1. 引言
脑内出血被认为是卒中最严重的类型之一，对全球神经功能障碍和死亡率有重大影响。虽然脑内出血在卒中病例中占比较小，但它通常导致更严重的临床结果。这主要是由于血肿造成的即时机械损伤，随后是一系列复杂的继发性损伤过程。新兴证据表明，这些继发性机制——包括氧化应激、炎症反应、兴奋毒性、线粒体功能障碍和进行性神经元损失——在决定长期神经功能缺损方面起着关键作用。
氧化应激在脑内出血后继发性脑损伤中起着核心作用。外渗血液的分解会释放血红蛋白和铁，促进过量活性氧(ROS)的产生，导致脂质过氧化、线粒体功能障碍和神经元膜损伤。这些过程表现为丙二醛水平升高、内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）活性降低，以及包括膜出泡在内的结构变化。核因子红细胞2相关因子2(NRF2)激活受损进一步损害了抗氧化防御，导致进行性神经元损失。因此，评估这些参数提供了对脑内出血后氧化失衡的全面评估。鉴于NRF2的核心作用，这一通路代表了一个潜在的治疗靶点，而百里醌等化合物可能通过增强内源性抗氧化反应来发挥神经保护作用。
除了氧化应激外，神经炎症是导致脑内出血后神经功能恶化的另一个主要因素。血液分解产物和受损的细胞成分激活小胶质细胞，导致促炎介质（如TNF-α、IL-1β和NLRP3炎症小体成分）的释放。同时，基质金属蛋白酶，尤其是MMP-9，上调并导致血脑屏障破坏、血管通透性增加和神经元损伤加剧。由此产生的炎症级联进一步增强了神经元的脆弱性并加剧了组织损伤。因此，能够同时减轻氧化应激和抑制炎症通路的治疗剂在改变继发性损伤进程方面具有重要意义。
百里醌，黑种草中发现的主要生物活性化合物，因其多样的药理作用而受到广泛关注。最近的研究表明，百里醌表现出强大的抗氧化活性，包括减少脂质过氧化、增强内源性抗氧化酶活性、维持细胞膜稳定性，以及激活保护性信号通路，如核因子红细胞2相关因子2(NRF2)。百里醌还被报道具有强大的抗炎特性。这种化合物可以减少促炎介质（如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β）的表达，抑制NLRP3炎症小体的激活，并限制基质金属蛋白酶-9相关的组织降解。这些综合特性表明，百里醌可能有效针对脑内出血后继发性脑损伤的多个方面。
除了其抗氧化和抗炎能力外，最近的研究表明百里醌还可能增强神经元恢复。证据表明，百里醌可以支持神经元存活，促进神经发生，调节凋亡通路，并刺激参与细胞修复和分化的分子调节剂的表达。考虑到脑内出血后神经元再生有限，具有双重保护和再生功能的干预措施特别有价值。
尽管有这些有希望的发现，但在脑内出血模型中全面研究百里醌的综合抗氧化、抗炎和神经再生效应仍然有限。大多数现有研究集中在缺血性损伤或泛化神经毒性上，对百里醌在出血性卒中独特生化环境中的作用留下了重要问题。鉴于氧化应激、炎症和神经元损失在脑内出血后同时发生并协同作用，有必要进行同时评估这些参数的实验研究。
因此，本研究旨在通过评估氧化应激关键指标、膜损伤、内源性抗氧化反应和神经元存活，研究百里醌在脑内出血大鼠模型中的抗氧化和神经再生效应。对这些机制的更深入了解可能有助于将百里醌开发为一种潜在的治疗剂，能够减轻脑内出血后的继发性损伤并增强神经恢复。
2. 材料与方法
2.1. 实验设计与动物
本实验实验室研究采用受控的后测仅设计，以评估百里醌(TQ)在脑内出血(ICH)大鼠模型中的抗氧化和神经再生效应。成年雄性Wistar大鼠(Rattus norvegicus)，体重200-250克，年龄8-10周，从Airlangga大学医学院动物研究设施获得，并在标准实验室条件下（22-25°C，50-60%湿度，12小时光照/黑暗循环）维持，经过7天适应期后自由获取食物和水。每天监测动物健康和环境条件，以确保实验稳定性并尽量减少与压力相关的混杂因素。
样本量使用Federer公式确定，每组至少需要10只动物；因此，每组包括11只大鼠，以增加统计稳健性并考虑潜在的变异性。正式的效力分析未进行；然而，样本量与先前使用类似脑内出血模型的实验研究一致。在通过自体血液纹状体内注射诱导脑内出血前表现出疾病迹象的大鼠被排除在研究之外。
2.2. 脑内出血的诱导
使用立体定向引导的自体血液注射技术在麻醉下诱导ICH模型。在严格无菌条件下，通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg）麻醉动物。该方法在实验性ICH研究中得到了很好的建立和广泛应用。简言之，在相对于前囟的预定坐标处钻孔，并将自体全血缓慢注射到纹状体区域以产生局灶性出血。注射针在原位保留几分钟以防止回流，然后缝合切口，允许动物在温暖的笼子中恢复，并在密切的术后观察下。为确保脑内出血模型的一致性，所有操作均在标准化条件下使用相同的立体定向坐标和注射量进行。通过在血肿周围区域组织病理学确认血肿形成来确认脑内出血的诱导成功。没有动物因模型诱导失败而被排除。
2.3. 实验分组与治疗
出血诱导后，动物被随机分配到三个实验组：未治疗ICH对照组、ICH + TQ 150 mg/kg组和ICH + TQ 250 mg/kg组。在本研究中使用高剂量百里醌（250 mg/kg）得到了先前实验结果的支持，表明在大鼠中口服百里醌剂量高达250 mg/kg/天耐受良好，并与显著的抗炎和抗氧化效果相关。这支持了评估其在实验性脑损伤中最大治疗潜力的理由。百里醌（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）在给药前新鲜制备，并溶解在玉米油中作为载体。从脑内出血(ICH)诱导后2小时开始，每天一次通过口服灌胃给药，连续三天。未接受百里醌的对照动物在相同时间表下给予等量玉米油。治疗在ICH诱导后2小时开始，以针对继发性脑损伤的早期阶段，此时氧化应激和炎症反应迅速激活。先前的实验研究表明，活性氧产生、脂质过氧化和小胶质细胞激活在出血后的最初几小时内开始。因此，此阶段的早期干预对于减弱继发性损伤级联并防止神经元损伤进展至关重要。与实验性脑损伤模型一致，包括百里醌在内的神经保护剂已被证明在损伤后的早期窗口期内给药最为有效。
2.4. 组织收集与处理
干预期结束时，动物被深度麻醉。为进行组织病理学和免疫组织化学分析，动物经心脏灌注磷酸盐缓冲盐水，随后用4%多聚甲醛灌注以保存组织结构。然后收获大脑，进行后固定，加工成石蜡包埋，并在血肿周围区域进行连续切片。切片使用标准化协议进行常规组织病理学染色和免疫组织化学程序，以确保样本间的一致性并尽量减少技术变异性。每组的所有动物（n = 11）均纳入两项分析。
2.5. 组织病理学评估
通过评估膜出泡作为脂质膜不稳定性的指标来组织学评估氧化膜损伤。膜出泡被定义为与细胞骨架分离相关的质膜球形突起的存在。组织学检查在苏木精和伊红(H&E)染色的脑切片上进行，并使用光学显微镜进行视觉评估。出泡根据形态学标准识别，并通过计数血肿周围区域多个随机选择的高倍视野中表现出膜突起的神经元进行量化。
然而，重要的是要注意膜出泡并非氧化应激特有，也可能发生在凋亡、机械应力和细胞骨架破坏等条件下。因此，在本研究中，膜出泡与氧化应激的生化标志物（MDA和SOD）和NRF2信号一起解释，以提供对氧化损伤和神经元损伤的更全面评估。
为进一步评估氧化损伤对神经组织的影响，通过使用苏木精和伊红染色和建立的完整神经元形态学标准，在血肿周围区域进行定量神经元计数来评估神经元存活和组织完整性。对每只动物，由两位对治疗分配不知情的独立观察者在多个随机选择的高倍视野中计数神经元。这种方法提供了基于形态学特征的神经元保存估计；然而，它不能区分存活、功能受损或垂死的神经元，也不能区分细胞死亡机制如凋亡和坏死。
2.6. 免疫组织化学
进行免疫组织化学染色以评估氧化应激相关标志物的表达和定位。使用抗丙二醛抗体（Antibodies.com, Cambridge, UK; Cat. No. A82233）评估MDA表达，使用抗SOD1抗体（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA; Cat. No. sc-1011523）评估SOD1表达。使用抗NRF2抗体（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA; Cat. No. sc-28379）评估NRF2表达。基于染色强度和阳性细胞比例进行半定量分析，以估计组织中的蛋白表达水平。
2.7. 统计分析
动物被分配进行免疫组织化学和组织学分析，各组表示均衡。所有组织学和免疫组织化学评估均在盲法条件下进行，以减少测量偏差。数据表示为平均值±标准差。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，使用Levene检验评估方差齐性。使用单因素方差分析对符合参数检验数据的组间差异进行分析，当不符合参数检验假设时，使用Mann-Whitney U检验进行非参数比较。应用适当的事后分析来确定组间差异并确定百里醌的最有效剂量，统计显著性设为p < 0.05。
3. 结果
假设检验表明所有氧化应激和神经元参数都满足参数分析的统计要求。使用Levene检验进行的齐性检验表明，膜出泡、MDA、SOD、NRF2和神经元计数的p值均大于0.05，确认三组之间方差均匀。这种一致性表明氧化和神经元结果的变异性不受不等组分散的影响。
同样，Shapiro-Wilk检验显示所有参数均符合正态分布，p值超过0.05显著性阈值。膜损伤指标（膜出泡）、氧化应激标志物（MDA）、抗氧化反应（SOD和NRF2）和神经元存活数据的正态性表明样本分布满足参数评估所需的高斯行为假设。
综合来看，齐性和正态性检验的结果确认氧化应激和神经元参数在统计上适合后续使用单因素方差分析进行分析，确保了解释百里醌对ICH模型中抗氧化防御和神经元保护作用的可靠性和有效性。
如表1所示，百里醌给药与ICH模型中氧化应激标志物和神经元存活的显著改善相关。膜出泡呈剂量依赖性显著减少，TQ 250 mg/kg组与对照组相比观察到最低值（3.55 ± 1.57 vs. 6.70 ± 1.64；p < 0.001）。同样，MDA阳性细胞数量在百里醌治疗后显著减少，表明脂质过氧化减轻，250 mg/kg剂量下减少最为明显（4.55 ± 1.64 vs. 对照组10.40 ± 1.58；p < 0.001）。
相反，抗氧化防御参数显示出显著增加。SOD阳性细胞数量在两个治疗组中均升高，TQ 250 mg/kg组观察到最高值（11.27 ± 1.74 vs. 对照组5.50 ± 1.27；p < 0.001）。NRF2阳性细胞也观察到类似趋势，百里醌给药后显著增加（11.91 ± 1.30 vs. 对照组4.10 ± 1.45；p < 0.001），表明内源性抗氧化通路的激活。
神经元存活率也显著提高，表现为治疗组中神经元计数增加，尤其是在较高剂量下（11.36 ± 2.11 vs. 对照组4.20 ± 2.10；p < 0.001）。事后分析确认250 mg/kg剂量在所有参数上产生的效果均显著大于150 mg/kg（p < 0.05）。总体而言，这些发现表明百里醌在ICH模型中具有一致的剂量依赖性神经保护和抗氧化效应。
如图1所示，免疫组织化学和组织病理学分析一致地证明了百里醌对血肿周围区域氧化应激和神经元完整性的影响。在ICH组（图1a-d，顶行），在所有放大倍数下均可见明显的病理变化，包括神经元密度降低、细胞收缩和组织结构紊乱。这些形态学改变伴随着强烈的MDA免疫反应性（图1b），表明严重的脂质过氧化，以及SOD1（图1c）和NRF2（图1d）染色减弱，反映了内源性抗氧化防御受损。
百里醌给药后，在氧化应激标志物和神经元形态方面观察到渐进性改善。在ICH + TQ150组（中行）中，与ICH组相比，MDA染色减少，而SOD1和NRF2免疫阳性增强，表现为100×、400×和1000×放大倍数下的棕色染色强度和分布增加。相应地，神经元结构部分保存，细胞收缩减少，组织结构改善。
这些效果在ICH + TQ250组（底行）中更为明显，MDA免疫反应性显著降低，表明有效抑制了脂质过氧化。相比之下，SOD1和NRF2表达显著增加，表现为更强更广泛的免疫染色。这种增强得到了染色强度和阳性细胞比例的半定量评估的支持。从形态学上看，该剂量下神经元保护最为明显，表现为更大的细胞体、更清晰的核质和所有放大倍数下退化的减少迹象（图1a）。
4. 讨论
本研究的结果表明，百里醌在脑内出血模型中发挥了显著的抗氧化和神经保护作用。统计分析的有效性通过假设检验得到确认，显示所有参数均呈正态分布且方差齐性。这些结果加强了使用方差分析评估治疗效果的可靠性，与最近的生物医学实验研究一致，强调验证正态性和方差齐性的重要性，以确保准确解释动物模型中药理干预的结果。
从病理生理学角度看，ICH引起继发性损伤机制——包括氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋毒性和先天免疫细胞激活——共同增加活性氧(ROS)的产生。ROS的积累加速膜磷脂的脂质过氧化，导致质膜不稳定和细胞骨架改变，形态学上表现为膜出泡。膜出泡是由于与肌动蛋白细胞骨架分离而形成的球形质膜突起。它与细胞骨架破坏相关，被认为是凋亡的早期形态特征，表明细胞结构损伤。因此，治疗组中膜出泡的减少反映了损害膜结构完整性的继发性损伤级联的减弱。
与这些机制一致，我们的研究结果证实百里醌显著减轻了细胞损伤。这一发现与研究表明百里醌在神经系统疾病中氧化应激加剧的条件下抑制脂质过氧化并稳定细胞膜。MDA水平的降低进一步证实了这一点。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的副产品，广泛用作氧化损伤的生物标志物，常用于指示脑内出血后脑组织的氧化损伤程度。治疗动物中MDA的减少表明百里醌有效抑制了靶向膜磷脂的自由基反应。
SOD活性的大幅增加反映了内源性抗氧化能力的增强。SOD活性升高表明神经组织中和超氧自由基的能力提高，减少了已知引起神经元毒性的活性氧的积累。这一观察结果与研究表明百里醌通过激活NRF2信号通路增强抗氧化防御，随后增加关键抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）的表达。
在脑内出血后，血红蛋白的降解会释放血红素和游离铁，促进过量活性氧的产生，并导致线粒体功能障碍、神经元DNA损伤和凋亡通路的激活。因此，SOD活性的增加反映了关键的适应性保护反应，抑制了出血损伤脑组织中的氧化负担。Yan Zhang等人的研究表明，SOD和过氧化氢酶活性的降低与ICH的脑水肿和神经功能缺损增加相关，这强化了本研究中观察到的SOD增加有助于限制继发性脑损伤的解释。
在分子水平上，SOD活性的增加可能归因于抗氧化信号通路的激活，特别是PI3K/Akt和MAPK，它们调节抗氧化基因的表达。PI3K/Akt的激活促进NRF2核转位，导致SOD1、SOD2和其他抗氧化酶的上调。这种机制支持了促生存通路在维持细胞内氧化还原稳态中的作用。
在神经保护的背景下，SOD活性与神经元活力密切相关，线粒体SOD2在抵抗氧化应激中起关键作用。SOD2过表达在出血性脑损伤模型中减少线粒体膜去极化、细胞色素c释放和caspase-3激活，从而限制神经元凋亡。这支持了本研究中SOD增加有助于线粒体保护和防止血肿周围组织中程序性细胞死亡的解释。
这些抗氧化作用与NRF2通路激活密切相关。百里醌通过激活NRF2/HO-1通路部分发挥抗氧化和神经保护作用，增强内源性抗氧化酶并减少神经元细胞中的氧化应激。NRF2通路的激活通过上调超氧化物歧化酶、血红素加氧酶-1和NAD(P)H醌脱氢酶1等酶来增强抗氧化防御，从而减少活性氧和脂质过氧化。通过限制对膜脂质和细胞骨架成分的氧化损伤，NRF2激活有助于维持膜完整性，可能减少膜出泡。因此，百里醌诱导的NRF2激活可能通过限制氧化膜损伤和稳定细胞结构来促进膜出泡的减少。然而，膜出泡并非氧化损伤特有，也可能由凋亡和细胞骨架破坏引起。
NRF2表达的显著增加支持了百里醌通过激活细胞防御通路的作用。NRF2促进超氧化物歧化酶、血红素加氧酶-1和NQO1等抗氧化酶的转录，减轻出血后的氧化应激。NRF2表达的一致升高，包括免疫组织化学发现，表明抗氧化防御增强。
新出现的证据表明，NRF2激活通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径增强线粒体周转，从而限制作为出血性损伤后活性氧主要来源的功能失调线粒体的积累。Lei Wang等报道，NRF2的药理学激活促进线粒体自噬，减少线粒体活性氧生成，并改善神经元存活。这些发现为本研究中观察到的NRF2表达协调增加提供了合理的机制解释，表明百里醌介导的NRF2激活不仅可能有助于抗氧化酶的诱导，还可能有助于恢复线粒体稳态。
这些抗氧化改善与治疗组中神经元计数的显著增加相对应。神经元数量的增加表明百里醌有效抑制了神经退行性过程并保护了神经元活力。这一观察结果与研究表明百里醌通过调节caspase活性和减少继发性炎症反应来抑制神经元凋亡。
从病理生物学角度看，ICH后的神经元损失主要由氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋毒性和神经炎症驱动，这些因素汇聚在凋亡和坏死性细胞死亡通路上。因此，观察到的神经元数量增加表明百里醌在多个节点上中断了这些汇聚的损伤级联，从而促进血肿周围区域的神经元存活。
从转化角度看，神经元群体的保存与脑内出血后神经功能恢复密切相关，因为神经保护和再生机制有助于实验性脑损伤模型中的功能恢复。因此，百里醌治疗组中观察到的神经元数量的显著增加表明潜在的功能相关性，超出了生化改善，支持百里醌作为辅助神经保护剂的候选资格。
免疫组织化学分析进一步验证了定量发现。ICH组中强烈的弥散性MDA染色证实了广泛的脂质过氧化，而在治疗组中，特别是在250 mg/kg剂量下，观察到染色强度明显降低。这种减少在100×至1000×的放大倍数下均可见，表明氧化膜损伤得到一致抑制。治疗组中SOD1和NRF2染色的增强强化了百里醌显著上调内源性抗氧化防御的结论。
形态学评估表明对神经元组织具有保护作用。ICH组显示了神经退化的特征，包括细胞体收缩、核碎裂和组织结构紊乱。相比之下，治疗组（尤其是250 mg/kg）表现出更完整的神经元形态，具有更大的细胞体、更清晰的核质和更少的退化改变。这些发现与研究表明百里醌通过减少氧化应激和抑制炎症信号通路来增强神经元存活。
脑内出血后的继发性脑损伤由血肿周围区域的氧化应激介导的损伤驱动。研究表明，减少氧化应激的干预措施可以减轻实验模型中的组织病理学损伤并改善神经元保存。该区域特别容易受到损伤，因为血红蛋白降解和铁积累促进活性氧生成、血脑屏障破坏和水肿。在这种情况下，本研究中观察到的神经元形态改善表明百里醌可能稳定血肿周围微环境并限制结构性组织损伤。
此外，神经元的结构保存也可能与改善的线粒体稳态和减少的内在凋亡通路激活相关。线粒体功能障碍在脑内出血后的继发性神经元损伤中起关键作用，因为过量活性氧损害线粒体功能并激活涉及细胞色素c释放的凋亡通路。百里醌治疗动物中观察到的形态学完整性因此可能代表线粒体弹性改善和凋亡机制激活减少的组织学相关性。
总体而言，这些发现支持这样的解释：百里醌治疗动物中神经元的形态学保存不仅反映了直接的细胞保护，还反映了出血后微环境的更广泛调节，包括减少氧化应激和抑制神经炎症信号，这与脑内出血后改善的神经元存活相关。这种整合的作用模式为较高百里醌剂量下观察到的优越神经保护特征提供了机制基础，并进一步证实了其在实验性脑内出血中的治疗相关性。
研究结果强烈表明，百里醌通过多种机制发挥神经保护作用，包括抑制氧化应激、增强抗氧化酶活性、激活NRF2信号通路和保护神经元结构。这些效果已在最近的实验研究中得到一致证明，其中百里醌被证明可以上调NRF2表达、增加内源性抗氧化酶、减少脂质过氧化并改善神经元完整性。因此，百里醌成为减轻脑内出血后脑损伤的有希望的治疗候选物。这一结论与日益增多的研究一致，强调基于抗氧化的干预措施在减少ICH的发病率和死亡率方面的重要性。
本研究有几个局限性。观察期仅限于三天，可能无法完全捕捉百里醌在脑内出血后的长期神经保护效果。此外，未评估功能性神经学结果，限制了将生化和组织学发现与临床相关性相关联的能力。研究也未包括对NLRP3、TNF-α和IL-1β等关键炎症生物标志物的直接测量，这些标志物在继发性脑损伤中起重要作用。此外，使用实验动物模型可能限制了这些发现向人类临床状况的直接转化。最后，仅评估了两种百里醌剂量，需要进一步研究以确定最佳治疗剂量并更详细地探索潜在的分子机制。
5. 结论
本研究表明，百里醌通过强烈调节氧化应激标志物和神经元存活，在脑内出血(ICH)模型中提供了显著的神经保护作用。增加剂量的百里醌（150和250 mg/kg）一致地减少了膜出泡和脂质过氧化（MDA），同时显著增强了抗氧化防御（SOD）、NRF2激活和神经元保护。较高剂量（250 mg/kg）在所有测量参数中产生了最强的保护作用，表明剂量依赖性治疗反应。这些发现支持百里醌作为一种有希望的基于抗氧化的干预措施，能够减轻ICH后的继发性脑损伤。
建议进一步研究以验证百里醌在临床相关ICH设置中的治疗潜力，包括长期功能结果、分子通路分析和剂量优化研究。未来工作还应考虑整合药代动力学分析、在更高剂量下评估安全范围，以及探索与已建立的神经保护剂的联合疗法。转化研究，特别是涉及更大动物模型或人类细胞系统的研究，需要弥合实验疗效与ICH管理中潜在临床应用之间的差距。
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