衰老限制人类免疫中CXCL13+滤泡辅助T细胞的成熟
特异性抗体反应的下降是人类衰老的标志，但B淋巴细胞和T淋巴细胞的不同贡献仍不清楚。CXCL13是一种塑造生发中心（GC）组织的趋化因子，但在衰老过程中对人类特异性CXCL13+滤泡辅助T细胞（Tfh）的调控尚不清楚。使用人类扁桃体类器官、单细胞RNA测序和CRISPR扰动技术，我们绘制了Tfh细胞（在生发中心中向B细胞提供帮助的细胞类型）在衰老过程中的变化图谱。来自老年捐献者的扁桃体类器官产生较弱的流感特异性抗体反应，我们将此归因于Tfh细胞缺陷而非B细胞问题。单细胞分析显示成熟CXCL13+ GC-Tfh细胞的选择性丧失，伴随前体状态的积累。轨迹分析表明，衰老在早期激活前体转换阶段阻碍Tfh成熟，CRISPR扰动确定BACH2和SOX4是随年龄减少的分化调控因子。这些发现揭示了一种人类特异性的免疫衰老机制，对恢复老年人体液免疫的策略具有启示意义。
关键词：衰老、Tfh细胞、成熟、CXCL13、基因调控、人类免疫学
研究课题：免疫学
引言
疫苗的目标是通过产生高亲和力抗体来引发持久的保护性免疫。尽管抗体由B细胞产生，但其质量取决于来自特化CD4+ T细胞（称为滤泡辅助T细胞，Tfh）的帮助。这些Tfh细胞在周围淋巴器官（如淋巴结、扁桃体和脾脏）的生发中心内与B细胞相互作用。在这些微环境中，B细胞增殖并分化为分泌抗体的浆母细胞（PBs）和记忆细胞，共同提供持久免疫力。尽管疫苗效果显著，但并非所有人都能得到同等保护，抗体反应存在明显的个体间差异。影响疫苗反应不佳的最关键因素之一是衰老。老年人产生的抗体分泌B细胞较少，与年轻人相比，疫苗特异性抗体产量降低，反映了尚不完全了解的免疫反应缺陷。
先前的工作主要来自小鼠模型，表明衰老对GC生物学的多个方面产生负面影响，损害持久抗体反应的产生。来自老年小鼠的GC-B细胞显示出受损的类别转换重组和体细胞超突变，减少的活化诱导胞苷脱氨酶驱动程序，以及与年轻小鼠相比，向长寿命浆细胞和记忆库的选择减弱。同时，T细胞对B细胞的帮助质量也随年龄下降。这已被归因于Tfh细胞在GC内的错误定位、没有相应增加功能性GC-Tfh细胞的Tfh前体状态积累、Tfh后期发育受损，以及抑制性T滤泡调节（Tfr）细胞与Tfh群体的不利比例。在人类中，衰老同样与较弱的疫苗特异性抗体反应和免疫后较少的抗体分泌细胞相关，但衰老对Tfh细胞的直接影响尚不清楚。对循环和淋巴Tfh细胞亚群的分析产生了相互矛盾的结果，一些研究报告老年人频率增加，而其他报告则减少。值得注意的是，人类免疫衰老指标IMM-AGE通过对外周血中免疫细胞亚群组成的高分辨率纵向跟踪识别出，循环CD4+ Tfh细胞的减少是免疫衰老轨迹中的关键特征。Tfh细胞生物学在物种间并非完全相同。例如，一些人类GC-Tfh细胞独特表达趋化因子CXCL13，这与GC活性和抗体质量密切相关。然而，这些细胞在小鼠中不存在，CXCL13在小鼠中仅由滤泡树突状细胞产生。这些发现共同突显了B-Tfh轴在衰老过程中是一个关键的脆弱点，但B和Tfh细胞对人类抗体反应受损的相对贡献仍未解决。
扁桃体来源的免疫类器官为探索人类特异性免疫功能提供了一个独特平台。它们使研究人员能够直接在人类淋巴组织中研究调控B和T细胞相互作用的细胞和分子机制。免疫类器官重现了GC反应的关键特征，包括B-Tfh细胞相互作用、浆母细胞分化、体细胞超突变、亲和力成熟和类别转换，同时保留了人类淋巴组织的免疫学多样性。该系统已经提供了对早期免疫发育、调节性T细胞类型的作用以及流感抗原疫苗诱导反应的见解，突显了其用于识别适应性免疫机制的效用。此外，免疫类器官使我们能够独立于小鼠模型测试假设和定义机制，这对于理解人类特异性现象至关重要。
在此，我们对来自5-73岁捐献者的扁桃体样本进行了深入分析，研究衰老如何塑造人类免疫反应。老年个体的类器官产生了较弱的抗体反应，我们将此归因于Tfh细胞缺陷。单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示CXCL13+ GC-Tfh效应细胞的选择性减少。轨迹分析和阵列CRISPR扰动表明，衰老阻碍Tfh成熟，并确定了在老年捐献者中受损的关键转录调控因子。总之，这些发现揭示了一种人类特异性机制，即衰老影响高质量抗体反应的产生，并揭示了可能用于恢复老年人体液免疫的通路。
结果
人类体液免疫反应随衰老而受损
人类免疫系统表现出显著的个体间差异，适应性免疫反应的最强预测因素之一是年龄。为探索衰老如何塑造体液免疫，我们分析了402名8-90岁健康个体对季节性流感疫苗的抗体反应。外周血在基线（第0天）和疫苗接种后28天采集，并使用血凝抑制（HAI）测定法定量针对血凝素（HA）的中和抗体。
在此队列中，疫苗接种诱导了血清抗体滴度的增加，大多数个体在第28天显示出可测量的HAI反应。针对H1、H3和B疫苗成分的抗体滴度汇总为复合几何平均滴度（GMT），显示从基线有3倍的中位变化。年龄成为疫苗反应性的主要决定因素。年龄与第28天GMT的倍数变化呈负相关，对应于每十年生活HAI下降约4%（β = -0.006/年，p < 0.001）。为进一步解析衰老如何影响体液免疫质量，我们检查了血清转化（SC，定义为≥4倍升高且第28天GMT ≥40）和血清保护（SP，第28天GMT ≥40）作为捕获疫苗免疫原性不同方面的互补指标。先前的人类研究表明，预先存在的抗体是后续疫苗反应的重要决定因素，而老年人维持基线抗体水平，但在疫苗接种后显示提升抗体滴度的能力降低。与这一观点一致，血清转化的概率随年龄下降（p < 0.001，每十年的比值比[OR] = 0.86），而血清保护仅受到轻微影响（p = 0.017，OR = 0.88）。总体而言，这些结果支持老年人可能保留预先存在的抗体分泌细胞，但提升现有或生成新的抗体反应能力有限的观点。这种抗体维持与诱导之间的区别表明，衰老并非均匀地损害体液免疫的所有方面，而是影响生成和放大抗体反应所需的复杂细胞相互作用。
为直接在人类周围淋巴组织内进一步探索衰老对体液免疫反应的影响，我们使用了最近描述的扁桃体免疫类器官模型，并通过将细胞嵌入水凝胶基质中适应了96孔板格式以提高通量。刺激免疫类器官与减毒活流感疫苗（LAIV）诱导了HA特异性IgG抗体的稳健分泌，7天后达到峰值。生物层干涉测量显示在整个14天培养过程中多克隆HA特异性抗体亲和力不断增加，证实了正在进行的亲和力成熟过程。
我们随后组装了跨越近7个生活年代的扁桃体捐献者的免疫类器官（n = 16，16-73岁），并测量了它们对LAIV的反应。与我们的体内人类流感疫苗研究一致，老年捐献者的类器官免疫反应显著减弱。来自年轻捐献者（<30岁）的类器官对LAIV产生了强烈的反应，与未刺激对照相比，HA特异性IgG有强烈诱导。相比之下，来自老年人（>50岁）的类器官显示出显著降低的疫苗反应。
先前的工作将衰老中体液免疫反应的降低与Tfr细胞比例增加和Tfh细胞比例减少联系起来。与这一观点一致，我们发现来自老年人的扁桃体含有增加频率的Tfr细胞和减少频率的GC-Tfh细胞，与年轻捐献者相比。尽管这些定量变化表明T细胞景观的改变，但其对人类组织中GC活性的功能影响仍定义不清。为测试Tfr活性是否对衰老中B细胞向抗体分泌浆母细胞的分化减弱是必需的，我们使用分选的CXCR5hiPD-1hi GC-Tfh细胞和自体扁桃体B细胞从年轻和老年捐献者建立了Tfh-B细胞共培养，输入比例标准化。细胞用LAIV刺激，7天后，我们通过流式细胞术测量了向CD38hiCD27hi浆母细胞的分化。在年轻捐献者中，向B细胞添加Tfh细胞引发了强烈的辅助反应，与单独培养的B细胞相比，浆母细胞频率增加了4-9倍。值得注意的是，即使在没有Tfr细胞的情况下，使Tfh细胞输入均衡也无法完全恢复老年捐献者的反应。浆母细胞诱导显著降低，仅显示3倍增加。总之，这些结果表明衰老对体液免疫的影响不能仅通过从Tfh到Tfr亚群的转变来解释。相反，衰老似乎减弱了Tfh细胞帮助在使B细胞反应稳健方面的关键作用。
B细胞在人类衰老过程中保持对T细胞帮助的反应性
由于来自老年人的免疫类器官未能产生强烈的抗体反应，并且标准化B和Tfh细胞的频率未能恢复缺陷，我们接下来询问衰老是否会损害B细胞对T细胞衍生信号的反应性。为解决这个问题，我们从外周血单核细胞（PBMCs）中分离了20名22-72岁老年和年轻捐献者的B细胞（n = 20）。我们将纯化的B细胞与或不与B细胞受体（BCR）激活信号（IgA/IgG/IgM交联剂）和/或模拟Tfh细胞帮助的信号（IL-21和CD40L）一起培养，以评估B细胞的年龄相关变化。7天后，我们使用流式细胞术测量了分化B细胞亚群的频率。有趣的是，来自老年和年轻个体的B细胞对体外BCR和T细胞衍生信号表现出相似的反应。与未刺激条件相比，GC样B细胞和浆母细胞的频率均显示出类似的增加。同样，在任何测试条件下，CD138上调和IgD/CD95表达在年龄组之间均无显著差异。这些结果表明，抗体诱导的年龄相关下降主要不是由B细胞激活或分化的内在缺陷引起的。相反，这些数据表明T细胞在衰老中体液免疫的减弱中起主导作用，与小鼠研究一致。
CXCL13+ GC-Tfh细胞在人类衰老过程中减少
由于来自老年人的B细胞对体外T细胞衍生信号反应正常，我们假设体液免疫的年龄相关缺陷可能源于Tfh细胞本身。为调查衰老如何影响人类扁桃体T细胞的组成和分子特征，我们从广泛年龄范围的捐献者中纯化了CD3+ T细胞并进行了scRNA-seq。经过初始质量控制后，我们确定了20,657个单细胞转录组，这些转录组聚类为15个不同的群体，代表典型的CD4+、CD8+和非常规T细胞亚群。CD4+ T细胞主要由初始和中央记忆亚群组成，效应记忆和活化细胞的比例较小。一个独特部分表现出Tfh细胞的特征，由BCL6、CXCR5和PDCD1的高表达定义，与在GC内的定位和功能一致。
重要的是，我们确定了三个转录上不同的扁桃体Tfh细胞群体，包括初始Tfh细胞，其CXCR5、TOX和BCL6表达较低；经典GC-Tfh细胞，其BCL6、CXCR5和PDCD1表达较高；以及CXCL13+ GC-Tfh细胞的小而独特亚群，其BCL6和IL6ST的表达最高，并具有稳健的CXCL13转录水平。为确定这些群体如何受年龄影响，我们比较了年轻和老年捐献者之间的Tfh亚群组成，揭示了老年人中CXCL13+ GC-Tfh细胞的显著减少。在年轻捐献者中，CXCL13+ GC-Tfh细胞占所有CD4+ T细胞的1%-8%，而在老年人中占<1%。
为验证年龄与CXCL13+ GC-Tfh细胞之间的关系，我们通过细胞内细胞因子染色（ICS）分析了另一组扁桃体捐献者（n = 10，年龄5-61岁），使用CXCR5和PD-1作为Tfh细胞成熟的先前建立标记。CXCL13表达仅限于CXCR5+PD-1hi GC-Tfh群体，而非Tfh（CXCR5-）、前Tfh（CXCR5+PD-1lo）和CXCR5+PD-1mid Tfh亚群。值得注意的是，只有一部分GC-Tfh细胞表达CXCL13（4%-23%），表明这些细胞可能代表GC-Tfh谱系内的独特效应状态。与我们之前的scRNA-seq数据一致，CXCL13+ GC-Tfh细胞的频率随年龄显著下降（R2 = 0.73，p = 0.0018）。CXCL13分泌通过ELISA测量显示与年龄有类似的但较弱的负相关（R2 = 0.34，p = 0.0783），而关键Tfh效应细胞因子IL-21的分泌保持不变（R2 = 0.0998，p = 0.3740），暗示其调控与CXCL13+ GC-Tfh程序分离。
作为使用公开可用的人类扁桃体图谱数据集的最终验证，我们确定了对应于CXCL13表达的群体（注释为GC-Tfh-SAP），并确认其随年龄减少（儿童：n = 6，3-5岁；年轻成人：n = 8，19-35岁；老年成人：n = 3，56-65岁）。有趣的是，IL21与CXCL13不同地调控，在不同的Tfh群体中观察到IL21表达增加（注释为GC-Tfh-OX40）。
总体而言，这些数据揭示了衰老与CXCL13+ GC-Tfh细胞的丧失相关，该细胞具有高BCL6和IL6ST表达以及独特的效应潜力，从而突显了这种独特的人类群体作为Tfh依赖性体液免疫的可能关键介质。
CXCL13+ GC-Tfh细胞构成独特的Tfh效应程序
Tfh细胞成熟是一个多步骤过程，由发育中GC内与树突状细胞和B细胞的相互作用塑造。小鼠模型为理解Tfh细胞发育提供了基础框架；然而，物种间存在关键差异。在小鼠中，成熟GC-Tfh细胞上调CXCR5和PD-1但不表达CXCL13。相比之下，我们的数据表明，人类Tfh细胞成熟更为复杂，涉及CXCL13表达的额外效应阶段。
为更好地定义这些CXCL13+ GC-Tfh细胞，我们分析了我们的scRNA-seq扁桃体T细胞数据集，并比较了所有CD4+ T细胞集群的基因表达谱。有趣的是，CXCL13+ GC-Tfh细胞与发育中的Tfh和GC-Tfh细胞相比，表现出独特的转录组特征。与GC-Tfh细胞相比，在CXCL13+ GC-Tfh细胞中上调的差异表达基因（DEGs）包括生存和代谢调节因子（GIMAP5、GIMAP7、GIMAP2、BCL2L11、SESN1和BCAT1）、活化和GC驻留标记（ITGAE、LAG3和CD38）、T细胞信号分子（IL6ST、IL7R和FYB）以及转录调节因子（AFF3、ARID5A和TCF7）。相比之下，经典GC-Tfh细胞富集TIGIT、EGR1、EGR2、CD40LG、BTLA4和NFKB1，反映了GC-Tfh区室内的转录分叉。这通过关键效应基因（ICOS、IL6ST和ITGAE）的渐进增加得到进一步支持，CXCL13+ GC-Tfh细胞显示出这些活化和Tfh信号相关转录本的最高表达。为确定CXCL13+ GC-Tfh效应程序是否对应于任何已建立的小鼠Tfh亚群，我们将已发表的小鼠Tfh细胞基因签名与CD4+ T细胞转录本进行了比较。小鼠Tfh签名通常与非Tfh CD4+ T细胞表现出最小重叠，其富集在传统GC-Tfh细胞中最大，表明CXCL13+ GC-Tfh亚群代表一种独特的人类特异性效应状态。
我们接下来在体外检查了维持CXCL13+ GC-Tfh效应程序的功能要求。我们将不同的Tfh亚群分选并分别与自体扁桃体B细胞一起培养。与之前的ICS实验一致，只有CXCR5+PD-1hi GC-Tfh细胞产生可测量的CXCL13。然而，在没有B细胞的情况下，CXCL13产生完全被消除，表明CXCL13+效应状态的维持需要持续的B细胞相互作用。
为功能验证CXCL13分泌是由核心Tfh编程驱动的，我们接下来对原代扁桃体细胞中规范的Tfh相关转录因子（TFs）进行了靶向CRISPR敲除，随后用LAIV刺激7天。BCL6、BATF、TCF7和LEF1的破坏都显著降低了CXCL13分泌，与扰乱对照相比，确认它们在维持CXCL13+ GC-Tfh效应表型中的基本作用。
总之，这些结果将CXCL13+ GC-Tfh细胞确立为人类Tfh谱系内的晚期B细胞依赖性效应群体。该亚群在转录上与其他GC-Tfh细胞不同，并且独特地适应于在体液免疫反应期间在GC内表达趋化分子CXCL13。
GC-Tfh细胞成熟在人类衰老过程中受损
鉴于CXCL13+ GC-Tfh细胞代表一种在老年捐献者中代表性不足的独特效应状态，我们接下来询问衰老是否改变了产生这些细胞的发育编程。流式细胞术分析显示前Tfh细胞（CXCR5+PD-1lo），代表Tfh成熟的最早阶段，随年龄显著增加（R2 = 0.5476，p = 0.0092）。这一发现与Webb等人的研究一致，他们表明前Tfh细胞在老年小鼠淋巴结在病毒感染后过度代表。相比之下，更先进的Tfh亚群随年龄下降（CXCR5+PD-1mid：R2 = 0.4653，p = 0.0208；GC-Tfh：R2 = 0.5101，p = 0.0135）。值得注意的是，ICOS表达也与年龄呈负相关（R2 = 0.5375，p = 0.0103），与CXCL13+ GC-Tfh细胞的丧失和介导T细胞对B细胞帮助的这种CXCL13+效应程序基因的表达受损一致。这些发现表明前体状态的积累是以成熟GC-Tfh细胞频率为代价的。
为进一步探索这一发育途径，我们使用我们的扁桃体scRNA-seq数据集从初始CD4+ T细胞到CXCL13+ GC-Tfh细胞构建了伪时间轨迹。沿着这一连续体，我们观察到转录因子（BCL6和TOX）、共抑制受体（TIGIT）和Tfh效应分子（IL-21和CXCL13）的协调上调。比较年龄组之间的伪时间分布显示，尽管初始CD4+ T细胞的表示相似，但老年人在活化CD4+ T细胞状态处积累细胞，并在成熟GC-Tfh终点处减少。累积分布的分析（显示沿伪时间已达到特定细胞状态的细胞比例）证实了在活化CD4+ T细胞阶段出现并在成熟后期持续的年轻和老年捐献者之间的分歧（Kolmogorov-Smirnov检验，p < 2.2e-16）。总之，这些数据表明衰老限制了沿着Tfh发育途径的进展，在早期T细胞活化和前Tfh细胞状态中产生瓶颈。
敲除年龄依赖性转录因子揭示人类Tfh细胞成熟的调控因子
为确定衰老期间Tfh细胞发育受损的分子特征，我们比较了伪时间区间的年轻和老年个体之间的基因表达。值得注意的是，大多数年龄相关差异出现在早期分化状态，甚至在GC-Tfh承诺之前。这一发现表明，在老年人中观察到的效应GC-Tfh细胞频率降低可能是由于招募到淋巴组织的初始CD4+ T细胞中已经存在的变化。
为更好地理解这一点，我们检查了早期伪时间阶段中年轻和老年捐献者之间的DEGs。老年人中的早期转录程序富集应激和效应相关基因，包括编码BLIMP-1（PRDM1）的基因，其与BCL6功能相对立；多个AP-1家族转录因子（FOSB、JUNB、JUND和JUN）；以及AP-1家族结合伴侣IRF4。相比之下，年轻人中的早期转录程序过表达促进CD4+ T辅助细胞可塑性和维持的转录因子，如BACH2、SOX4、LEF1和STAT1。
为功能评估这些年龄相关TFs在早期Tfh细胞极化过程中的作用，我们开发了一种使用初始CD4+ T细胞的阵列CRISPR极化模型。在CRISPR-Cas9介导的选定年龄相关TFs敲除后，初始CD4+ T细胞在Tfh极化条件下培养7天。选择进行敲除的TFs包括规范的Tfh调节因子（BCL6和TCF7）以及从我们的轨迹分析中识别的年龄相关转录调节因子。显示高编辑效率以及对BCL6敲除的非Tfh表型的样本被保留用于下游分析。我们还通过靶向对替代CD4+ T辅助细胞命运所需的关键TFs验证了CRISPR敲除平台。BACH2和SOX4的敲除显著减少了Tfh细胞分化，而SP110敲除产生了类似的但不显著的趋势（p = 0.07）。LEF1或TCF7的敲除，初始到Tfh细胞转换的规范调节因子，显示出预期方向的效果但未能达到显著性。总体而言，这些结果确定BACH2和SOX4是早期人类Tfh细胞极化的关键调节因子，随年龄下调。这些发现表明衰老改变了从活化前体到承诺Tfh细胞的转录开关，导致向效应CXCL13+ GC-Tfh细胞状态的进展受损。
讨论
持久抗体反应起源于生发中心B和T细胞相互作用，但我们对这些相互作用如何受到人类衰老影响的理解是不完整的。在这里，我们发现人类Tfh细胞发育包括一种在近交系小鼠中不存在的成熟CXCL13+效应状态。这种独特的功能状态具有记忆和组织驻留基因IL6ST、IL7R、ITGAE和TCF7等的增加表达。最重要的是，我们表明这些特化的CXCL13+ GC-Tfh细胞在老年捐献者中由于成熟早期阻断而显著减少。这种成熟Tfh细胞的丧失可能是老年人抗体反应不佳的原因。通过将缺陷归因于成熟而非B细胞或Tfh细胞频率的普遍下降，我们提供了一个框架来理解为什么疫苗在老年人中效果较差，并突出了一种人类特异性的免疫衰老机制，仅从动物模型无法推断。
一个长期存在的问题是，老年人中疫苗反应受损主要是由于B细胞内在功能障碍还是Tfh细胞帮助缺陷。小鼠研究表明，老年B细胞中存在类别转换重组和体细胞超突变缺陷，但人类的治疗干预表明，当提供足够的Tfh细胞信号时，老年人的B细胞仍能反应。我们的发现支持这一点，因为来自老年人的外周B细胞对体外Tfh细胞帮助信号的反应与来自年轻人的B细胞相似。这些发现将Tfh细胞定位为关键限制成分。重要的是，Tfh细胞存在于表型和功能不同的状态中，但这些状态对GC功能的相对贡献及其在整个生命周期中的稳定性尚未解决。在Tfh细胞亚群中，CXCL13+ GC-Tfh细胞正成为特别重要的调节因子。CXCL13通常由滤泡树突状细胞表达，并通过CXCR5受体作为趋化因子，建立经典的明区和暗区结构。然而，人类Tfh细胞也可以表达CXCL13，而小鼠T细胞则不能。在人类研究中，CXCL13+ GC-Tfh细胞的丰度与疫苗反应性相关，疫苗接种后血液中的CXCL13水平与GC活性和抗体质量强烈相关。鉴于CXCL13+ GC-Tfh状态以记忆和组织驻留基因TCF7、IL7R和ITGAE（编码CD103）的显著增加表达为特征，可以推测这些细胞是驱动长期抗体介导免疫的特别重要驱动因子。我们的研究现在将这些CXCL13+ GC-Tfh细胞定位为人类Tfh分化连续体中的关键成熟亚群，并表明这种成熟过程在衰老过程中受到干扰。这些结果有助于澄清为什么先前关于衰老中Tfh频率的报告不一致，表明缺陷不在于总体丰度，而在于无法有效产生成熟的GC-Tfh细胞，特别是那些表达CXCL13的细胞。
此外，我们的研究表明，通过结合对人与人之间变异性的彻底分析与体外实验干预模型，可以发现新的人类生物学。尽管Tfh细胞先前被确定为纵向人类免疫衰老指标IMM-AGE的关键贡献者，但外周血在作为进行机制研究的相关组织方面能力有限。在这里，通过检查随年龄下调的TFs，我们发现了人类Tfh细胞成熟的调节因子。Tfh细胞分化的转录调控已被充分表征，主要是通过在小鼠模型中识别调节因子，随后在人类细胞中验证。这些研究确立了规范的Tfh调节因子如BCL6、IRF4和BATF的作用。我们的研究扩展了人类Tfh细胞极化的这一框架，揭示了保守和不同的特征。例如，BACH2在小鼠中被描述为限制Tfh命运的负调节因子，而在我们的人类系统中，它作为早期向CXCL13+ GC-Tfh阶段进展所需的正调节因子出现，突显了潜在的阶段和物种特异性差异。SOX4先前与驱动慢性炎症期间T外周辅助细胞中的CXCL13表达相关，被证明对淋巴组织中的Tfh细胞分化是必需的，将与病理相关的程序与正常的疫苗诱导体液免疫联系起来。SP110，最好表征为NF-κB信号的共调节因子，以前与Tfh生物学无关，但在我们的研究中作为人类Tfh成熟的潜在调节因子出现。值得注意的是，SP110突变与原发性免疫缺陷相关，导致成熟B细胞频率正常但缺乏浆细胞和记忆细胞。这些发现不仅扩展了控制人类Tfh细胞发育的转录网络，还突显了研究调节通路的重要性。通过结合人类扁桃体的体外模型与CRISPR扰动，我们建立了一个机制平台，用于剖析在人类淋巴组织内运作的调节通路。以这种方式，我们的系统为分析人类对疫苗的免疫反应提供了框架，并提供了发现适应性免疫中人类特异性检查点的多功能工具。
我们的发现对在免疫缺陷状态下测量疫苗功效具有转化潜力。血浆CXCL13已被表征为临床疫苗研究中GC活性的生物标志物。未来的工作需要确定CXCL13+ GC-Tfh细胞对系统性CXCL13水平的贡献，以及衰老是否也直接影响外周中的CXCL13+ Tfh细胞。血浆CXCL13可能不仅作为GC完整性的标志物，还作为Tfh成熟能力的替代物，能够在可访问的组织隔室中根据产生有效疫苗反应的可能性对老年人进行分层。BACH2和SOX4等转录调节因子的鉴定也指向旨在恢复Tfh细胞成熟的直接分子靶点，无论是通过佐剂配方、细胞因子操纵还是转录网络的药理学改变。
总之，我们的研究确定了一种成熟的CXCL13产生GC-Tfh细胞的人类特异性群体，该群体因Tfh成熟中与年龄相关的阻断而减少，重塑了我们对老年人中抗体反应受损机制的理解。通过强调早期Tfh细胞成熟的缺陷并识别分子调节因子，我们为未来旨在恢复老年人群中强大免疫力的策略奠定了基础。
研究局限性
扁桃体组织是粘膜次级淋巴B和T细胞的可及来源；然而，它们可能无法完全反映淋巴结或脾脏的生物学。此外，我们的类器官系统重现了GC功能的许多特征，但它无法捕获体内发生的系统性迁移或长期回忆效应。尽管我们的全扁桃体敲除研究支持BCL6、BATF、TCF7和LEF1的T细胞内在效应，但我们不能排除B细胞也可能对这些实验中观察到的CXCL13表达减少有贡献。虽然初始CD4+ T细胞中的单TF扰动提供了重要见解，但Tfh谱系承诺可能来自多个TFs的相互作用。因此，我们的方法仅捕捉了部分情况，因为多个TFs的组合敲除可能会加剧或抵消我们观察到的效果，揭示尚未发现的调控层。最后，我们的CRISPR筛选是有针对性的而非无偏的，可能有其他调节因子在体内促进Tfh成熟。尽管存在这些注意事项，人类免疫类器官、单细胞分析和遗传扰动的整合提供了一个强大的框架，用于发现动物模型无法获得的适应性免疫机制。
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