摘要
背景： 骨髓作为造血和免疫调节的关键器官，其与年龄相关的改变对理解心血管疾病相关的炎症过程至关重要。值得注意的是，衰老与骨髓源性心血管保护性CD34+造血干/祖细胞(HSPCs)动员能力下降相关，导致循环中细胞频率降低和心血管结局较差。CD34+ HSPCs的药理动员剂(粒细胞集落刺激因子G-CSF、CXCR4拮抗剂AMD3100)和交感神经信号刺激剂(去甲肾上腺素NE)主要通过作用于CD146+骨髓基质细胞(BMSCs)，这些细胞是这一过程中的关键调节者。在本研究中，我们开发了一个简化的人体外骨髓实验模型，以评估衰老对CD146+ BMSCs调控CD34+ HSPCs动员的影响。
方法： 从29名人类受试者中分离CD146+ BMSCs，分为中年人(≤66岁；N=13)和老年人(≥75岁；N=16)。功能测定使用来自单一供体(女性，64岁)的骨髓HSPCs。通过在跨孔系统中共培养CD146+ BMSC和CD34+ HSPCs，建立了体外骨髓简化实验模型。经动员剂处理后，评估了CD146+ BMSCs的活力、HSPC迁移能力、转录组、代谢和旁分泌活性。
结果： 在使用中年受试者来源的CD146+ BMSC模型中，AMD3100增强了HSPC迁移能力，但在老年人来源的细胞中则没有这种效果。RNA测序鉴定出9个与年龄相关的基因，其中NRK下调，而PDK4、AQP1和LMO2在老年人CD146+ BMSCs中表达上调。此外，两组之间对动员剂处理表现出不同的基因表达反应。老年人CD146+ BMSCs来源的细胞条件培养基对单核细胞显示出更强的趋化作用，并且VCAM-1水平升高。未观察到与年龄相关的氧化呼吸差异。
结论： 本研究开发了一个骨髓体外共培养系统，用于研究CD146+ BMSC依赖的CD34+细胞动员的个体特异性调控，揭示了衰老对CD146+ BMSC及其对动员剂反应的复杂影响。
1 引言
骨髓(BM)微环境的年龄相关重塑已成为系统性炎症和心血管脆弱性的关键决定因素(Mangialardi等, 2014; Bonora等, 2022; Kohler等, 2009; Aranda等, 2025)。
作为造血和免疫祖细胞的主要储存库，骨髓通过调控CD34+造血干和祖细胞(HSPCs)的保留和动员，为心血管稳态做出贡献。在老年人中，循环CD34+细胞的显著减少与不良心血管结局相关，这激发了人们对旨在增强祖细胞动员的药理策略的兴趣(Moresi等, 2005; Shimizu等, 2020; Cohen等, 2013; Patel等, 2015; Albiero和Fadini, 2018)。一致地，与来自年轻动物的细胞相比，老年小鼠衍生的早期造血干细胞在骨髓内定位更远离骨内膜区域，尽管表现出对基质细胞的粘附减少，这表明衰老改变了它们在骨髓微环境中的空间组织(Kohler等, 2009)。
HSPCs向不同谱系的自我更新、增殖、迁移和分化受到严格调控，以在稳态和应激条件下维持稳态。这些协调的细胞命运决定不仅依赖于细胞内在机制，包括转录、表观遗传和代谢程序，还依赖于骨髓微环境提供的细胞外信号(Mosteo等, 2021; Ferland-McCollough等, 2018; Spinetti等, 2013; Dang等, 2015)。
在分子层面，CD34+细胞动员受骨髓内趋化保留信号和粘附相互作用之间的平衡调控。骨髓CXCL12(也称为基质衍生因子1α，SDF-1α)水平的降低是CD34+细胞外流的主要驱动力，而与基质和血管成分的稳定锚定则由细胞粘附分子(CAMs)介导。因此，粘附相互作用的蛋白酶介导破坏是动员的关键步骤。同时，细胞内氧化还原平衡已成为额外的调控层，活性氧(ROS)水平的增加通过调节参与粘附、迁移和微环境响应的信号通路促进CD34+ HSPC动员(Albiero和Fadini, 2018; Itkin等, 2016; Chang等, 2022)。
CD34+细胞的药理动员是骨髓移植临床医学中的关键过程，并正在探索作为增强心血管疾病恢复的治疗策略(Albiero和Fadini, 2018)。在动员剂中，最广泛使用的是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，它通过促进基质和血管隔室的广泛重塑间接诱导动员，导致CXCL12可用性降低和细胞外基质组成改变(Albiero和Fadini, 2018; Chang等, 2022; Day等, 2015)。相比之下，CXCR4拮抗剂AMD3100(plerixafor)直接作用于CXCR4/CXCL12轴，迅速破坏HSPCs在微环境中的保留。此外，交感神经系统信号，由去甲肾上腺素(NE)介导，也降低了骨髓CXCL12水平。尽管这些途径具有临床相关性，但尚不清楚动员能力的年龄相关缺陷是源于HSPCs的内在改变还是骨髓微环境响应能力的受损(Albiero和Fadini, 2018; Lucas等, 2012)。
骨髓基质细胞(BMSCs)是通过CXCL12分泌和塑造骨髓血管微环境的分子和结构特性来调控CD34+ HSPC迁移的关键调节者。在异质性BMSC群体中，CD146+ BMSCs，即周细胞，构成了一个整合到血管微环境中的血管周围亚群，对CD34+ HSPC调控至关重要(Bowles等, 2020; Tormin等, 2011; Espagnolle等, 2014; Harkness等, 2016; Walenda等, 2010; Crisan等, 2008)。然而，原代人CD146+ BMSCs对CD34+细胞动员的具体贡献，特别是在年龄依赖性背景下，尚未在受控的人体外系统中直接研究。
直到最近，对骨髓微环境的研究主要依赖小鼠模型，这些模型在将发现转化为人类生理方面存在固有限制(Mosteo等, 2021)。生物材料和生物工程的进展使能够重建人体外骨髓微环境的选定元素；然而，忠实再现血管微环境的架构、细胞组成、细胞-细胞相互作用、结构差异以及细胞外基质组成，以及生长因子和细胞因子的可用性仍然具有挑战性(Busch等, 2024)。现有的体外模型主要专注于CD34+ HSPC的植入、增殖或恶性细胞归巢。当研究CD34+细胞迁移时，BMSCs很少被包括在内；相反，内皮细胞更常被使用(Campanile等, 2023; de Barros等, 2010; Mohle等, 1997; Aleman等, 2019; Voermans等, 2001; Kessinger等, 2005; Kim和Broxmeyer, 1998; van Buul等, 2002; Mohle等, 1999; Aiuti等, 1997)。因此，原代人CD146+ BMSCs与CD34+ HSPCs在定向迁移过程中直接相互作用的分子决定因素仍仅部分了解。
在这里，我们开发了一个基于原代CD146+ BMSCs的人体外骨髓简化实验模型，直接探究衰老和微环境特异性调控CD34+ HSPC迁移对临床相关动员刺激的反应，这对个性化再生策略具有重要意义。
2 材料与方法
2.1 原代人骨髓细胞分离和处理
骨髓细胞是从股骨头部分离的，这些股骨头部在获得书面知情同意后被用作手术废弃物，用于髋关节置换术。应用的排除标准包括：签署知情同意前3个月内参加其他临床试验；近期急性心肌梗死或中风；与预期寿命少于2年相关的临床状况；药物或酒精滥用；可能损害对研究的依从性的任何其他状况；以及未能提供书面知情同意。受试者根据年龄分为两组：中年人(MA，56 ± 6.16岁)和老年人(OA，79.88 ± 3.85岁)。受试者特征和样本应用总结在表1中。所有程序均按照《赫尔辛基宣言》进行，并获得当地伦理委员会批准(方案编号n. 540/2022)。股骨头部被挖掘以收集骨髓浆，经过充分洗涤，通过100-μm网过滤，并使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇，目录号# 10771)进行密度梯度分离。单核细胞(MNCs)以1×10^5至1×10^6个细胞的密度接种(取决于细胞活力)，并在完全培养基中培养7天，完全培养基是指血管细胞基础培养基(ATCC，目录号PCS-100-030 VCBM)补充内皮细胞生长试剂盒(ATCC，目录号ECGK-VEGF PCS-100-041)、热灭活胎牛血清(Gibco，目录号A5256701)至最终浓度20%、青霉素-链霉素(Euroclone，目录号ECB3001D)至最终浓度分别为100 U/mL和100 μg/mL。细胞随后扩增，在达到汇合后，使用CD146+磁珠阳性选择(Miltenyi Biotec，目录号130-093-596)分离CD146+ BMSCs，并在含10% DMSO的FBS溶液中冷冻保存。BM CD34+ HSPCs从一名受试者(女性，64岁)中使用Diamond CD34+磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-094-531)根据制造商说明进行分离。简而言之，首先通过阴性选择从单核细胞获得谱系阴性细胞，然后通过阳性选择分离CD34+细胞，随后冷冻保存。骨髓细胞分离方案如补充图S1A所示。
2.2 骨髓细胞培养和处理
传代1的CD146+ BMSCs在FBS中解冻，离心，以5×10^3至5×10^4个细胞/cm^2的密度接种，取决于细胞活力。细胞在培养至汇合后用于实验，仅在传代3时使用。
骨髓衍生的CD34+ HSPCs解冻并扩增在StemMACS™ HSC扩增培养基XF，人(Miltenyi Biotec，目录号130-100-473)中，补充StemMACS™ HSC扩增鸡尾酒，人(Miltenyi Biotec，目录号130-100-843)。细胞扩增2周，细胞密度维持在5×10^5至5×10^6个细胞/mL之间。
在完全培养基中，必要时CD146+ BMSCs用100 μM AMD3100(Tocris，目录号# 3299)、10 ng/mL G-CSF(西格玛-奥德里奇，目录号# SRP3263)或500 ng/mL去甲肾上腺素(NE；西格玛-奥德里奇，目录号# A7257)处理48小时。在对照条件下，细胞仅在完全培养基中培养。
2.3 流式细胞术
通过流式细胞术评估分离的CD146+ BMSCs和CD34+ HSPCs的身份。对于CD146+ BMSC分析，细胞在用于实验的传代进行染色。简而言之，冻存细胞在传代2解冻，扩增，在传代3时解离并染色；分析了总计0.5×10^5个细胞。对于CD34+ HSPC染色，使用1×10^5个细胞。样品在50 μL MACS缓冲液(PBS含0.5% BSA和2 mM EDTA)中重悬，并用抗体(1:50工作稀释度)在室温下染色20分钟。随后用1 mL MACS缓冲液洗涤一次，重悬在0.5 mL MACS缓冲液中，并使用BD LSRFortessa™ X-20细胞分析仪进行流式细胞术分析，配备适当的激光/检测器配置。使用了以下抗体：PDGFRB/CD140b-APC-Vio770(Miltenyi，目录号130-129-294)，CD146-PE-Vio615(Miltenyi，目录号130-125-731)，CD45-VioBright B515(Miltenyi，目录号130-110-640)，CD90-PE-Vio770(Miltenyi，目录号130-114-862)，CD31-VioBlue(Miltenyi，目录号130-110-674)，和CD34-PE(Miltenyi，目录号130-120-515)。对于CD146+ BMSC特征描述，使用了所有列出的抗体。CD34+ HSPCs基于CD45和CD34表达来鉴定，细胞活力使用Zombie NIR™可固定活力试剂盒(BioLegend，目录号423106)评估。约71%扩增的CD34+ HSPCs表现出CD45^dim CD34+免疫表型，证实了BM-HSPC群体的有效富集(补充图S1B，粉红色突出显示的子面板)。CD146+ BMSC身份通过白细胞标志物CD45(0.024% ± 0.026)和内皮标志物CD31(0.26% ± 0.36)以及CD34(0.43% ± 1.03)的缺失来确认，同时存在间充质标志物CD90(82.58% ± 5.79)和周细胞相关标志物CD146(79.12% ± 8.98)以及PDGFRβ(94.72% ± 2.56)，跨越N = 3个样本(补充图S1B，黄色突出显示的子面板)。
2.4 免疫荧光分析
CD146+ BMSCs通过免疫荧光分析进一步特征描述。在传代3时，CD146+ BMSCs以5×10^3个细胞/cm^2的密度接种在μ-Slide VI(IBIDI，目录号980606)中，并在48小时后用4%甲醛在室温下固定15分钟。随后用PBS洗涤三次，并在含0.1% Tween-20%和5%山羊血清的PBS中于室温下封闭和透化1小时。随后，在4°C下与以下一抗(1:100工作稀释度)孵育过夜：PDGFR-β(Abcam，目录号ab154556，兔)，CD146(Thermo Fisher Scientific，目录号MA5-29414，兔)，和NG2(Abcam，目录号ab83508，鼠)。NG2与其它一抗中的每一个共同染色。在三次PBS-T洗涤后，细胞在室温下与1:500二抗抗鼠Alexa Fluor™ 488(Thermo Fisher Scientific，目录号A-11001)和抗兔Alexa Fluor™ 555(Thermo Fisher Scientific，目录号A-21428)孵育2小时，洗涤，并用DAPI(西格玛-奥德里奇，目录号D9542)复染。
2.5 用于功能测定的细胞
EA.hy926细胞(ATCC，目录号CRL-2922)，一种人内皮衍生细胞系，在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)的DMEM中培养，在含5% CO2的加湿培养箱中。
外周血单核细胞(PBMCs)从新鲜人外周血(方案编号n. 5451，2023年9月15日)中通过Ficoll-Paque PLUS(或Histopaque-1077)的密度梯度离心分离。血液用PBS稀释1:1，分层覆盖在密度介质上，随后在室温下以400 g离心30分钟，不使用刹车。收集单核细胞层，用PBS洗涤两次，并重悬用于后续分析。
2.6 细胞条件培养基收集
来自不同年龄受试者的CD146+ BMSCs在12孔板中以1.5×10^4个细胞/cm^2的密度接种。24小时培养后，用AMD3100、G-CSF、NE或仅完全培养基处理细胞。随后用PBS洗涤细胞，并在800 μL血管基础培养基中孵育。24小时后，收集培养基，以1,000 g离心10分钟，上清液作为细胞条件培养基(CCM)收集。
2.7 活力测定
CD146+ BMSCs从每位受试者接种在96孔板中，每孔2.5×10^4个细胞，共三份。24小时后，用AMD3100、G-CSF、NE或仅完全培养基在上述浓度下处理48小时。然后通过MTT活力测定评估细胞代谢活性。简而言之，完全培养基被替换为补充1% FBS的血管细胞基础培养基，培养24小时，随后用PBS洗涤。向每孔添加100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)，并在黑暗中孵育3小时。使用含4 mM HCl、0.05%(v/v)Triton X-100的异丙醇的MTT洗脱液，溶解甲臜晶体。20分钟后，使用微孔板读数仪在590 nm处测量吸光度。
CD34+ HSPC在24小时处理后的活力通过手动台盼蓝细胞计数评估，并表示为存活细胞的百分比。
2.8 体外骨髓简化实验模型研究CD146+ BMSCs依赖的CD34+ HSPC迁移
如图1A所示，CD146+ BMSCs以2.2×10^4个细胞/cm^2的密度接种在24孔跨孔插入物上，孔径为8-μm(Corning，目录号3422)。24小时后，CD146+ BMSCs用AMD3100、G-CSF、NE或仅完全培养基处理48小时。在迁移测定当天，使用EVOM手动伏特欧姆计(World Precision Instruments，型号EVM-MT-023-01)按照制造商说明测量跨孔电导电阻，评估CD146+ BMSC层的完整性。跨上皮/内皮电导电阻(TEER)通过将测量的电阻(Ω)乘以膜表面积(cm^2)计算。
CD146+ BMSCs用CellTracker™ Blue CMAC(Thermo Fisher Scientific，目录号C2110)在最终浓度25 μM下标记，CD34+ HSPCs用Calcein Red-Orange, AM(Life Technologies，目录号C34851)在500 nM下标记；两种染色均在37°C下进行45分钟。标记的CD34+ HSPCs洗涤并重悬在血管细胞基础培养基中。完全培养基在基础室中用作趋化剂，而仅血管细胞基础培养基被用作阴性对照(NC)。作为内部参考，评估了CD34+ HSPC向趋化剂的基础迁移，该迁移在没有CD146+ BMSC层且未用AMD3100、G-CSF、NE处理的情况下进行。
向顶端室添加200 μL血管细胞基础培养基，并将50 μL中1×10^4个CD34+ HSPCs接种到每个插入物上。在迁移测定过程中维持处理。2小时后，停止迁移，并使用Leica DM IL Fluo显微镜在×4放大倍数下获取孔底部五个图像。使用ImageJ软件量化迁移细胞。结果表示为相对于阳性对照条件的迁移细胞百分比，定义为在没有CD146+ BMSCs的情况下迁移。此外，为了评估骨髓简化实验模型的稳健性，计算了每个样本在每种条件下技术重复的变异系数(CV)，使用公式：技术重复的标准差除以它们的平均值，乘以100。
2.9 RNA测序和转录组分析
CD146+ BMSCs从每位受试者以1.5×10^5个细胞/孔的密度接种在6孔板中。培养3天后，使用miRNeasy试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany；目录号217084)分离总RNA，包括柱上DNase消化步骤。随后用乙醇沉淀RNA以进一步提高纯度。
在文库制备前，通过评估数量、质量和完整性来检查RNA样品。使用Qubit荧光计(Life Technologies)确定RNA浓度，使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Fisher Scientific)评估RNA纯度，使用Agilent 4200 TapeStation系统(Agilent Technologies)评估完整性。根据制造商说明，使用400 ng总RNA作为输入，使用TruSeq Stranded Total RNA试剂盒(Illumina)生成测序文库。在NovaSeq 6,000平台(Illumina Inc.)上以最终浓度1.3 pM进行配对端模式(2×100 bp)测序。
如先前所述(Melone等, 2025)，对原始测序读数进行预处理。
简而言之，使用bcl2fastq(v2.20.0.422; Illumina, SCR-015058)进行读数解复用，并使用FastQC( 2011)。使用STAR(v2.7.11b)将清洗后的读数对齐到人类参考基因组(hg38)(Dobin等, 2013)。使用featureCounts(v2.0.1)，使用GENCODE v46主要组装注释进行基因表达定量。支持超过10个原始计数的转录本被认为是有表达的。
使用R中的DESeq2软件包(v1.46.0)进行差异表达分析(Love等, 2014)，使用默认设置，保留绝对倍数变化≥1.5和调整后p值≤0.05的转录本。使用R中pheatmap库(v 1.0.13)创建热图，使用标准化计数的log10并按行缩放。
2.10 生物信息学分析
使用中等置信度交互评分(0.4)，对所有9个差异表达基因最多5个蛋白质进行STRING分析。使用错误发现率(FDR)截止值为0.05进行基因本体(GO)生物过程富集分析。
2.11 实时聚合酶链反应
CD146+ BMSCs(1.5×10^5个细胞/孔)从每位受试者接种在6孔板中。24小时后，用动员剂处理48小时，随后使用RNA纯化试剂盒(miRNeasy试剂盒, QIAGEN, Hilden, Germany, 目录号217084)按照制造商说明提取总RNA。使用NanoDrop-1000分光光度计进行定量，并通过OD 260-280读数检查RNA质量。使用TaqMan®反转录试剂盒(Thermo-Fisher)，使用Oligo d(T)16在50 μL最终体积中将0.5 μg RNA反转录。随后，将后者0.5 μL用于每个聚合酶链反应。使用Sybr Green Master Mix在10 μL最终体积中，通过QuantStudio 6 flex(Applied Biosystems, Foster City, CA, United States of America)检测系统进行实时qPCR。数据以Ct值获得，并使用2^−ΔΔCT方法进行分析，计算每个转录本相对于成人组平均值或未处理样品的倍数变化，并使用组蛋白3作为参考基因。使用的特异性引物如下：组蛋白3的正向5'-GTG AAG AAA CCT CAT CGT TAC AGG CCT GGT-3'和反向5'-CTG CAA AGC ACC AAT AGC TGC ACT CTG GAA-3'；TMEM204的正向5'-AGG TGG ACG CAC ATG ACT GTG A-3'和反向5'-AGG TTG CAG GCG CGC ATC ATG-3'；NRK的正向5'-CAG GCT GAA GTC CAG ATA GAG C-3'和5'-GTG CAT GAT CCT GGT TGT TAG GC-3'；HS6ST1的正向5'-ACT GGA CCG AGC TCA CCA ACT G-3'和反向5'-GTC TCG TAG CAG GGT GAT GTA G-3'；ALOX15B的正向5'-CAA TGC CGA GTT CTC CTT CCA TG-3'和反向5'-TGA TGT GCA GGG TGT ATC GGG T-3'；ENSG00000213058的正向5'-ATA GGA CCA AGA CCC CTG GA-3'和反向5'-GGT GAT GTC CTC AAT CTG CCT-3'；PDK4的正向5'-AGG TGG AGC ATT TCT CGC GCT A-3'和反向5'-GAA TGT TGG CGA GTC TCA CAG G-3'；APOE的正向5'-GGG TCG CTT TTA GGA TTA CCT G-3'和反向5'-CAA CTC CTT CAT GGT CTC GTC C-3'；AQP1的正向5'-TAT GCG TGC TGG CTA CTA CCG A-3'和反向5'-GGT TAA TCC CAC AGC CAG TGT AG-3'；LMO2的正向5'-GCG CCT CTA CTA CAA ACT GGG C-3'和反向5'-CTC ATA GGC ACG AAT CCG CTT G-3'；VCAM-1的正向5'-GAT TCT GTG CCC ACA GTA AGG C-3'和反向5'-TGG TCA CAG AGC CAC CTT CTT G-3'；CXCL12的正向5'-CTC AAC ACT CCA AAC TGT GCC C-3'和反向5'-CTC CAG GTA CTC CTG AAT CCA C-3'；MMP1的正向5'-ATG AAG CAG CCC AGA TGT GGA G-3'和反向5'-TGG TCC ACA TCT GCT CTT GGC A-3'；MMP2的正向5'-AGC GAG TGG ATG CCG CCT TTA A-3'和反向5'-CAT TCC AGG CAT CTG CGA TGA G-3'；CD44的正向5'-CCA GAA GGA ACA GTG GTT TGG C-3'和反向3'-ACT GTC CTC TGG GCT TGG TGT T-3'；PPARG2的正向5'-AGC CCT GCG AAAG CCT TTT GGT G-3'和反向5'-GGC TTC ACA TTC AGC AAA CCT GG-3'；ICAM-1的正向5'-AGC GGC TGA CGT GTG CAG TAA T-3'和反向3'-TCT GAG ACC TCT GGC TTC GTC A-3'；KITLG的正向5'-CTG GAG ACT CCA GCC TAC ACT G-3'和反向5'-CTG CCC TTG TAA GAC TTG GCT G-3'；Tie2/TEK的正向5'-GGT CAA GCA ACC CAG CCT TTT C-3'和反向5'-CAG GTC ATT CCA GCA GAG CCA A-3'；PRX1的正向5'-CTG CCA AGT GAT TGG TGC TTC TG -3'和反向5'-AAT GGT GCG CTT CGG GTC TGA T -3'；SOD2的正向5'-TCC ACT GCA AGG AAC AAC AG-3'和反向5'-TAA GCG TGC TCC CAC ACA T-3'；GCLC的正向5'-GGA AGT GGA TGT GGA CAC CAG A-3'和反向5'-GCT TTG TAG TCA GGA TGG TTG CG-3'。数据以平均值±标准差(SD)表示，如指示。
2.12 CCM诱导的迁移测定
使用CIM-plate进行PBMCs迁移，CIM-plate是一个16孔改进的Boyden室，由上室和下室组成，可扣合形成紧密密封。从患者中分离的3×10^5个PBMCs(如上文"用于功能测定的细胞"部分所述)在CIM-plate-16的上室中接种于RPMI培养基中，处理过的(G-CSF、AMD3100、NE)或未处理的中年人/老年人CD146+ BMSCs的CCM添加到下室中。RPMI补充10% FBS作为趋化剂添加到下室(阳性对照)，而基础RPMI作为阴性对照添加到下室。监测细胞迁移长达4小时。下室中迁移的细胞使用Leica光学显微镜成像，并通过用Hoechst 33,342(0.2 μg/mL)染色10分钟进行量化。在345 nm激发波长下，在460 nm测量荧光。
2.13 ELISA测定
从暴露于或不暴露于G-CSF、AMD3100或NE的中年人/老年人CD146+ BMSCs中分离上清液，并用于ELISA测定。使用特异性试剂盒(#DSA00, #DY809-05, 和#DY720, R&D Systems, Minneapolis, MN, United States of America)，按照制造商说明，测量由CD146+ BMSCs释放的可溶性蛋白(包括CXCL12、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1))的量。
2.14 活性氧(ROS)测量
处理过(G-CSF、AMD3100、NE)或未处理的中年人/老年人CD146+ BMSCs的CCM培养的汇合内皮细胞(ECs)使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定细胞内ROS。简而言之，细胞与10 μM DCFH-DA(在37°C下30分钟)孵育，用PBS洗涤，DCF荧光发射在激发波长495 nm下，在96孔微孔板读数仪(GENios, Tecan)中于530 nm处检测。在DCF测量后，细胞进一步与Hoechst 33,342(0.2 μg/mL)孵育10分钟，荧光在345 nm激发波长下于460 nm测量。ROS水平表示为DCF/Hoechst荧光单位。
2.15 代谢分析
在中年人和老年人的CD146+ BMSCs中进行代谢分析，无论是否用AMD3100、G-CSF或NE处理48小时。通过氧消耗率(OCR；pmol/min)直接在Seahorse XFe24分析仪(Agilent, CA, United States of America)中测量线粒体呼吸。按照Agilent协议(Seahorse XF细胞线粒体应激测试试剂盒用户指南)执行滴定和代谢测试，使用Xfe 24孔。在测定前一天，传感器盒使用Seahorse XF校准液，pH 7.4(Agilent)，在37°C培养箱中水合过夜。在测定当天，在使用前将测定培养基置于37°C培养箱中。在CD146+ BMSCs计数并重悬在测定培养基中后，它们以1×10^4个细胞的密度在Seahorse细胞培养板中以四份接种。接种细胞后，将板在组织培养罩中在室温下放置60分钟，以最小化细胞生长边缘效应，如Agilent用户指南所推荐。
在测定当天，用温热测定培养基替换细胞培养板中的细胞培养生长培养基，使用多通道移液器，并将细胞培养板置于37°C无CO2培养箱中45分钟至1小时。在此孵育期间，将10×浓缩药物加载到各自的注射端口。
然后将含有研究药物的传感器盒插入分析仪进行校准。一旦分析仪校准，校准板被含有细胞的微孔板替换，并启动测定协议。
对于CD146+ BMSCs，呼吸储存液以下顺序加载到药物端口中：(A)寡霉素(最终1.5 μM)，(B)FCCP(最终2.0 μM)，和(C)鱼藤酮A + 抗霉素A(最终0.5 μM)。
通过仪器注射端口顺序添加特定的电子传递链调节剂，询问线粒体氧化磷酸化。首先，寡霉素抑制ATP合酶，揭示用于ATP产生的基础呼吸比例。接下来，解耦剂FCCP破坏质子梯度以引发最大呼吸并确定备用呼吸能力。最后，鱼藤酮和抗霉素A(Rot/AA)分别阻断复合物I和III，以量化非线粒体氧气消耗。从这些扰动中，该测定产生定量参数-基础呼吸、ATP连接呼吸、质子泄漏、最大呼吸、备用容量和非线粒体呼吸-使能够详细表征活细胞中的线粒体功能和功能障碍。
2.16 统计分析
使用适当的非参数检验进行统计分析。中年人(MA)和老年人(OA)组之间的比较使用Mann-Whitney U检验进行。除非另有说明，同一组内(MA或OA)多个处理条件之间的比较使用Kruskal-Wallis检验进行。数据以个体数据点显示，中位数用线表示。p < 0.05，p < 0.01和p < 0.001与对照组相比。
3 结果
3.1 体外骨髓建模允许研究供体年龄驱动的CD146+ BMSC介导的CD34+ HSPC迁移差异
为了研究血管周围BMSCs在CD34+ HSPC动员和动员药物作用中的贡献，开发了一个基于人CD146+ BMSCs的体外骨髓简化实验模型，该模型在跨孔系统中培养。在体外共培养系统中测试动员药物之前，研究了它们对CD146+ BMSCs和BM CD34+ HSPCs细胞活力的影响。结果显示，选定剂量的AMD3100、G-CSF或NE药物处理不影响细胞活力(补充图S2)。
从随机选择的男性样本中分离的CD146+ BMSCs，这些样本来自中年人(MA)或老年人(OA)受试者(N = 3)(表1)，接种在可渗透膜的上侧。骨髓简化实验模型首先通过TEER测量评估屏障完整性，这揭示了CD146+ BMSC层渗透性在对照和动员剂处理条件之间没有差异(补充图S3)。模型功能性通过测量BM衍生的CD34+ HSPCs在完整培养基作为趋化刺激下对CD146+ BMSC屏障的定向迁移来评估，以相对于在没有CD146+ BMSC屏障的情况下迁移的百分比表示，用作内部参考(图1A)。我们的体外共培养系统在技术重复中表现出一致的变异系数(16.77% ± 12.74，平均值±SD)，表明良好的可重复性和稳健性。虽然CD34+ HSPC迁移在每位受试者内的技术重复中高度可重复，但它表现出显著的个体间变异性，支持该系统在个性化医学应用中的适用性。三名中年人中有两名在AMD3100处理下表现出CD34+ HSPC迁移显著增加，而第三名中年人在G-CSF处理下表现出迁移增加的非显著趋势。值得注意的是，对AMD3100无反应的受试者表现出基础迁移活性显著升高(对照，约350%迁移细胞)，与另外两名中年人相比，他们在基础条件下迁移细胞少于50%。相反，在老年人组中，三名受试者中只有一名在药物处理下表现出迁移增加的非显著趋势(OA2)。有趣的是，在一部分受试者中(MA3，OA1，OA2)，在存在CD146+ BMSCs的情况下，CD34+ HSPC迁移高于缺乏CD146+ BMSCs的条件，如迁移细胞值超过100%所突出显示，表明CD146+ BMSCs对CD34+ HSPC迁移的供体依赖性效应(图1B)。总体而言，这些数据表明CD146+ BMSCs在调控CD34+ HSPC迁移中起关键作用，并表明来自老年人受试者的CD146+ BMSCs对AMD3100处理的反应较差。
3.2 衰老导致CD146+ BMSC中NRK下调以及PDK4、AQP1和LMO2上调
迁移测定显示动员剂对老年人受试者衍生的CD146+ BMSCs诱导的迁移影响较小或没有影响(图1B)。为了调查这是否是由于中年人和老年人受试者之间基因表达的差异，我们对CD146+ BMSCs进行了RNA测序分析。RNA测序分析揭示了在老年人CD146+ BMSCs中，TMEM204、NRK、HS6ST1和ALOX15B显著下调，以及ENSG00000213058、PDK4、APOE、AQP1和LMO2显著上调(N = 5，其中60%为女性)，如图2A热图所示。
STRING分析未识别出9个RNA测序衍生差异表达基因(DEGs)之间的直接相互作用(补充图S4A)。然而，对前30个DEGs按未调整p值排名的基因本体分析表明血管相关基因富集(补充图S4B)。这与当前文献一致，该文献强调了衰老对血管功能和血管生成的影响(Ungvari等, 2018)，以及BMSCs在年龄相关血管功能障碍中的直接参与(Duscher等, 2014)。
使用具有平衡性别分布的RNA(表1)，Real Time PCR分析验证了NRK、PDK4、AQP1和LMO2的差异表达(MA: N = 11，OA: N = 12)(图2B)。
此外，我们随机选择了一组受试者，将分析扩展到已知参与BM细胞动员的基因，包括CAMs、氧化还原稳态相关基因、蛋白酶和趋化因子CXCL12(MA: N从5到11，OA: N从6到12；取决于特定基因)。与RNA测序数据一致，该数据未将它们确定为DEGs，在比较来自中年人和老年人受试者的CD146+ BMSCs衍生的选定基因相对表达时，未观察到统计学显著差异(图2C)。
3.3 AMD3100、G-CSF和去甲肾上腺素以年龄依赖的方式不同地调节CD146+ BMSCs中的基因表达
为了识别与观察到的对AMD3100(图2B)处理的CD34+ HSPCs迁移的不同反应相关的CD146+ BMSCs中的关键分子变化，我们分析了选择的年龄调节、迁移和氧化还原相关基因对动员剂处理的基因表达(图3)。有趣的是，如迁移测定所观察到的，对动员剂的依赖年龄特异性未处理对照的动员剂依赖影响，在老年人和中年人受试者之间是不同的。特别是，AMD3100处理在中年MA衍生的细胞中引起NRK表达增加，而在老年人中导致VCAM-1表达增加以及AQP1、LMO2和CD44表达降低，与未处理对照细胞相比。G-CSF处理在MA细胞中未引起显著的基因表达变化，但在老年人衍生的CD146+ BMSCs中导致AQP1和CXCL12表达降低。NE处理在MA细胞中未影响基因表达，而在老年人细胞中降低了CXCL12和SOD2表达。
AMD3100在动员剂中产生了最显著的基因调控效应，而NRK在MA中的上调可能解释了其存在下观察到的CD34+ HSPC迁移细胞增加。有趣的是，在我们的实验条件下，AMD3100是唯一能调节CAMs表达(VCAM-1和CD44)的动员剂，而对CXCL12表达没有影响。相比之下，但与文献一致(Day等, 2015; Lucas等, 2008)，G-CSF和NE都能够降低BMSC中的CXCL12表达。总体而言，这些发现支持不同动员剂在CD146+ BMSCs中激活不同信号通路的观点。
3.4 动员剂不会改变中年人和老年人CD146+ BMSCs中的氧气消耗率
为了检查CD146+ BMSCs是否可能通过改变代谢活性影响CD34+ HSPCs细胞及其迁移能力，我们使用Seahorse XF技术实时分析氧化磷酸化，使用迁移测定中使用的相同样本，在存在或不存在动员剂的情况下(图4)。氧气消耗率(OCR)用作氧化磷酸化的测量，低速率HUVEC细胞添加到每次测定运行中，作为内部对照参考。
与未处理的MA受试者相比，几个与线粒体呼吸相关的参数，包括基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏和ATP产生，在未处理的OA受试者中显示出向更高值的趋势(见图4，面板A的上半部分，"CTRL"条)。相反，AMD3100处理(而非其他动员剂，G-CSF或NE)似乎更多地影响OA受试者而非MA受试者，导致向"MA CTRL"值下降。然而，背景氧气使用(非线粒体氧气消耗)保持稳定，总体效率未显示任何年龄或处理依赖性变化，耦合效率和呼吸能力在不同条件下相似(见图4，面板A的下半部分)。
确实，总体动力学图未显示MA和OA受试者之间或未处理和动员剂处理条件之间的显著差异(图4B)，表明可能是对潜在更高能量需求的生理适应，而非基本缺陷。
3.5 衰老对CD146+ BMSCs旁分泌活性的影响
鉴于在CD146+ BMSCs中观察到的多个分子通路中的年龄依赖性重塑，这似乎并未直接影响HSPCs动员，并且在缺乏明显的代谢参与的情况下，我们接下来研究了年龄是否可能影响CD146+ BMSC的旁分泌活性，促进促炎微环境。因此，我们研究了中年人与老年人CD146+ BMSCs衍生的CCM的组成和功能活性。
为了测试CD146+ BMSC-CCM的趋化活性，使用外周血单核细胞(PBMCs)，因为它们更易获得，并且与BM衍生的CD34+共享CXCL12趋化机制(Meditz等, 2008; Janssens等, 2018)。
我们发现，与中年人衍生的CCM相比，老年人CD146+ BMSC-CCM对PBMCs表现出更强的体外趋化活性(图5A)。相应地，ELISA测定显示，在老年人CD146+ BMSC-CCM中，分泌的VCAM-1增加，与中年人相比(图5B)。而在所有条件下的CCM中未观察到CXCL12和ICAM-1含量的差异。
动员剂不同地影响了MA和OA组中CD146+ BMSC-CCM的趋化活性。具体而言，来自AMD3100处理的老年人CD146+ BMSCs的CCM显著减少了PBMC迁移，而在处理的MA衍生细胞的CCM中未观察到影响。另一方面，G-CSF处理仅通过来自MA组的CCM增加了PBMC迁移(图5A)。
为了进一步研究CD146+ BMSCs释放因子的旁分泌效应，我们使用DCF荧光测量了EA.hy926内皮细胞在用处理过(G-CSF、AMD3100或NE)或未处理的CD146+ BMSCs衍生的CCM孵育后的细胞内ROS水平。尽管在暴露于MA与OA CD146+ BMSCs的CCM后，内皮ROS水平未观察到显著差异，但来自NE处理的CD146+ BMSCs的CCM显著降低了内皮细胞中的ROS水平，且与年龄无关(图5C)。虽然NE先前被报道增加干细胞中的ROS水平，作为HSPC运输和增殖的关键调节剂(Golan等, 2019; Golan等, 2018)，但我们的研究结果揭示了NE处理通过基质隔室介导的额外有益效应，导致内皮细胞中氧化应激降低。令人惊讶的是，NE处理未降低CD146+ BMSC-CCM中的CXCL12水平。
4 讨论
衰老深刻影响骨髓结构和功能，并伴随着称为"炎症老化"(inflammaging)的慢性低度炎症，破坏造血稳态，对心血管健康产生负面影响(Mangialardi等, 2014; Bonora等, 2022; Kohler等, 2009; Aranda等, 2025)。与此一致，骨髓衍生的心血管保护性CD34+ HSPCs在循环中的频率随年龄下降，这种减少与更差的心血管结局相关(Moresi等, 2005; Shimizu等, 2020; Cohen等, 2013; Patel等, 2015; Albiero和Fadini, 2018)。这些观察结果强调了CD34+ HSPC动员的临床相关性，并突显了更好地理解限制动员效率的年龄依赖性机制的必要性。
在骨髓微环境中，血管周围微环境在调控HSPCs的保留和外流中起着核心作用。血管周围BMSCs是关键的微环境成分，提供结构支持和旁分泌信号，控制CD34+ HSPC行为(Albiero和Fadini, 2018; Itkin等, 2016; Chang等, 2022; Campanile等, 2023)。
尽管已知衰老会损害BMSC功能，促进细胞衰老、炎症信号传导和氧化还原失调，同时改变微环境支持能力(Gnani等, 2019; Stenderup等, 2003; Stolzing等, 2008; Zhou等, 2008; Peffers等, 2016; Mueller和Glowacki, 2001)，但人类血管周围BMSCs对年龄相关CD34+动员缺陷的具体贡献仍未得到充分定义，部分原因是缺乏生理相关的基于人体外模型。
到目前为止，我们对CD34+ HSPC动员的大部分理解来自于糖尿病小鼠模型的研究，这些模型对动员剂的反应受损(通常称为"糖尿病动员病"(diabetic mobilopathy))(Albiero和Fadini, 2018)。这种对疾病特异性动物模型的严重依赖突显了对人类衍生的、生理相关的体外系统的明确未满足需求，该系统能够控制、定量地研究CD34+ HSPC动员，同时捕捉年龄依赖性血管周围基质调控。
早期的跨孔测定使CD34+迁移的定量分析成为可能，并确定了动员中涉及的关键趋化因子和粘附分子；然而，这些模型通常使用小鼠来源的基质或内皮细胞，或者完全缺乏人类基质成分，限制了它们的转化相关性(Campanile等, 2023; de Barros等, 2010; Mohle等, 1997; Aleman等, 2019; Voermans等, 2001; Kessinger等, 2005; Kim和Broxmeyer, 1998; van Buul等, 2002; Mohle等, 1999; Aiuti等, 1997)。使用人类细胞开发的更复杂的三维球状模型改善了基质架构和细胞-细胞相互作用的表示，但并未专门设计用于研究定向的CD34+ HSPC向循环的外流(de Barros等, 2010)。另一个先进的体外模型，该模型在微流控系统中引入了可灌注内皮和空间定义的微环境，主要关注干细胞维持或分化，而非定量迁移(Aleman等, 2019)。
为了解决这一差距，在一项试点研究中，我们设计了一个新的人体外骨髓共培养系统，该系统基于从两组不同年龄的患者中成功分离和培养的原代人CD146+ BMSCs，用于测试衰老如何影响CD34+ HSPCs对临床相关动员剂(即AMD3100、G-CSF和NE)的迁移反应。
一个有趣且意外的发现是，在使用老年人受试者衍生的CD146+ BMSCs的骨髓简化实验模型中，观察到CD34+ HSPCs迁移增加。这一结果可能表明潜在的补偿机制；然而，替代解释如功能失调的细胞衰老或生物变异性也不能排除，需要在未来研究中解决。
我们的研究结果表明，CD34+ HSPCs对CXCR4拮抗剂AMD3100的迁移反应可能因人而异，并且似乎受年龄影响，在老年人组中观察到反应性降低。这一结果与临床和实验证据一致，表明动员效率存在异质性，特别是在老年人中(Voermans等, 2001; Stiff, 1999; Fadini和Avogaro, 2013)。值得注意的是，使用这种人类简化实验模型-直接评估CD146+ BMSC-CD34+ HSPC相互作用-表明衰老可能在塑造血管周围基质细胞对CD34+ HSPC动员的贡献中起重要作用。
为了进一步表征骨髓微环境在BM HSPC动员中的贡献，我们对衰老和动员相关基因表达进行了广泛的分子分析。CD146+ BMSCs的转录组分析揭示，患者的年龄伴随着特定的特征，尽管保留了经典微环境标志物和保留因子的表达。这一结果与广泛报道年龄相关基质细胞重编程的文献一致(Gnani等, 2019; Stenderup等, 2003; Stolzing等, 2008; Zhou等, 2008; Peffers等, 2016; Mueller和Glowacki, 2001)。特别是，NRK、AQP1和PDK4的差异表达值得注意，因为这些基因可能涉及炎症、细胞代谢、迁移和对环境线索的适应性反应的调控，所有这些对微环境功能都至关重要(He等, 2024; Zannetti等, 2020; Qin等, 2020; Nakano等, 2003; Khan等, 2020; Jiang等, 2025; Meng等, 2014; Lee等, 2022)。
由NRK基因编码的Nik相关激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞应激反应和组织稳态，是我们发现的在老年人CD146+ BMSCs中显著下调的唯一基因。NRK表达降低与动脉血管平滑肌细胞中的糖尿病和心血管疾病相关(Ungvari等, 2018)，表明NRK可能有助于抑制炎症信号传导。在CD146+ BMSCs中，这种功能可能支持在中年组中观察到的更有效的迁移反应，尽管调节基质-造血相互作用的潜在机制仍有待阐明。
另一个在动员剂处理下在CD146+ BMSCs中显示年龄依赖性调节的基因是AQP1，这是一种在血管内皮中高表达的水通道蛋白亚型，参与水和H2O2跨细胞膜的运输。在这种情况下，我们在老年人中观察到AQP1显著上调，与显示小鼠衰老过程中主动脉内皮细胞中AQP1分布增加的报道一致(Shabanian等, 2024)。一致地，药理学AQP1抑制已被提议作为预防内皮衰老和增强老年人缺血性血管疾病风险增加者血管生成能力的策略(Shabanian等, 2024)。这些发现表明AQP1可能代表一个相关靶点，用于在衰老过程中维持CD146+ BMSC稳态。
此外，LMO2癌基因的表达改变支持了衰老相关基质变化与涉及造血和血管生成的通路之间的联系(Chambers和Rabbitts, 2015; Chen等, 2021)。事实上，LMO2过表达的人成纤维细胞增强前列腺癌细胞的存活和增殖(Chen等, 2021)，证明其具有诱导旁分泌调节的能力。
Pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4)是炎症相关代谢重编程的关键调节因子，促进从氧化磷酸化向糖酵解的转变，已知在2型糖尿病患者以及高脂饮食诱导的代谢应激的人类和动物模型中上调(Lee, 2014)。因此，在老年人CD146+ BMSCs中PDK4表达升高支持与衰老相关的炎症特征。值得注意的是，尽管PDK4表达增加，但我们未观察到显著的年龄依赖性代谢改变，表明PDK4可能在衰老的CD146+ BMSCs中发挥上下文特异性的非经典作用。应该注意的是，缺乏统计学显著性可能是由于代谢活性测定的样本量有限；因此，需要更大规模的研究来确认这些观察结果。
当我们随后分析几个经典微环境相关因子的基因表达时，包括血管周围微环境标志物CD146、脂肪生成分化调节因子PPARG2、趋化因子CXCL12、金属蛋白酶MMP1和MMP2，或一些编码CAM的基因(如ICAM-1、VCAM-1和CD44)，我们未观察到任何显著的年龄相关变化。这些结果表明，年龄不会均匀破坏经典微环境身份，而是选择性地改变可能影响功能结局的特定调控通路。
此外，为了更好地探究年龄对动员机制的影响，我们将来自MA和OA受试者的CD146+ BMSCs暴露于动员剂，并测量选定基因的转录水平。该分析显示，如预期，MA和OA表现出对动员剂的不同分子反应，但令人惊讶的是，OA表现出更广泛的CXCL12、CAMs和氧化应激相关基因的分子反应。这些在老年年龄基质细胞中观察到的更广泛分子反应未伴随CD34+ HSPC迁移的改善。相反，MA衍生的微环境表现出更有效的功能反应，尽管转录调控更有限。这种分子激活和功能能力之间的解离可能反映了无法恢复有效微环境功能的补偿性或应激相关转录程序。
有趣的是，在年龄相关差异表达基因中，AQP1、LMO2和NRK也对动员剂在研究组中表现出差异调节。值得注意的是，AMD3100诱导了最显著的基因调控，而MA中NRK的上调可能有助于观察到的CD34+ HSPC迁移增加，尽管这仍有待实验确认。
此外，AMD3100是唯一能够调节CAMs表达(VCAM-1和CD44)的动员剂，同时对CXCL12表达没有影响。相比之下，但与文献一致(Day等, 2015; Lucas等, 2008)，G-CSF和NE都能够降低BMSC中的CXCL12表达。总体而言，这些发现支持不同动员剂在CD146+ BMSCs中激活不同信号通路的观点。
尽管与功能迁移结果无关，但AMD3100或G-CSF在老年人受试者CD146+ BMSCs中对AQP1的下调，以及AMD3100暴露后LMO2的降低，强化了AQP1和LMO2可能代表相关靶点的观点，用于在衰老过程中维持CD146+ BMSC稳态。
旁分泌信号分析提供了关于年龄依赖性基质调控CD34+ HSPC迁移的进一步见解。老年人CD146+ BMSCs衍生的CCM对PBMCs表现出更高的基础趋化能力，这表明与年龄相关的更高保留能力，而非CD34+细胞动员增加。
必须承认，尽管BM CD34+ HSPCs和PBMCs共享一些运输机制，但它们受不同的、专门的趋化梯度调控，这些梯度调节它们在BM中的保留与向外围组织的迁移。BM微环境中HSPC的保留主要由CXCL12/CXCR4轴调控(Albiero和Fadini, 2018; Chang等, 2022; Day等, 2015)。相比之下，PBMC向炎症部位的迁移取决于更广泛的趋化因子受体库(Wain等, 2002)。在此背景下，老年人CD146+ BMSCs衍生的CCM中观察到的增强趋化活性更可能表明促炎状态增加，而非对HSPC动员的直接影响。
这一解释得到显著增加的分泌VCAM-1水平的支持，VCAM-1仅在活化细胞中表达(Cannistra等, 1994)，证实了一个模型，其中衰老重塑CD146+ BMSCs的旁分泌功能，以促进炎症和HSPC保留。
尽管如此，VCAM-1水平与趋化能力的关联并不延伸到药理处理效应。尽管处理依赖性迁移反应发生变化，但条件培养基中的VCAM-1水平并未相应增加，表明VCAM-1本身不足以解释动员剂暴露后观察到的增强趋化效应。这些发现表明，存在额外的旁分泌机制，超越VCAM-1，在动员线索响应中参与CD34+ HSPC迁移的年龄依赖性调控。
鉴于其在CD34+ HSPC动员中的核心作用，CXCL12值得特别关注。几项研究表明，人类骨髓中CXCL12水平随年龄下降(Periyasamy-Thandavan等, 2019; Gilbert等, 2019)；然而，支持这一观点的直接实验证据仍然有限。相比之下，在体外培养的鼠BMSCs中CXCL12表达降低是明确的(Choudhery等, 2012; Guang等, 2013)。
在我们的研究中，未观察到来自中年人和老年人的CD146+ BMSCs之间CXCL12表达的显著差异，这可能反映了该基质群体中CXCL12表达的高个体间变异性。G-CSF或NE处理后CXCL12表达降低与先前将这些动员剂与破坏BM趋化梯度相关的报道一致(Day等, 2015; Lucas等, 2008)。然而，这种降低并未在分泌组分析中伴随CXCL12蛋白水平的相应降低。鉴于分泌的CXCL12水平的高变异性以及分析的有限样本量，需要更大队列的额外研究来确定CXCL12转录变化是否与CXCL12分泌脱钩。
重要的是要考虑，BM CD34+外流，以及它们的保留，受到这些细胞向血管周围微环境的召回以及BM血管微环境和BM血流之间的趋化梯度竞争的精细调控(Albiero和Fadini, 2018)。
除了趋化信号外，活性氧已被确定为CD34+细胞迁移和保留的重要旁分泌调节因子(Itkin等, 2016; Tesio等, 2011; Golan等, 2012)。因此，我们研究了内皮ROS水平作为CD146+ BMSCs施加的旁分泌效应的补充读数。值得注意的是，来自NE处理的CD146+ BMSCs的条件培养基显著降低了内皮细胞中DCF可检测的ROS水平，与受试者年龄无关。这一发现表明，NE刺激诱导了一种分泌谱，能够调节与微环境相关的内皮细胞的氧化还原状态，可能促进更具保护性或支持静息的微环境(Golan等, 2019; Golan等, 2018)。与G-CSF或AMD3100等动员剂不同，这些动员剂通常与氧化应激和增强BM CD34+外流相关，内皮细胞在NE处理的CCMs中观察到的抗氧化效应可能反映了影响内皮-HSPC串扰的不同调控机制。重要的是，这种反应的年龄无关性表明，NE介导的氧化还原调节在中年人和老年人CD146+ BMSCs中得到保留，支持其在衰老BM微环境中潜在的相关性，其中失调的ROS信号传导通常与造血功能受损有关。
CXCL12和ICAM-1分泌以及CD146+ BMSCs细胞呼吸中缺乏年龄或处理依赖性差异表明，这些基本BM分子和整体代谢活性不是观察到的功能差异的主要驱动因素。总体而言，这些发现支持一个模型，即CD146+血管周围BMSCs通过年龄依赖性、多因素机制调控CD34+ HSPC迁移，涉及选择性转录重编程和旁分泌信号传导，而非经典微环境因子的均匀改变。
尽管存在与相对较小的队列规模、缺乏受试者匹配的临床动员数据以及实验在常氧条件下进行(而非BM血管微环境特征性的低氧条件)相关的限制(Kubota等, 2008; Parmar等, 2007)，本研究作为少数体外系统之一脱颖而出，该系统包含直接从目标组织中获得的原代人类细胞。
本研究的主要目标是建立和验证一个体外骨髓简化实验模型，而非全面证明潜在生物学机制或得出广泛概括的结论，使用有限但特征明确的原代样本集对于证明系统的可行性、可重复性和潜在适用性是适当的。此类系统代表了转化生物医学研究的重要基础步骤，并为未来研究提供了有希望的基础，这些研究旨在扩大队列并进一步在更具代表性的条件下验证该模型，例如更可预测和与人类相关的药物筛选。
【全文结束】