- 引言
面部老化是一个复杂的渐进性生物过程，涉及真皮层细胞数量、细胞外基质(ECM)组织和皮下软组织结构的累积性改变。在微观层面，老化皮肤表现出成纤维细胞活性降低、胶原蛋白断裂、弹性蛋白紊乱以及ECM更新受损，这些变化共同在临床上表现为细纹和静态皱纹、表面粗糙以及面部轮廓连续性丧失[1]-[3]。重要的是，这些变化反映了再生能力的下降，而不仅仅是孤立的结构缺陷。目前的美容干预措施主要集中在症状矫正上。填充剂提供即时的体积替代，而能量设备则诱导受控的组织损伤以刺激继发性修复反应。尽管在短期美容改善方面有效，但这些方法并未直接解决组织稳态的潜在生物学失调，且在缺乏持续再生信号的情况下可能耐久性有限4。
间充质干细胞(MSCs)由于能够通过旁分泌机制而非直接分化来调节组织修复，已成为再生治疗的有希望候选者[6]-[8]。越来越多的证据表明，MSCs主要通过分泌生物活性因子（包括细胞因子、生长因子和外泌体等细胞外囊泡）发挥其生物学效应，这些因子共同影响成纤维细胞活性、血管生成、免疫调节和ECM重塑6-[11]。这种旁分泌范式与皮肤老化的病理生理学密切相关，其中需要恢复细胞信号和基质动态以实现有意义的再生2。
在各种MSC来源中，人脐带来源MSCs(hUC-MSCs)表现出几个优势，包括高增殖能力、低免疫原性以及在良好生产规范(GMP)条件下扩增时相对稳定的表型特征[11]-[16]。先前研究表明，华通氏胶来源的MSCs与多种成人组织来源相比，表现出有利的增殖行为和免疫调节特性15[18]。重要的是，hUC-MSCs已被证明表现出富含ECM调节和抗炎介质的稳定分泌谱，表明其在皮肤再生和软组织重塑方面具有潜在效用3-[21]。
源自MSCs的外泌体作为再生信号的关键介质已引起特别关注。这些纳米级囊泡运输功能性蛋白质、脂质和微RNA，调节成纤维细胞增殖、胶原合成和基质金属蛋白酶活性，从而影响ECM结构和组织力学特性[1]-3。与诱导突然的结构变化不同，外泌体介导的效果通常是渐进的和空间分布的，与生物重塑过程一致[10]。
人胎盘提取物(HPE)含有肽、生长因子和基质相关分子的复杂混合物，可能支持细胞通讯和ECM稳态21。几种胎盘相关生长因子，包括PDGF、VEGF和PlGF信号通路，已被证明参与血管生成、伤口愈合和组织重塑过程[23]-[28]。此外，在多个实验系统中已证明生长因子依赖性调节间充质细胞分化和存活[29]-[31]。
当与MSCs联合给药时，HPE可能作为允许性微环境调节剂，潜在增强MSC旁分泌信号并维持再生级联。然而，关于MSCs和HPE联合用于面部再生的临床数据仍然有限，特别是在客观、定量结果评估方面10。
再生美容研究中的一个主要挑战是治疗结果的客观评估。虽然先进的三维体积成像提供精确测量，但此类技术在早期临床研究中并不总是可及或实用。基于图像的分析平台（包括ImageJ）为纵向表面拓扑分析提供了一种实用替代方案。在标准化感兴趣区域内保守应用时，这些方法允许对表面深度、粗糙度和轮廓变化进行相对量化，补充定性临床评估[10]。
在本报告中，我们描述了两名接受皮内注射GMP扩增hUC-MSCs(第5代)联合人胎盘提取物治疗的病例。这些病例代表了不同的面部老化表型：以皱纹为主的眶下老化和以体积损失为主的面颊凹陷。通过整合盲法临床评估与基于ImageJ的定量表面分析，本研究旨在提供表型特异性再生反应的结构化记录，并探索MSC-外泌体-ECM相互作用在面部再生中的潜在作用[33]-[36]。
- 材料和方法
2.1. 伦理考虑
脐带组织和胎盘组织来自一位健康供体，分娩前已获得母亲的书面知情同意。所有程序均按照机构伦理指南和《赫尔辛基宣言》原则进行。供体筛查结果确认对HIV-1/2、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和梅毒呈阴性。
2.2. 胎盘提取
胎盘碎片用0.15 M氯化钠(NaCl)溶液反复冲洗，直至去除可见的粘液和血液。然后分离胎儿膜，包括羊膜和绒毛膜层。接下来，将小叶区域的薄层切成小块。这些碎片按1:5的重量比与生理盐水混合，搅拌2-3分钟。上清液被弃去，加入新鲜生理盐水，重复该过程3-4次。洗涤后的胎盘碎片使用匀浆器匀浆，加入生理盐水溶液，体积比为1:1(v/v)。将胎盘浸泡12小时，然后在3000 rpm下离心8分钟。收集上清液并通过0.45 μm膜过滤器(Millipore Corp; Cork, Ireland)过滤。所得滤液为水性生理盐水HPE，然后分装进行进一步分析7。
2.3. 细胞培养和准备
脐带组织在无菌条件下处理。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗组织以去除残留血液，并小心去除脐动脉和静脉。剩余的华通氏胶被解剖并切成小碎片(约1-3 mm³)，使用无菌外科器械。将组织碎片接种在T75培养瓶中，维持在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的α-改良Eagle培养基(α-MEM)中。在含5% CO₂的37℃潮湿大气中培养。每2-3天更换培养基，直到从外植体迁移出贴壁成纤维细胞样细胞并达到约80%汇合。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA传代细胞，并扩增至第5代用于进一步表征和临床应用1527[37]。
根据国际细胞治疗学会(ISCT)定义的标准进行流式细胞术免疫表型表征[23]。简言之，收获细胞并在PBS中重悬，然后与针对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、CD19和HLA-DR的荧光染料偶联抗体孵育。包括适当的同型对照以评估非特异性染色。孵育后，洗涤细胞并使用流式细胞仪(BD Biosciences)分析，使用CellQuest Pro软件处理数据。在临床使用前，按照后续章节所述评估细胞的活力、无菌性、支原体污染、内毒素水平和核型稳定性18[22]。
给药时，第5代细胞在约80%汇合时收获，离心获得细胞沉淀，并重悬于无菌0.9%生理盐水(NSS)中。最终制剂包含1.0×10⁷个细胞，总体积为2.0 mL，与人胎盘提取物(HPE)按定义浓度混合。细胞悬液在皮内注射前立即准备。
2.4. 核型分析
增殖的MSCs用浓度为0.10 μg/mL的秋水仙素处理3小时。收获原代细胞，并按照先前发表的方法用于核型分析。简言之，单细胞悬液在37℃低渗溶液中孵育30分钟，然后至少用卡诺氏固定液固定3次，包括过夜固定步骤。固定后的细胞悬液滴在准备好的载玻片上，按照G显带方案染色。使用Ikaros软件(MetaSystems, Altlussheim, Germany)分析染色体组35。
2.5. 患者历史和病例描述
本研究纳入两名呈现不同面部老化表型的男性患者。两名患者均在治疗前提供书面知情同意，所有程序均按照机构伦理指南进行。对于两种情况，均在无菌条件下进行人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs，第5代)的皮内给药。细胞制备如2.3节所述，重悬于无菌0.9%生理盐水(NSS)中，最终剂量为1.0×10⁷个细胞/2.0 mL，与人胎盘提取物(HPE)混合。使用30G针头通过微滴技术在皮内至浅表皮下平面进行注射。在治疗区域分布约20-30个注射点，间距约1厘米。在手术前应用局部5%利多卡因。指示患者在随访期间避免紫外线暴露和其他美容程序。
病例1
一名42岁男性主诉眶周老化进行性加重，主要是眶下区域的细静态皱纹和早期鱼尾纹。患者报告几年来皮肤平滑度逐渐下降，中性面部表情时皱纹可见性增加。眶周区域未进行过任何美容手术，包括填充剂、肉毒杆菌毒素或能量设备。患者总体健康，无自身免疫疾病、慢性炎症疾病、出血性疾病或已知过敏反应史。他不吸烟，否认定期使用全身性皮质类固醇或免疫调节药物。皮肤类型被归类为Fitzpatrick III型。基线临床检查显示轻度至中度静态眶下皱纹，无明显体积损失、水肿或色素异常。主要治疗目标是再生性皮肤再生，而非体积增强。患者接受了在受控条件下制备的hUC-MSCs(第5代)皮内给药。
病例2
一名47岁男性主诉鼻唇沟进行性加深，伴有面中部体积损失和鼻唇沟-颧骨界面的轮廓支撑减弱。患者报告过去5-7年鼻唇沟沟槽深度逐渐加重，导致阴影增加和面部外观更显老化，尤其在静态面部表情时。他否认有任何面部创伤、结缔组织疾病或先前的面部手术史。患者先前未接受过填充剂、脂肪移植或基于干细胞的治疗，仅间歇性使用局部抗衰老产品，感知效果最小。他的病史总体无异常，未发现再生干预的禁忌症。Fitzpatrick皮肤类型被归类为IV型。基线临床检查显示中度至重度鼻唇沟深度，沟槽从鼻翼基部延伸至口角。轮廓异常主要表现为结构性软组织消耗和面中部支撑丧失，而非表层真皮皱纹。鼻唇沟区域的皮肤纹理相对保留，而沟槽深度和阴影因潜在体积不足而加重。鉴于患者倾向于避免合成体积填充剂并追求渐进的、生物学介导的面部再生方法，选择了皮内给药hUC-MSCs(第5代)联合HPE。治疗目标是诱导渐进性真皮-皮下重塑和结构性支撑恢复，而非即时体积矫正。
2.6. ImageJ图像分析
在基线(第0天；第0个月)和随访访问(对应第30天(第1个月)、第60天(第2个月)和第90天(第3个月))获取标准化临床照片。所有图像均在一致的照明条件、相机设置和患者体位下拍摄。使用固定解剖标志对图像进行对齐，以确保时间点之间的空间一致性。使用ImageJ(美国国立卫生研究院)进行定量图像分析。为了表面可视化，使用ImageJ 3D Surface Plot插件生成灰度高度图。以盲法手动勾勒眶下皱纹区域和鼻唇沟的感兴趣区域(ROI)。使用线轮廓分析提取表面粗糙度参数，包括平均表面高度变化和峰谷振幅，以评估皮肤表面特征的时间变化。鉴于分析是在二维摄影数据上进行的，所有报告的"深度"值代表相对图像衍生指数，而非绝对物理测量。因此，结果基于随时间的相对变化进行解释，而非真实维度深度。对每个时间点进行三次测量，结果以均值±标准差表示，以说明每个病例内的纵向趋势。
2.7. 统计分析
鉴于本研究的探索性质和有限的样本量(n=2)，临床结果以描述性方式分析。数据以均值±标准差和相对于基线的百分比变化表示。仅对评估HPE对MSC生长影响的体外实验(n=每种条件3个独立重复)应用推断统计分析(双因素方差分析和Tukey事后检验)。p值<0.05被认为具有统计学意义。
- 结果
3.1. hUC-MSCs的免疫表型表征
根据国际细胞治疗学会(ISCT)确立的标准进行流式细胞术分析，以表征分离细胞的免疫表型谱11。应用标准化门控策略，包括基于前向和侧向散射特性的碎片排除、双峰鉴别和活力门控。分析的细胞群体显示出同质的间充质干细胞表型。观察到MSC相关表面标志物高表达，CD73(99.2%±0.4%)、CD90(99.5%±0.3%)和CD105(98.8%±0.5%)在细胞群体的大部分中一致表达。相比之下，造血和免疫谱系标志物(包括CD34(0.6%)、CD45(0.4%)、CD14(0.3%)、CD19(0.2%)和人类白细胞抗原-DR(HLA-DR；0.5%))的表达保持最低，且一致低于1%。分析时细胞活力超过90%，证实了分析群体的完整性。这些发现证实分离和扩增的hUC-MSCs符合ISCT定义的最小免疫表型标准，并表现出高度细胞纯度，支持其适用于后续实验和临床应用1523[37]。
3.2. 人胎盘提取物对MSC生长和粘附的影响
评估了在人胎盘提取物(HPE)存在下培养的人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)的生长行为，使用定量细胞计数和形态学评估，持续21天。HPE浓度表示为蛋白当量值(0.02、0.05、0.1、0.15和0.2 μg/mL)。在所有条件下，MSCs均表现出随时间增加的细胞数量。较高HPE浓度通常与更大的细胞扩增相关。在第21天，最高细胞密度在0.2 μg/mL HPE(12.24×10⁶个细胞/75cm²)下观察到，而最低值在第7天0.02 μg/mL(0.68×10⁶个细胞/75cm²)下记录。在0.15 μg/mL HPE下培养的细胞在第21天达到10.06×10⁶个细胞/75cm²，超过相应的对照条件。线性回归分析表明，在所有HPE浓度下，培养持续时间与细胞生长之间存在一致的正相关关系，决定系数(R²)范围为0.9006至0.9636。在0.2 μg/mL下观察到最高相关性(R²=0.9636)，表明在此条件下稳定扩增。
在第0、7、14和21天进行DAPI和罗丹明-鬼笔环肽荧光染色，以评估不同HPE浓度下的核形态和细胞骨架组织。在所有条件下，整个培养期间均观察到明显的核染色和有组织的F-肌动蛋白结构。细胞表现出扁平的成纤维细胞样形态，具有明显的板状伪足延伸，符合贴壁间充质细胞特征。所有条件下的细胞覆盖率随时间逐渐增加，较高HPE浓度下增加更为明显。在后期，特别是在第21天，用较高浓度(包括0.15 μg/mL(150 pg/mL)和0.2 μg/mL(200 pg/mL)HPE)处理的培养物显示出比低浓度更高的细胞密度，与图1中呈现的生长动力学一致。使用ImageJ对DAPI染色的细胞核进行定量分析表明，在所有HPE浓度下，细胞密度随时间增加。在0.2 μg/mL(200 pg/mL)HPE下始终观察到最高细胞密度，与生长曲线数据一致。细胞数量的增加在整个培养期间逐渐发生，没有生长模式的突然变化。综合来看，形态学观察和定量分析与HPE补充下MSC扩增的浓度依赖性增加一致，持续21天培养期。
图1. 用人胎盘提取物(HPE)培养的人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)的生长动力学。细胞在HPE浓度为0.02、0.05、0.1、0.15和0.2 μg/mL(20、50、100、150和200 pg/mL)下培养21天。在指定时间点测量细胞密度(×10⁶个细胞/75 cm²)，并相对于培养持续时间绘制。在所有条件下均观察到细胞数量的时间依赖性增加，较高HPE浓度与更大细胞扩增相关。线性回归分析表明培养持续时间与细胞生长之间存在正相关(R²=0.9006-0.9636)。
3.3. ImageJ基于3D的定量评估
病例1：眶下皱纹为主表型
病例1在基线(第0个月)显示中度静态眶下皱纹，无明显体积缺乏(图2)。使用ImageJ对标准化临床照片进行定量图像分析，在包含眶下区域的预定义感兴趣区域(ROI)内。使用灰度高度图和线轮廓分析得出的表面粗糙度参数评估皱纹形态。在基线(第0个月)时，ROI内的平均皱纹深度测量为182.6±14.3 μm，皱纹表面粗糙度(Ra)值为41.8±3.9任意单位(a.u.)，皱纹面积分数为22.4%，如表1(a)所示。在皮内注射hUC-MSCs(第5代)联合人胎盘提取物(HPE)后的第1个月，观察到皱纹深度略有降低，平均深度降至156.4±12.7 μm，相当于比基线减少14.4%。表面粗糙度同样降至35.2±3.1 a.u.(-15.8%)，而皱纹面积分数降至16.1%，表明眶下皮肤纹理和皱纹形态早期改善(表1(a))。
图2. 病例1眶下皱纹重塑的系列临床图像和基于ImageJ的定量分析。
表1. 3个月随访期间病例1和病例2的ImageJ衍生定量结果。(a)病例1：眶下皱纹为主表型；(b)病例2：鼻唇沟为主体积损失表型。
(a)
| 时间点 | 平均皱纹深度 (μm) | 相对于基线的%变化 | 表面粗糙度 Ra (a.u.) | 相对于基线的%变化 | 皱纹面积分数 (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 第0个月 | 182.6 ± 14.3 | 0% | 41.8 ± 3.9 | 0% | 22.4 |
| 第1个月 | 156.4 ± 12.7 | -14.4% | 35.2 ± 3.1 | -15.8% | 16.1 |
| 第3个月 | 118.9 ± 11.6 | -34.9% | 27.6 ± 2.8 | -33.9% | 11.8 |
(b)
| 时间点 | 平均鼻唇沟深度 (mm) | 相对于基线的%变化 |
|---|---|---|
| 第0个月 | 2.84 ± 0.21 | 0% |
| 第1个月 | 2.31 ± 0.19 | -18.7% |
| 第3个月 | 1.61 ± 0.15 | -43.3% |
在第3个月，进一步改善明显。平均皱纹深度降至118.9±11.6 μm，相对于基线总体减少34.9%，而表面粗糙度降至27.6±2.8 a.u.，相当于减少33.9%(表1(a))。同时，皱纹面积分数进一步降至11.8%，反映了在分析的ROI内皱纹负担的渐进减少。线轮廓分析显示眶下表面的峰谷振幅可见降低和皱纹轮廓平滑化。三维表面重建表明眶下微地形随时间逐渐变平，最大凹陷深度降低，真皮表面连续性改善(图2)。随访3个月期间的变化模式是渐进和持续的，与组织重塑而非即时体积填充效果一致，如表1(a)中定量所示。
病例2：鼻唇沟体积损失为主表型
病例2在基线(第0个月)表现出以鼻唇沟为主的体积损失老化表型，特征是深陷的沟槽从鼻翼基部延伸至口角(图3)。未观察到明显的眶下皱纹或眶周表面不规则，表明美容关注主要与面中部体积缺乏有关，而非表层纹理变化。使用ImageJ对标准化正脸和斜脸面部照片进行定量图像分析。沿鼻唇沟勾勒预定义感兴趣区域(ROI)，包括最大凹陷区域。使用垂直于沟槽轴线的灰度强度剖面和线轮廓分析评估沟槽深度和轮廓几何形状。
图3. 病例2在基线(第0个月)和hUC-MSCs(P5)联合HPE皮内给药后第3个月的代表性正脸和斜脸视图。突出显示的区域对应于使用ImageJ分析的鼻唇沟ROI，显示随时间推移定性视觉改善和沟槽深度的定量减少。
在基线时，ROI内平均鼻唇沟深度测量为2.84±0.21 mm，高峰谷振幅反映了明显的轮廓凹陷，如表1(b)所示。在皮内注射hUC-MSCs(第5代)联合人胎盘提取物(HPE)后，随时间推移观察到渐进性体积改善。在第1个月，平均沟槽深度降至2.31±0.19 mm，相对于基线减少18.7%(表1(b))。到第3个月，进一步改善明显，沟槽深度降至1.61±0.15 mm，相对于基线值总体减少43.3%(表1(b))。线轮廓分析显示峰谷振幅逐渐衰减和鼻唇沟轮廓平滑化，面颊中部和口周区域之间连续性改善。三维表面重建表明面中部凸度恢复而非表层填充，沿鼻唇沟有更宽且解剖上更整合的体积分布(图3)。改善的时间模式在整个随访期间是渐进和持续的，与生物介导的组织再生和细胞外基质重塑而非即时占位效应一致。这些发现，连同表1(b)中总结的定量减少，支持联合hUC-MSC和HPE疗法在鼻唇沟为主面部老化中的再生体积作用。
基于标准化临床照片的ImageJ分析得出的定量结果，分析了两种不同面部老化表型。病例1显示眶下皱纹深度、表面粗糙度和皱纹面积分数的渐进减少，表明真皮表面的渐进重塑。病例2表现出鼻唇沟深度的持续减少，与生物介导的体积恢复而非即时填充效果一致。两项病例的改善均在3个月随访期间表现出渐进的时间模式。
- 讨论和结论
这项双病例分析评估了人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)联合人胎盘提取物(HPE)对两种不同面部老化表型的皮内给药后的临床和图像衍生结果。研究结果表明，在皱纹为主和体积损失为主的表型中，均观察到一致的、时间依赖性改善，通过标准化图像分析进行评估。在眶下皱纹为主病例中，随访3个月期间观察到相对皱纹深度、表面粗糙度和皱纹面积分数的渐进减少。这些变化伴随着皮肤表面可见的平滑化。在鼻唇沟为主病例中，观察到相对沟槽深度指数和峰谷振幅的逐渐降低，表明随时间推移轮廓分布改善。
两项病例中的变化时间模式是渐进的而非即时的，与通过旁分泌信号和细胞外囊泡活性而非直接结构替代的MSC介导组织修复的先前报告一致[1]-37[25]。
体外研究结果进一步支持这些观察。在HPE存在下培养的hUC-MSCs在21天期间表现出浓度依赖性细胞扩增增加，在所有测试浓度下具有稳定的生长动力学。形态学评估显示保留的细胞骨架组织和贴壁细胞特征，与测试条件下持续的细胞扩增一致。先前在胎盘和脐带来源MSC系统中已报道类似的增殖和再生支持特性11[27]-29[36]。
虽然这些发现不能直接转化为体内机制，但它们为观察到的临床趋势提供了支持性背景。本研究未直接调查观察到效果的潜在机制。因此，提出的途径(包括旁分泌信号、细胞外基质重塑、血管生成调节或外泌体介导效果)应被视为假设[1]-3121725。
总之，hUC-MSCs与HPE联合的皮内给药与3个月期间两种不同面部老化表型的图像衍生参数的渐进性改善相关。这些发现支持该方法作为再生策略的可行性；然而，需要纳入更大样本量和客观三维评估的进一步对照研究来确认疗效并阐明潜在机制412。
利益冲突声明
作者声明在发表本文方面不存在利益冲突。
【全文结束】