化程度更低的细胞，(4)具有特定形态，核质比高且染色质恒定。VSELs被认为是长期再生造血干细胞（HSCs）、间充质基质细胞（MSCs）和内皮祖细胞（EPCs）的前体。这些细胞在成人组织中的数量与预期寿命呈正相关。VSELs被视为成人组织承诺干细胞（TCSCs）的备份群体。因此，VSELs被认为负责组织和器官的再生，合理假设它们的强度和整体状态影响预期寿命。内源性多能VSELs的潜力为对抗组织损伤、癌症和衰老的三方面策略提供了有希望的方法。然而，动物模型的初步观察表明，它们的数量可能在长期给予GH或IGF-1后减少。这些观察引起了对接受rhGH治疗的患者未来的担忧。此外，众所周知，长期高剂量GH替代会降低胰岛素敏感性并加剧胰岛素抵抗。VSEL计数已被证明与寿命相关。此外，限制热量摄入、定期锻炼和改善胰岛素敏感性的二甲双胍对在成人组织中维持VSELs有积极影响。
因此，本研究旨在调查重组人GH（rhGH）治疗对周围血液中循环干细胞群体的影响及其与代谢参数的相关性。基于长期临床观察，我们假设rhGH治疗不会对接受这种必要替代治疗的GH缺乏儿科患者的干细胞池或代谢结果产生负面影响。
方法
患者
我们在2014年对20名符合国家rhGH治疗资格标准的孤立性特发性GHD连续患者进行了队列研究。患者年龄在5.04-13.37岁之间（平均±SD，9.1±2.7岁）。在rhGH治疗前，患者身高的平均标准差（SD）为−3.35±0.75。平均rhGH剂量为0.27 mg/kg/周。
该研究获得了当地伦理委员会的批准（编号KBET/14/B/2014，2014年2月27日和编号1072.6120.114.2022，2022年8月31日）。所有研究均按照相关法规和《赫尔辛基宣言》进行。从所有参与者和/或其法定监护人处获得了书面知情同意。
在rhGH治疗前采集空腹血液样本，测量全血细胞计数和目标参数。随后在2周、1个月、3个月和6个月后采集随访样本。我们评估了循环小细胞数量的波动，包括极小胚胎样干细胞（VSELs；CD133+ Lin− CD45−和CD34+ Lin− CD45−）、造血干细胞（HSCs；CD133+ Lin− CD45+和CD34+ Lin− CD45+）、间充质基质细胞（MSCs）和内皮祖细胞（EPCs）。
在rhGH治疗前以及3个月和6个月时测量血清胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平。治疗开始一年后，测量口服葡萄糖耐量试验（OGTT）期间的血清IGF-1、葡萄糖和胰岛素水平。八年后，我们对继续接受rhGH治疗的八名患者重复了分析。此时，这些患者的平均年龄为14.1±1.1岁。其余12名患者已根据国家项目标准完成治疗。在仍在接受治疗的八名患者中，分析了空腹血液样本的血细胞计数、VSELs、HSCs和EPCs。测量了血清IGF-1并进行了OGTT。
流式细胞术
外周血（PB）样本在室温下用BD Pharm Lyse缓冲液（BD Biosciences）进行双重裂解10分钟。裂解后，用含2%胎牛血清（FBS；Sigma Aldrich）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样本，获得总有核细胞（TNC）计数。TNCs在含2% FBS的PBS中在冰上染色30分钟，洗涤并重悬。流式细胞术分析在Navios流式细胞仪（Beckman Coulter）上进行，每样本至少获取1×10⁶个事件。对于每位患者，基于流式细胞术获得的百分比计算每1μL PB中极小胚胎样干细胞（VSELs）和白细胞（WBCs）的绝对数量。数据使用Kaluza软件（Beckman Coulter）分析。
循环干细胞和祖细胞分析
为了鉴定极小胚胎样干细胞（VSELs）和造血干细胞（HSCs），TNCs用针对造血谱系标记物（Lin：CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、CD235a；BD Biosciences）的异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗体混合物染色。同时，细胞用藻红蛋白（PE）偶联抗CD45抗体（克隆HI30，BD Biosciences）和别藻青蛋白（APC）偶联抗CD34（克隆581，BD Biosciences）或APC偶联抗CD133/1（Miltenyi Biotec）标记。VSELs被定义为Lin−/CD45−/CD34+或CD133+细胞。这些细胞非常小，直径通常小于6μm，在流式细胞术分析中仔细考虑其大小，使用前向散射（FSC）参数将它们与较大的造血细胞区分开，确保准确识别VSEL群体。HSCs被定义为Lin−/CD45+/CD34+或CD133+细胞。HSC通常比VSELs大，直径一般在8-12μm之间，这在流式细胞术分析中予以考虑。
内皮祖细胞（EPCs）被鉴定为CD34+/CD133+/KDR+，使用针对CD45（FITC，克隆HI3；BD Biosciences）、CD133（APC，克隆CD133/1；Miltenyi Biotec）、CD34（PE-Cy7，克隆4H11；BD Biosciences）和KDR/VEGFR2（PE，克隆89106；R&D Systems）的抗体。
间充质基质细胞（MSCs）被定义为CD45−/CD105+/CD90+/CD29+，使用针对CD45（FITC，克隆HI3；BD Biosciences）、CD105（APC，克隆43A3；BioLegend）、CD90（PE，克隆5E10；BioLegend）和CD29（PE，克隆MAR4；BD Biosciences）的抗体。
所有实验中均包含匹配的同种型对照：FITC-、PE-和APC-偶联小鼠IgG1（克隆MOPC-21，BD Biosciences）、IgG2a（克隆G155-178，BD Biosciences）、IgG2b（克隆27-35，BD Biosciences）和APC-偶联IgG1（克隆IS5-21F5，Miltenyi Biotec）。
抗体孵育在冰上进行30分钟，随后洗涤和重悬。样本在Navios流式细胞仪（Beckman Coulter）上分析，每样本≥1×10⁶个事件。数据使用Kaluza软件（Beckman Coulter）处理。
生化检测
使用Vitros 950（Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY, USA）测量血细胞计数。IGF-1和胰岛素通过免疫化学测量：IGF-1（Diasource，检测限8.8 ng/mL；批内精密度<9.8%，批间精密度<10.4%）和胰岛素（Siemens Diagnostics，检测限0.5 mU/L；批内精密度≤4.6%，批间精密度≤5.9%）。
统计分析
使用Staf Soft Statistica 12软件包进行统计分析。进行了方差分析（ANOVA）与事后Tukey检验，以及线性和多元回归分析。应用Spearman相关系数。我们假设p<0.05具有统计学意义。
结果
rhGH的给药对周围血液中极小胚胎样干细胞（VSELs）的数量有显著影响。在治疗的前三个月内，VSEL数量增加，随后在六个月时下降，达到低于基线的水平。有趣的是，在连续rhGH治疗八年后，VSEL数量再次增加。具体而言，长期治疗导致CD34+ VSEL计数高于基线，而CD133+ VSELs保持与基线值相当。
VSELs的增加伴随着循环间充质基质细胞（MSCs）和内皮祖细胞（EPCs）的平行变化。八年后，EPC数量与基线相当。虽然MSCs在长期观察中无法评估，但它们在六个月时相对于治疗前值有所下降。CD34+和CD133+ VSELs、HSCs、MSCs和EPCs的时间变化如图1和图2所示。
在统计分析中，发现CD34+ VSELs和CD133+ VSELs之间（r = 0.285, p = 0.01），CD34+ VSELs和CD34+ HSCs之间（r = 0.238, p = 0.03）以及CD133+ VSELs和CD133+ HSCs之间（r = 278, p = 0.01）存在显著的正相关。CD34+ HSCs和CD133+ HSCs之间也存在强烈的正相关（r = 0.87, p = 0.03）。我们发现VSELs和MSCs之间存在显著的正相关（CD34+ VSELs vs MSCs r = 0.33, p < 0.01；CD133+ VSELs vs MSCs r = 0.697, p < 0.01），但HSCs和MSCs之间没有相关性。
同时，我们在rhGH治疗期间观察到IGF-1水平的显著变化（p = 0.001）（表1）。治疗前IGF-1水平较低，平均SD值为−1.5±1.1，然后逐渐增加至六个月后的+0.3±2.0，以及一年治疗后的+1.6±2.1。在长期观察中，IGF-1水平仍处于正常范围内，rhGH治疗八年后平均SD为+1.2±1.0。我们在rhGH引入后三个月、六个月、一年和八年的IGF-1与VSELs、MSCs或EPCs水平之间没有发现任何相关性。
长期rhGH治疗还导致身高显著改善（p = 0.0001）（表1）。值得注意的是，身高SDs与CD34+ VSEL数量呈正相关（r = 0.53, p = 0.01），与CD133+ HSCs呈负相关（r = −0.49, p = 0.02）。这些发现表明VSELs在GH调节生长中起重要作用，而HSCs有助于身体尺寸的增加。
OGTT中的葡萄糖和胰岛素水平（空腹和餐后）以及HbA1c值在治疗一和八年时均保持在正常范围内（表2）。有趣的是，MSC数量与餐后葡萄糖水平呈正相关（r = 0.53, p = 0.02）。
讨论
我们首次证明，rhGH的长期治疗调节了GHD患者外周血中VSELs、HSCs、MSCs和EPCs的群体。
VSELs对GH治疗有动态反应：在rhGH治疗的第一个月内，其在外周血中的数量显著增加，随后在接下来的六个月内逐渐下降。重要的是，长期rhGH治疗不会减少循环VSEL水平；相反，似乎会增强它们。VSELs表达多能标记物，类似于多能干细胞。它们可以分化为所有三个胚层的细胞和生殖细胞。然而，与多能干细胞不同，VSELs不会整合到发育中的胚胎中，不会在SCID小鼠中形成畸胎瘤，在繁殖实验中也不会分裂和扩增，尽管一些最近的研究报告在这方面取得了有限的成功。VSELs已被60多个独立研究小组在多种成人组织中鉴定出来。相比之下，人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞仅作为组织培养的人工产物存在于体外，体内没有直接的生理对应物。尽管在这些细胞的使用方面取得了进展，但由于致癌风险、免疫原性和异质性，其应用仍然有限。诱导多能干细胞系表现出可变的分化潜力、基因组不稳定性和异常的表观遗传模式。VSELs具有维持其在体内处于休眠状态的独特特性，从而防止自发癌变。此外，最近的荟萃分析未提供证据表明GH替代治疗会增加儿童癌症幸存者的癌症相关死亡率。
一个特别有趣的支持我们数据的观察是VSELs和HSCs之间的显著正相关。VSELs在人类中表现出LIN– CD45– CD133+的表面表型，而HSCs表现出LIN– CD45+ CD133+，突显了这些群体之间的异质性。虽然CD34+ HSCs以前被认为是最早的造血干细胞，但最近的报告指出CD34– HSCs的存在，这重新定义了层级并将VSELs定位为最早的干细胞。LIN– CD45– CD34– CD133+ VSELs代表最具原始性的造血干细胞，具有再生多种组织类型的多能潜力。VSELs提供终身组织祖细胞的替代，并可以在体内被激活以再生受损器官，包括肺、胰腺、骨和子宫内膜上皮。此外，类似于自然的配子前体，VSELs可以在体外分化为卵细胞和精子。在体内应激条件下，VSELs可能进入细胞周期；然而，调节其休眠与增殖以及自我更新与分化的精确机制仍不清楚。同样，可靠诱导VSEL增殖和自我更新所需的体外条件也尚未建立。
考虑到观察到的循环VSELs数量增加可能反映了从骨髓中动员而不是细胞数量的实际增加。干细胞释放、动员和归巢是具有重要生理作用的连续过程。先前的研究已经确定了细胞因子如G-CSF和SCF，以及粘附分子包括VLA-4和P/E选择素在干细胞动员中的作用。最近来自实验动物模型和临床动员方案的证据突显了趋化因子如基质衍生因子-1（SDF-1）和IL-8，以及蛋白酶如弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和各种MMPs在动员过程中的参与。SDF-1的血浆升高已被证明可诱导成熟和不成熟造血祖细胞和干细胞的动员。有趣的是，据报道，与年龄匹配的健康对照组相比，GHD儿童的SDF-1水平显著较低，在rhGH治疗的第一年内有明显增加。这一观察表明，在rhGH治疗期间循环VSELs的增加可能是由于它们从骨髓中动员，可能由SDF-1介导。
此外，我们发现VSELs和HSCs与MSCs之间存在正相关关系。鉴于试图将诱导多能干细胞转化为间充质干细胞的努力，这一点非常有趣。MSCs可以从多个来源进行扩增。此外，MSC衍生的微囊泡/外泌体在移植后表现出类似的有益/再生作用。MSC移植的有益作用，如多项临床试验所证明的，是由于它们通过旁分泌作用对VSELs的再生能力，然后VSELs再生患病组织。VSELs的存在对于解释MSCs在再生过程中的潜力是必要的。VSELs负责在移植的间充质基质细胞提供旁分泌支持的条件下再生患病器官。MSCs本身不是多能的。HSCs和MSCs都不具有再生潜力。它们不能转分化从而再生其他类型和谱系的患病组织。HSCs，更好地定义为"谱系限制"和"组织承诺"祖细胞，源自脐带血或骨髓，在血液相关疾病的细胞再生中产生了巨大临床影响。近年来，GH在调节MSCs承诺中的可能作用引起了兴趣。MSCs表达GH受体。GH诱导抑制脂肪生成分化并促进MSC向成骨分化的分化。GH的这一活性表明，GH对身体组成的调节已经在组织祖细胞中开始。
GH的给药导致IGF-1水平逐渐增加，这提出了GH是直接作用于VSEL群体还是通过IGF-1间接作用的问题。在我们的研究中，在rhGH治疗的第一年期间或八年的长期随访后，VSELs、MSCs或EPCs群体与IGF-1水平之间均未观察到相关性。然而，有趣的是，我们在长期观察中发现了HSCs与餐后葡萄糖之间的相关性。这些发现表明，GH治疗可能直接影响衰老和组织再生，可能通过胰岛素信号传导而不是通过IGF-1。我们研究的一个主要优势是接受rhGH治疗患者的长期连续随访。
有人推测，VSELs在成年生活中由GH/INS/IGF信号产生的"代谢火焰"中不断减少。因此，减少这种GH/INS/IGF信号的条件，包括限制热量摄入、定期体育锻炼或某些特定药物降低胰岛素抵抗，可以支持长寿。临床观察到GH-IGF-1轴不活跃的人群，如拉伦侏儒症患者，循环IGF-1水平非常低，寿命延长且无恶性肿瘤。具体来说，拉伦综合征患者由于严重肥胖而具有发展为高脂血症、心血管疾病和糖尿病的风险增加。尽管他们存在这些代谢缺陷，但他们的寿命是正常的。此外，拉伦综合征患者（GH受体缺陷的纯合子）没有发生癌症的风险。在他们的亲属中，癌症的患病率与一般人群相同。在厄瓜多尔的拉伦综合征人群中，没有报道2型糖尿病病例，而其在厄瓜多尔的患病率为5%。2013年，首次报道了一例拉伦综合征患者发展为糖尿病，但他之前曾接受过重组人IGF-1治疗。2017年，报道了一例57岁未经治疗的拉伦综合征墨西哥患者，该患者发展为代谢综合征、2型糖尿病和中风。然而，该患者的临床数据否定了拉伦综合征的诊断，因为她不仅表现出低IGF-1值，而且在刺激（用可乐定）测试中也表现出低GH值。GH受体缺陷导致拉伦综合征，因此这种综合征的患者IGF-1水平非常低但GH水平很高。
GHD患者表现出不同的代谢并发症，心血管风险增加，寿命缩短。这可能表明，与一般健康人群相比，GH过量伴随IGF-1减少会导致更长的预期寿命，如在小鼠中所展示的那样，但GH和IGF-1水平低会导致预期寿命缩短，特别是在女性中。有人假设GH和IGF-1水平高也会导致预期寿命缩短，但这是由于致癌作用。然而，长期临床随访并未证实这一令人担忧的报告。GH受体基因和GH结合蛋白基因缺陷的突变动物拉伦侏儒症体型较小，但其寿命明显长于其正常同胞，表现出延迟衰老，外周血中血清IGF-1水平低。也许，由于PROP1基因（Ames侏儒小鼠）或Pit-1基因（Snell侏儒小鼠）纯合突变导致生长激素产生缺陷的小鼠的寿命延长和免疫学及胶原衰老延迟可能与缺乏多种垂体激素（GH、PRL、TSH）有关，而不仅仅是GH的孤立性缺乏。这个问题令人兴奋，但需要进一步的临床研究。
我们研究的局限性包括相对较小的样本量和缺乏对照组。然而，对GHD患者不给予GH治疗是不道德的，因为这将剥夺他们改善最终身高的机会。另一个局限性是在rhGH治疗八年后缺乏MSC测量；因此，我们关于rhGH对MSCs长期影响的结论仍然是推测性的。
总之，长期rhGH治疗调节了外周血中VSELs、MSCs和EPCs的群体。我们的数据证实VSELs对GH治疗有反应，长期治疗不会损害GHD患者中自然发生的VSEL群体。由于rhGH调节但不耗尽VSELs，因此不像在某些实验动物模型中那样，不太可能对人类的寿命或器官再生产生负面影响。这些发现支持VSELs在GH调节生长过程中的重要作用，其中HSCs有助于身体尺寸的扩大。此外，我们的数据表明GH治疗可能通过胰岛素信号通路影响GHD患者的衰老和再生，而不仅仅通过IGF-1。
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