摘要
酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如舒尼替尼和索拉非尼，是肾细胞癌（RCC）的标准治疗方法。然而，大多数接受这些药物治疗的患者最终会产生耐药性并复发；因此，迫切需要新的RCC治疗方案。近期研究聚焦于针对不同分子通路的联合疗法，这些疗法可能产生协同效应并帮助克服RCC中的药物耐药性。尼可刹米是一种抗寄生虫药物，对多种癌症有效；然而，其与舒尼替尼联合治疗RCC的潜力尚未得到评估。在本研究中，我们评估了尼可刹米与舒尼替尼联合对抗RCC的治疗效果，并探讨了其潜在的分子机制。尼可刹米单独使用可抑制RCC细胞增殖，而其与舒尼替尼联合使用则在体外和体内均产生协同抗癌效应。RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析表明，尼可刹米调节了关键通路，包括BRIP1和FANCA介导的DNA修复以及E2F2调控的细胞周期进程。这些发现为尼可刹米通过调节DNA修复和细胞周期通路增强TKI疗效提供了概念验证，支持了在RCC中采用靶向DNA损伤反应（DDR）联合策略的理论依据。
关键词：肾细胞癌；舒尼替尼；尼可刹米；协同效应；DNA修复；细胞周期
1. 引言
肾细胞癌（RCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率正稳步上升。RCC包含多种组织学亚型；最常见的亚型是透明细胞RCC（ccRCC）、乳头状RCC（pRCC）和嫌色细胞RCC（chRCC）。其他亚型较为罕见，各约占RCC病例的1%。
酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如舒尼替尼和索拉非尼，已被批准用于治疗晚期RCC。舒尼替尼抑制多种受体酪氨酸激酶，包括血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、Fms相关酪氨酸激酶3和c-KIT，并被广泛用作一线治疗。尽管具有治疗效果，但大多数接受舒尼替尼治疗的患者在6-15个月内会产生耐药性。获得性耐药导致疾病复发，仍是重要的临床挑战。
为克服这一局限，需要新的治疗策略，特别是针对互补通路的联合方法。其中，药物重定位已成为一种有前景的方法，因为它具有成本效益高和时间效率高的优势。特别是，将重新定位的药物与现有治疗相结合，可能会产生协同效应并帮助克服癌症中的治疗耐药性。
尼可刹米是一种经FDA批准的抗蠕虫药物，具有多种特性，包括抗炎、支气管扩张、抗菌和抗癌活性，适用于各种肿瘤类型。与传统TKIs不同，尼可刹米同时靶向多个致癌通路，包括抑制Wnt/β-catenin、mTOR和STAT3信号传导。这些通路在RCC的发病机制和进展中起着关键作用。此外，尼可刹米通过抑制介导DNA损伤反应（DDR）的FOXM1，在前列腺癌细胞中诱导DNA损伤，表明其具有独特且多方面的机制。尼可刹米破坏多种与癌症相关通路的能力为其与TKIs等其他靶向疗法联合使用提供了强有力的理论依据，以更有效地损害RCC细胞存活。
值得注意的是，尼可刹米对RCC表现出抗癌活性，并增强了索拉非尼的治疗效果。然而，尼可刹米在RCC中的潜在作用仍不清楚。尼可刹米与舒尼替尼联合使用的效果尚未得到研究。考虑到这两种药物的作用机制不同，我们假设它们的联合使用将协同抑制RCC生长。
在本研究中，我们旨在评估尼可刹米-舒尼替尼联合的治疗效果，并阐明其潜在机制，特别关注DDR和细胞周期调控。
2. 结果
2.1. 尼可刹米和舒尼替尼单独对RCC表现出抗癌效果
为评估每种药物的单独抗癌效果，用尼可刹米和舒尼替尼处理RCC细胞系。正如预期，舒尼替尼剂量依赖性地抑制RCC细胞活力。尼可刹米作为一种FDA批准的抗蠕虫药物，显著降低了RCC细胞系活力，呈剂量和时间依赖性。尼可刹米显著增加了所有三种RCC细胞系中凋亡细胞群体的剂量依赖性。此外，尼可刹米显著抑制了细胞迁移和侵袭，呈剂量依赖性。这些结果表明，尼可刹米对RCC具有强大的抗癌特性。
2.2. 舒尼替尼和尼可刹米联合在体外产生协同抗癌效应
接下来，我们研究了舒尼替尼和尼可刹米联合是否对RCC产生协同抗癌效应。用不同浓度的两种药物处理ACHN细胞48小时，并测量细胞活力。使用SynergyFinder 2.0中的最高单药（HSA）模型进行协同分析，基于每种药物七种不同浓度及其组合的数据，每个条件至少重复三次。该组合表现出5.663的正协同评分，ACHN细胞中的最高协同（评分：28.826），表明存在协同相互作用。值得注意的是，2.5 µM舒尼替尼和1 µM尼可刹米组合在最小药物浓度下展示了9.46的协同评分。基于这些结果，在后续实验中使用了选定的组合比例。这种联合疗法显著降低了A-498、ACHN和Caki-1细胞的活力，并增加了与单独用药相比的凋亡。
2.3. 联合疗法在体内显著抑制肿瘤生长
为验证这些发现，我们在裸鼠中建立了ACHN异种移植模型。用DMSO（载体）、舒尼替尼、尼可刹米或两者组合每天治疗荷瘤小鼠。在治疗期间未观察到明显的毒性或体重减轻。
在DMSO组中，肿瘤生长在研究期间迅速增加。与对照组相比，舒尼替尼和尼可刹米单药治疗均适度抑制了肿瘤生长。一致地，最终肿瘤重量和代表性图像也支持这些发现。在研究终点（第29天），舒尼替尼组与对照组相比有显著差异（p = 0.0302），而尼可刹米组未显示任何统计学意义（p = 0.1217）。舒尼替尼组和尼可刹米组之间未观察到显著差异（p = 0.2258）。
值得注意的是，联合治疗从第8天开始显著抑制肿瘤生长（校正p = 0.0493），差异在第12、15、19、22、26和29天变得更加明显（所有校正p < 0.05）。此外，从第19天起，尼可刹米组和联合组之间出现了显著差异（p < 0.05）。在第29天，联合组的肿瘤明显更小，体积相对于对照组减少了2.79倍（p = 0.0119），相对于尼可刹米组减少了1.91倍（p = 0.0040），相对于舒尼替尼组减少了1.51倍，尽管差异无统计学意义（p = 0.0872）。
肿瘤切片的免疫组织化学分析进一步支持了联合疗法增强的抗肿瘤效果。在联合组中，增殖标志物Ki-67的表达显著降低，而凋亡标志物cleaved caspase-3的表达明显高于对照组和单药治疗组。这些发现强调了舒尼替尼和尼可刹米联合使用的协同抗肿瘤效果，超过了单独使用任一药物带来的益处。
为评估抗血管生成效果，评估了CD31表达。所有治疗组相对于对照组均显示CD31表达降低，联合组中降低最为显著。有趣的是，尼可刹米组的CD31表达显著高于舒尼替尼组和联合组，但仍低于对照组。CD31阳性血管面积的定量分析显示，联合组的微血管密度最低，表明与单独使用舒尼替尼相比，肿瘤血管生成的附加减少。这些数据表明，尼可刹米可能通过不同机制部分贡献于抗血管生成效果，同时发挥额外的抗肿瘤活性。总之，这些结果表明，联合疗法的增强疗效源于舒尼替尼的抗血管生成作用和尼可刹米调节的互补通路。
2.4. 尼可刹米诱导RCC中的转录组改变
为阐明尼可刹米活性的分子机制，对舒尼替尼、尼可刹米或其组合处理后的细胞进行了RNA-seq，每种处理均与载体处理的对照组进行比较。差异表达分析显示，所有三种处理均显著改变了基因表达谱。为确定尼可刹米驱动的分子变化，我们重点关注了仅由尼可刹米和组合下调但不由舒尼替尼下调的基因。总共729个基因显著下调（|倍数变化| > 1.5，p < 0.05）。对这些尼可刹米相关基因的KEGG通路富集分析（p < 0.001）显示，与细胞周期（基因计数：24）、DNA复制（基因计数：12）和Fanconi贫血（FA）通路（基因计数：11）相关的通路显著富集。这些结果表明，尼可刹米的主要抗癌机制涉及破坏细胞周期和DNA修复过程，从而有助于观察到的与舒尼替尼的协同活性。
2.5. 尼可刹米诱导G0/G1期阻滞并激活DDR
为验证转录组发现，我们观察了尼可刹米对RCC中细胞周期进程和DDR的影响。尼可刹米单独或与舒尼替尼联合使用，显著增加了A498和ACHN细胞中G0/G1期阻滞。具体而言，78%和72%的A498细胞，以及70%和71%的ACHN细胞在尼可刹米单独或联合处理后阻滞在G0/G1期。
Western blotting分析显示，所有处理组中γ-H2AX表达均高于对照组，尼可刹米组和联合组中的水平最高。这些结果表明，尼可刹米显著促进了RCC细胞中DNA损伤的积累。
为进一步研究DNA损伤诱导和修复的动力学，我们在30分钟H2O2脉冲后，对DMSO、舒尼替尼、尼可刹米或联合处理的细胞进行了γ-H2AX和53BP1的时间进程免疫荧光染色。γ-H2AX和53BP1焦点被量化为DNA双链断裂信号和修复解决的既定标志物。
在H2O2暴露后0、1或2小时未观察到可检测的γ-H2AX或53BP1焦点。因此，后续分析集中在8和24小时时间点。尼可刹米和联合处理在两个时间点均导致大量γ-H2AX和53BP1焦点，从8到24小时无明显下降。相比之下，H2O2处理的对照细胞在24小时时焦点显著减少，与有效DNA修复一致。
定量分析证实，尼可刹米组和联合组中γ-H2AX和53BP1阳性细胞的比例在8和24小时均显著高于H2O2对照组。值得注意的是，γ-H2AX标记DNA双链断裂（DSBs）两侧的染色质区域，而53BP1是在这些位点被招募以促进非同源末端连接的DNA修复因子。尼可刹米和联合处理细胞中γ-H2AX和53BP1焦点的持续共定位表明，DSB位点持续招募修复因子而没有及时解决。这种模式与DNA病变的延迟解决一致，可能表明DDR延长。这些发现表明，尼可刹米诱导DNA损伤并导致持续的γ-H2AX和53BP1焦点。这种持续存在符合DNA修复的延迟或损伤，并可能有助于观察到的G0/G1期阻滞和凋亡。
2.6. 尼可刹米下调DNA修复和细胞周期通路中的关键调节因子
为确定尼可刹米调节的关键基因，我们将RNA-seq数据中的差异表达基因（DEGs）与TCGA-KIRC数据集的转录组数据进行了整合。KEGG通路富集分析显示，44个下调基因在尼可刹米处理后在DNA修复和细胞周期调控相关通路中显著富集。
为确定具有临床重要性和治疗相关性的基因，我们使用TCGA-KIRC数据库筛选了它们在TP（原发肿瘤组织）与NT（正常组织）中的表达水平（Log FC > 2.0，FDR < 0.05）。此筛选步骤确定了五个基因，E2F2、TTK、BRIP1（也称为FANCJ）、FANCA和DNA2，在TP中显著上调。相比之下，其他39个基因在TP和NT组之间未显示显著差异表达。
接下来，我们验证了尼可刹米和联合治疗对这五个基因表达的影响。在qRT-PCR中，尼可刹米或联合处理显著降低了A-498和ACHN细胞中BRIP1、E2F2和FANCA的相对mRNA表达水平，而DMSO或单独舒尼替尼处理则没有。我们通过Western blot分析在蛋白水平上确认了这些发现。与qRT-PCR结果一致，用尼可刹米和联合疗法处理的RCC细胞中BRIP1、E2F2和FANCA水平显著降低。
3. 讨论
TKIs（如舒尼替尼）耐药性的发展仍是RCC治疗中的主要临床挑战。由于TKIs的疗效有限和RCC的生物学复杂性，已探索针对不同分子通路的联合策略以克服药物耐药性并改善治疗效果。据我们所知，这是首次证明舒尼替尼和尼可刹米联合在RCC中产生协同抗癌效应的研究。从机制上讲，尼可刹米调节DNA损伤反应（DDR）和细胞周期调控，从而增强肿瘤对舒尼替尼的易感性。这些发现支持药物重定位作为提高RCC治疗效果的可行方法。
尼可刹米已被报道通过调节多种信号通路（如Wnt/β-catenin、mTOR和STAT3）在几种上皮癌中发挥抗肿瘤作用。类似的多效性效应也在RCC模型中观察到。与这些报道一致，我们的数据证实尼可刹米诱导了凋亡并抑制了细胞迁移和侵袭。然而，作为单药治疗，尼可刹米单独使用似乎不足以完全控制肿瘤，促使我们调查其在联合方案中的使用。在我们的模型中，尼可刹米-舒尼替尼联合产生了协同效应，由协同评分和显著增强的肿瘤抑制（无明显毒性）证明。
舒尼替尼通过抑制VEGFR和PDGFR信号传导而被广泛认可具有抗血管生成活性。我们的发现表明，尼可刹米也可能适度贡献于抗血管生成效果，如CD31表达降低所示。然而，尼可刹米似乎发挥了超出血管生成抑制的效果。与它的多效性活性一致，我们的转录组分析揭示了RCC中一种以细胞周期调控和DNA修复相关基因下调为特征的机制模式，导致DDR受损和凋亡。先前在其他癌症中也报道了类似的DDR相关效应。
尽管也鉴定出一些上调基因，但KEGG通路分析表明内质网和过氧化物酶体途径中的蛋白质处理富集，表明尼可刹米处理的次级效应是激活ER和氧化应激反应。功能验证证实，尼可刹米诱导DNA损伤，表现为持续的γ-H2AX和53BP1焦点，以及G0/G1期阻滞，共同表明DDR受损和检查点中断导致凋亡。这些发现与先前在肝细胞癌、甲状腺癌和胰腺癌模型中的研究结果一致，以及我们在前列腺癌中的先前研究显示尼可刹米通过DDR调节抑制肿瘤生长。综上所述，这些互补机制，包括舒尼替尼的抗血管生成活性和尼可刹米对不同分子通路的抑制，可能解释了在RCC中观察到的相加和协同疗效。这种组合基于它们不同的靶向机制而进行合理设计，允许尼可刹米补充舒尼替尼未能有效抑制的通路。
G1期在决定细胞命运中起着关键作用，在此期间细胞要么修复DNA损伤，要么进行凋亡。通过破坏这一检查点，尼可刹米可能损害DDR通路，这已在RCC进展和复发中被涉及。同时靶向DDR和细胞周期调控，如尼可刹米与舒尼替尼联合所实现的，可能代表一种有前景的策略，以增强疗效并克服RCC中的耐药性。这与先前报道一致，表明诱导细胞周期阻滞的其他药物可有效抑制RCC进展。尽管基于免疫检查点抑制剂（ICI）与TKIs的组合已成为转移性RCC的标准护理，但耐药性和治疗不耐受仍是主要挑战。目前的发现为探索基于尼可刹米的方案作为克服这些局限性的潜在策略提供了机制理论依据。
此外，我们通过整合TCGA-KIRC数据分析，确定BRIP1、FANCA和E2F2为尼可刹米调节的临床相关靶点。在FA通路中，FANCA和BRIP1在DNA损伤修复中起关键作用。FANCA参与通过规范FA通路修复DNA链间交联和双链断裂（DSBs）。FANCA缺乏与白血病的肿瘤发生增加和预后不良有关。BRIP1通过促进DSBs和交联的修复来促进基因组稳定性。此外，BRIP1过表达是乳腺癌和胃癌的预后生物标志物。
相比之下，E2F2作为G1/S期转换的关键调节因子，启动DNA复制。E2F2表达升高促进增殖，并赋予胰腺癌吉西他滨耐药性，在RCC患者中也升高，表明其作为诊断生物标志物的潜在效用。综上所述，这些发现表明BRIP1、FANCA和E2F2可能是尼可刹米作用的重要介导者，也是RCC中的潜在治疗靶点。
本研究有几个局限性。首先，体内验证仅使用单个RCC细胞系（ACHN）和小队列规模（每组n=5）进行，可能无法完全捕捉RCC的异质性。未来使用其他透明细胞RCC模型（如A-498和Caki-1）的研究将对进一步验证这些发现和确认其普遍性至关重要。然而，协同抗增殖效果在体外三种RCC细胞系（ACHN、A-498和Caki-1）中一致重现，与DDR和细胞周期调控相关的关键机制发现在A-498和ACHN中得到验证。其次，尽管未进行彗星试验，但γ-H2AX和53BP1焦点的时间进程分析提供了DDR受损的间接证据。第三，尽管确定BRIP1、FANCA和E2F2为尼可刹米效应的潜在介导者，但尚未通过敲低或挽救实验直接验证它们的作用。最后，尼可刹米在人体中的口服生物利用度有限；因此，进一步研究应包括全面的药代动力学和药效学分析，包括血浆和肿瘤浓度测量，以及配方优化和剂量寻找实验，以确保转化可行性。在这方面，最近的配方进展，如盐、固体分散和基于纳米粒子的制剂，正在积极研究以克服这些局限性并改善系统暴露。尽管存在这些局限性，我们的结果提供了强有力的临床前证据，表明尼可刹米是RCC中与舒尼替尼联合治疗的有前景的伙伴。此外，本研究中证明的机制概念，同时靶向血管生成和DDR/细胞周期通路，为DDR靶向联合策略提供了概念验证。随着RCC的治疗范式继续向更新的多激酶抑制剂转变，使用当代TKIs（如卡博替尼或仑伐替尼）进行进一步验证将至关重要，以确认此机制是否超越舒尼替尼。
5. 结论
在本研究中，我们证明尼可刹米与舒尼替尼协同产生对RCC的强大抗癌效果。尼可刹米通过下调BRIP1、FANCA和E2F2，诱导DNA损伤、损害修复过程并导致细胞周期阻滞，从而增强舒尼替尼的疗效。这些发现为DDR靶向联合策略作为RCC潜在治疗方法提供了概念验证证据。
6. 专利
本工作已导致专利注册：用于预防或治疗肾癌的包含尼可刹米和舒尼替尼的药物组合物。韩国专利号10-2595271，于2021年10月12日提交，2023年10月23日注册。专利权人：韩国天主教大学产学合作基金会。发明人：Yong Hyun Park、Ae Ryang Jung、Ga Eun Kim、Mee Young Kim和Na Yoon Kim。
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