摘要
慢性短睡眠（CSS）是一个新兴的公共卫生问题，它通常始于青春期，并且在医疗保健专业人员及其他从事轮班工作的人群中很常见。流行病学研究将短睡眠和睡眠中断与代谢紊乱、心血管疾病、认知衰退以及阿尔茨海默病风险增加联系起来。基于我们先前关于睡眠剥夺扰乱蛋白质稳态并激活内质网（ER）应激通路的研究发现，我们调查了CSS在年轻成年野生型小鼠中长达一年的长期后果。暴露于CSS的小鼠在28周龄时，在海马依赖性任务中显示出认知能力受损，表明出现了早期记忆缺陷。在分子水平上，CSS破坏了海马蛋白质稳态——特别是蛋白质折叠过程——并引发了内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）的激活。重要的是，蛋白质稳态的破坏先于行为衰退，关键分子伴侣和UPR调节因子BiP在20-22周龄时减少。CSS还增加了细胞应激和神经炎症的标志物，同时降低了与记忆功能相关的蛋白质表达。年龄似乎也是一个细胞应激源，导致UPR、整合应激反应和神经炎症标志物随时间推移而增加。总之，这些结果表明，慢性短睡眠和年龄都会损害蛋白质稳态并促进神经炎症，从而导致进行性的认知功能障碍。
引言
慢性短睡眠（CSS）在现代社会中普遍存在。美国疾病控制与预防中心估计，大约一半的中学生和近三分之二的高中生经常睡眠时间少于建议时长。超过36%的成年工作者报告称，每24小时内的睡眠时间少于7小时。构成睡眠环境的变量包括光线、噪音和温度。导致睡眠不足和睡眠质量差这一日益严重问题的因素，包括夜间接触LED灯泡、数字平板电脑、电视屏幕和手机的光线增加，以及轮班工作和其他工作环境因素。
流行病学研究表明，短睡眠、睡眠质量差和睡眠中断均与代谢功能障碍、心血管风险、认知障碍以及阿尔茨海默病风险增加有关。睡眠损失和中断已被证明会加速大脑衰老和阿尔茨海默病的特征。急性睡眠剥夺会增加大脑间质液中的β-淀粉样蛋白浓度，而慢性睡眠剥夺会加速两种淀粉样变性转基因小鼠模型中β-淀粉样蛋白沉积为不溶性淀粉样斑块。睡眠损失和睡眠中断还会导致认知缺陷，如注意力、决策、学习和各种类型的记忆受损。轮班工作者所经历的慢性短睡眠，会在特定神经元群体中造成神经退行性变，并增加淀粉样蛋白的产生。睡眠损失影响神经损伤和神经退行性变的细胞和分子机制尚不清楚。
我们之前已经证明，睡眠损失和睡眠中断会扰乱蛋白质稳态，尤其是在内质网中，导致信号转导通路——未折叠蛋白反应的诱导。UPR是一种适应性反应，通过激活蛋白激酶R样内质网激酶、肌醇需求酶1和激活转录因子6，来减弱蛋白质翻译、促进蛋白质降解和增加蛋白质分子伴侣活性，从而恢复蛋白质稳态。然而，UPR尤其是PERK的持续激活，会导致整合应激反应以及下游炎症和促凋亡通路的激活。值得注意的是，PERK激活调节蛋白质合成，这对记忆和认知很重要。持续的ER应激已被证明与记忆障碍有关，而缓解ER应激已知可以改善记忆。然而，ER应激诱导先于认知障碍的时间分辨率尚不清楚或未知。为了研究ER应激与认知之间的关系，我们检测了小鼠在成年早期经历慢性短睡眠如何影响其一年内的认知表现。我们的研究结果表明，慢性短睡眠会触发并维持ER应激，在认知缺陷出现之前破坏蛋白质稳态，同时加速认知衰退。
结果
慢性短睡眠加速认知衰退
我们评估了成年早期慢性短睡眠对一年衰老过程中认知表现的影响。如前所述，小鼠每周接受3天、为期8周的慢性短睡眠干预，并随着年龄增长，使用空间物体识别检测SOR测试海马依赖性学习，SOR如图1C所示。我们发现，这些小鼠的认知表现下降时间早于经历相同SOR测试的休息小鼠。最初，在CSS后4周和8周进行的SOR测试显示，休息组和睡眠剥夺组在位置偏好测试中没有差异。所有组在测试阶段都表现出对移动物体的偏好增加，这表明CSS的任何认知效应尚不明显。然而，在28周龄的第三次测试期间，休息小鼠在测试阶段对移动物体表现出更强的位置偏好，而CSS小鼠则没有。CSS小鼠如通过辨别指数（用于量化SOR中的学习）所示，无法区分移动和未移动的物体。随着年龄增长，休息小鼠在SOR测试中对移动物体表现出强烈的偏好，直到小鼠达到52周龄，此时休息小鼠在测试期间与训练期间相比，认知表现没有任何改善。52周龄休息小鼠的表现与CSS小鼠没有显著差异。
BiP下降和蛋白质稳态受损先于认知障碍
我们之前已经证明，BiP蛋白表达随年龄增长而下降，并且BiP表达下降与学习缺陷相关。基于这些观察，我们在一年实验期的不同时间点，通过免疫荧光检查了海马BiP蛋白表达。与休息小鼠相比，20-22周龄CSS小鼠海马中的BiP蛋白表达显著降低，并且在后续检查的时间点也较低。重要的是，我们的数据表明，BiP的减少先于CSS小鼠在28周龄时出现的认知表现下降。我们的数据还表明，休息小鼠的BiP也随年龄增长而下降，这与之前公布的数据一致。
免疫染色还表明，老年小鼠海马中C/EBP同源蛋白（CHOP）水平升高。CHOP，也称为Gadd153，是一种转录因子，在正常情况下通常低水平存在，但在细胞应激期间会增加。虽然我们没有发现CSS导致CHOP显著增加，但我们确实发现CHOP随年龄增长而显著增加。此外，基于CSS诱导的海马分子变化以及先前发表的文献（表明CSS导致蓝斑神经元丢失），我们还检查了蓝斑中的CHOP，这是持续ER应激的一个显著标志物。我们发现，在36周和52周时，CSS小鼠的蓝斑CHOP显著增加。此外，蓝斑神经元中的CHOP水平随年龄增长而显著增加。
整合应激效应子ATF4在28周龄CSS小鼠中增加
鉴于我们观察到休息小鼠和CSS小鼠在28周龄时出现认知行为差异，我们使用免疫荧光检查了28周时间点的海马切片中的UPR和ISR标志物p-PERK、p-eIF2α和ATF4。已知持续的ER和蛋白质稳态应激会导致PERK激活、真核翻译起始因子2α磷酸化、全局蛋白质翻译抑制以及ISR效应子ATF4的诱导。蛋白质合成的减弱和ISR的诱导与认知障碍有关。虽然免疫荧光数据显示CSS小鼠CA1区磷酸化PERK增加72%（非显著），以及CSS小鼠海马组织裂解物中p-eIF2α水平增加39.8%（非显著），但CSS小鼠海马中的ATF4显著增加。鉴于p-eIF2α的非显著变化，我们另外评估了生长停滞和DNA损伤诱导蛋白34（GADD34），这是一种使p-eIF2α去磷酸化的磷酸酶。值得注意的是，CSS小鼠的GADD34水平显著增加。
CSS在28周龄时影响突触和记忆标志物
我们接下来想确定28周龄时CSS诱导的行为变化是否与突触可塑性和记忆标志物的变化相关，因此我们测量了BDNF和磷酸化CREB（pCREB），两者都是众所周知的学习和突触可塑性标志物。海马切片的免疫染色显示，与休息小鼠相比，CSS小鼠齿状回中的pCREB水平下降了12%（非显著）。我们还发现CSS海马组织裂解物中的BDNF略有下降，刚好达到显著阈值。
神经炎症随年龄增长而增加
在观察到CSS对神经元的影响后，我们检查了大脑中的其他支持结构，即星形胶质细胞和小胶质细胞，在研究的各个时间点。海马切片中星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物IBA1的免疫染色显示，这两种标志物随年龄增长而增加。然而，在28周龄时，虽然CSS小鼠中GFAP阳性星形胶质细胞计数高于休息小鼠，但并不显著。Iba1的定量，在28周龄时，CSS小鼠切片中虽然也增加了36.2%，但也不显著。
讨论
在这项研究中，我们提出慢性短睡眠会诱导并维持内质网应激，从而导致整合应激反应。我们还假设海马记忆障碍在时间上与这种内质网应激的诱导有关。我们的研究结果表明，CSS确实会诱导内质网应激，进而影响海马记忆。空间记忆在28周龄时出现显著差异，此时CSS暴露的小鼠表现出认知表现下降，而休息小鼠则保持了其空间学习能力。通常，海马中的记忆形成被认为发生在三个关键阶段：编码、巩固和检索。睡眠通过加强记忆在编码和巩固中都起着至关重要的作用。这包括将学习到的信息转化为有意义的定性模式，并将其整合到现有的图式网络中。此外，睡眠有助于这些特性的泛化、检测统计模式以及发现潜在规则。当睡眠被打乱（如CSS）时，这些过程会受损，导致认知表现缺陷，类似于在CSS小鼠中观察到的缺陷。
我们的研究结果表明，CSS会诱导持续的内质网应激和长期的未折叠蛋白反应激活，尤其是在28周龄出现的认知衰退之前。鉴于内质网应激和UPR失调在记忆缺陷中的既定作用，这些结果表明这种失调是CSS诱导的认知衰退的关键机制。参与这一过程的一个关键因素是结合免疫球蛋白蛋白（BiP），这是一种关键的分子伴侣和UPR调节因子。在正常情况下，BiP促进正常的蛋白质折叠并防止聚集，同时结合跨膜传感器以保持UPR失活。然而，在CSS诱导的内质网应激下，错误折叠蛋白质的积累导致BiP从这些传感器上解离，激活下游UPR通路。在20-22周龄观察到的BiP水平显著下降是这种蛋白质稳态转变的关键标志，表明该系统不再能够补偿积累的错误折叠蛋白，并且通过PERK激活导致蛋白质翻译的长期抑制。由于这种减少发生在CSS小鼠在28周龄出现认知障碍之前，这表明内质网蛋白质稳态的失调是一个早期事件，先于并可能促使其后的海马功能障碍。
鉴于BiP是UPR最上游的调节因子，其耗竭可能通过激活整合应激反应来促进更广泛的适应不良应激反应。虽然在CSS诱导的内质网应激下没有立即观察到CHOP的显著增加，但观察到CHOP水平随年龄增长而显著增加，同时BiP下降。这表明，虽然CSS诱导的BiP耗竭最初破坏了蛋白质稳态，但老年小鼠更容易受到持续的、适应不良的应激反应的影响，从而导致海马功能障碍和最终的细胞死亡。尽管上游ISR介质如磷酸化PERK和磷酸化eIF2α仅显示出温和的非显著增加，但我们观察到下游ATF4的显著上调。我们还观察到GADD34的增加，这是一种应激诱导蛋白，可招募蛋白磷酸酶1特异性去磷酸化p-eIF2α。在28周龄CSS小鼠中观察到的GADD34显著增加，可能解释了在同一时间点p-eIF2α水平没有显著增加的原因。ATF4的增加与CSS小鼠中观察到的记忆缺陷同时发生，表明慢性ISR激活可能损害海马记忆巩固所需的蛋白质合成。
此外，海马并非记忆巩固的唯一组成部分。在海马后方是蓝斑，它通过提供去甲肾上腺素来调节昼夜节律和警觉性。重要的是，蓝斑神经元投射到海马释放去甲肾上腺素，这有助于编码重要信息。除了在这些CSS小鼠中观察到的CHOP水平升高外，与先前的研究（显示CHOP在蓝斑组织中随年龄和应激而增加）一致，蓝斑中的CHOP水平也随年龄增长以及CSS在后期时间点（36周和52周）显著增加。这表明蓝斑高度易受与CSS和衰老相关的适应不良应激反应的影响，可能是由于去甲肾上腺素信号向海马的传递中断，进一步导致认知衰退。
虽然慢性UPR和ISR激活导致的蛋白质合成停滞会损害认知，但海马功能是通过突触可塑性和记忆相关分子信号的破坏而特别受损的。这些机制的核心是脑源性神经营养因子（BDNF）和磷酸化CREB（pCREB）。pCREB被认为靶向诸如BDNF之类的基因来控制记忆巩固和长时程增强。先前的研究表明，具有CREB功能增强和BDNF水平升高的小鼠表现出增强的记忆形成。有趣的是，还发现CREB表达在阿尔茨海默病大脑中下调。我们在CSS小鼠中观察到，在28周龄时，pCREB水平非显著下降，而BDNF水平显著下降。这表明，记忆不仅通过慢性UPR和ISR激活受损，而且通过这些记忆相关信号通路的直接中断而受损。
除了神经元信号传导，神经炎症是CSS对大脑影响的另一个关键要素。像CSS这样的应激源会触发大脑的免疫细胞，特别是小胶质细胞和星形胶质细胞。小胶质细胞被认为是稳态扰乱的初级监视反应者，通过神经毒性和神经保护性分子信号发挥作用。星形胶质细胞是更特化的星形细胞，直接参与代谢支持和血脑屏障调节。当这些细胞转变为反应状态（称为星形胶质细胞增生症）时，记忆巩固所需的分子信号可能被破坏。研究还表明，虽然反应性星形胶质细胞和小胶质细胞可以通过尝试恢复稳态来发挥保护作用，但长期激活可能导致突触功能障碍。我们的研究结果表明，随着小鼠衰老，胶质细胞激活增加，由IBA1标记，以及星形胶质细胞增生症，由GFAP标记。虽然在28周龄时没有观察到显著变化，但两者都显示出趋势性增加。这表明，虽然反应性胶质细胞最初可能通过尝试恢复稳态来发挥保护作用，但它们的长期激活可能导致突触功能障碍。
结论
我们的研究结果表明，CSS诱导蛋白质稳态不稳定，其中20-22周龄时BiP的显著减少是28周龄观察到的认知衰退的关键先兆。这种转变触发了从适应性反应到适应不良的整合应激反应的转变。虽然上游启动子如pPERK和p-eIF2α显示出非显著增加，但它们的信号似乎最终汇聚于ATF4的显著上调。这种ISR的诱导，结合神经炎症的趋势性增加，阻断了突触可塑性所需的pCREB和BDNF信号，导致在记忆缺陷出现的同时观察到BDNF水平显著下降。衰老似乎是一个累积的应激源，阻止了内质网应激的缓解，驱动了CHOP和神经炎症的显著诱导。这种与年龄相关的适应不良效应确定了一个狭窄的治疗窗口，即在20-22周和28周之间，此时使用诸如4-苯基丁酸之类的分子伴侣药物干预UPR，可能阻止从可管理的细胞应激向永久性的年龄相关记忆丧失的转变。
材料与方法
小鼠
动物实验按照宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。小鼠的饲养如前所述。小鼠饲养在23°C、12:12小时光照/黑暗循环的环境中，可自由获取食物和水。
慢性短睡眠方案
CSS方案在宾夕法尼亚大学进行，符合美国国立卫生研究院实验动物福利办公室政策以及宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的规定，如前所述并略有修改。简而言之，8周龄的雄性C57BL/6J小鼠以每组5只饲养，接受CSS或休息对照条件，为期8周。CSS通过将小鼠及其同窝伴侣放置在新的丰富环境中进行，当范式中的小鼠变得安静时，更换攀爬玩具。在CSS期间，由一名或两名研究人员持续观察小鼠，每人直接观察小鼠1-2小时轮班，以确保每只小鼠连续8小时处于活跃清醒状态。该CSS范式已被证明不会升高血液皮质酮水平。小鼠每周连续3天接受CSS，在光照期的前8小时进行，此时小鼠...通常处于睡眠状态。休息对照组则每周3天、每天暴露于相同环境1小时，持续8周。
空间物体识别测试
空间物体识别测试是一种成熟的海马依赖性空间记忆测试。在测试前，小鼠被连续三天每天一起放入测试装置中一小时以适应环境。测试分为两个阶段：第一阶段是训练阶段，将两个相同的物体放置在装置的一侧。小鼠被单独放入装置中10分钟，记录所有互动（嗅闻、触碰等）。训练结束后，小鼠返回笼中静置90分钟。测试阶段开始前，将其中一个相同的物体移动到装置的另一侧。测试阶段小鼠被放入装置，操作类似训练阶段，但仅持续3分钟。再次测量与每个物体的互动时间。辨别指数的计算如前所述，用于衡量小鼠区分移动和未移动物体的能力。
免疫组织化学分析
固定后的半脑冠状切片用冷冻切片机切成40微米厚，如前所述。每隔一张切片放入含有防冻剂的24孔板中进行自由漂浮免疫组织化学染色，并保存于-20°C。所有标志物比较每组n=4-5只动物。
免疫荧光
免疫荧光染色按先前描述进行。一抗如下：pCREB (ser133) (1:300, Cell Signaling 87G3)；CREB (1:200, Cell Signaling 86B10)；pPERK (Thr980) (1:200, Bioss bs-3330R)；ATF4 (1:500, ProteinTech, 60035-1-Ig)；BiP/anti-KDEL (1:1000, Enzo Life Sciences ADI-SPA-827F)；GFAP (1:300, Cell Signaling 3670)；IBA-1 (1:300, Cell Signaling 17198)；Tyrosine Hydroxylase (1:1000, Abcam, ab113)。二抗如下：Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG (1:500)；Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG (1:500)；Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (1:500)；Alexa Fluor 594 驴抗羊 IgG (1:500)。
IF图像的定量分析
共聚焦图像采集如前所述，使用Leica SP5/AOBS显微镜。共聚焦激光强度、波长范围、检测器增益、曝光时间、放大器偏移以及每个抗原目标在切片内的焦平面深度均在比较切片间标准化。共聚焦图像定量如前所述。简言之，每只动物成像3-4个切片（每组n=4-5只动物）。使用ImageJ软件，将图像转换为8位灰度，并标准化所有图像的检测阈值以检测百分比面积。测量目标区域内的百分比面积和平均灰度，并对每只小鼠的这些测量平均值进行分析。
Western Blot
冷冻脑组织按先前描述的方法准备用于Western blot分析。简言之，在冰上用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液匀浆脑组织。离心后，用BCA蛋白测定法确定每个样品的蛋白质浓度，并制备每个样品含20µg蛋白质的样品。SDS-PAGE凝胶电泳如前所述，通过Odyssey扫描仪上的红外成像进行蛋白质条带成像和定量。对于所有标志物，我们比较每组n=5-8只动物。一抗如下：GADD34 (1:500, Protein Tech 10449-1-AP)；peIF2α (1:100, Cell Signaling 3597S)；BDNF (1:500, Abcam ab108319)；β-Actin (1:2000, Santa Cruz sc-47778)。二抗如下：LiCor IRDye 680RD 山羊抗小鼠 (1:10,000)；LiCor IRDye 800RD 山羊抗小鼠 (1:10,000)；LiCor IRDye 800RD 山羊抗兔 (1:10,000)；Odyssey IRDye 680 山羊抗兔 (1:10,000)。
资助
R01 AG064231（睡眠损失神经损伤在阿尔茨海默病中的细胞和分子基础）
作者贡献
RK执行实验和 behavioral 数据分析。KS撰写手稿，进行IHC、Western blot实验和数据分析。ES进行Western blot实验。NN构思并设计研究，提供资源，解释数据，编辑并修改手稿。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据和材料可用性
支持本手稿结论的原始数据将在请求时提供。
资助信息声明
美国国立卫生研究院，R01 AG064231；宾夕法尼亚大学，CEET Pilot。
参考文献
（参考文献列表已省略，因其包含大量URL及外部链接，按要求全部删除。）
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