摘要
表观遗传调控是老化过程的关键决定因素，其失调会促进认知老化并增加阿尔茨海默病（AD）的易感性。作为表观遗传过程的主要调节因子，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）已成为神经退行性疾病中认知增强的潜在治疗靶点。然而，不同HDAC亚型的具体作用仍有待明确界定。本文报道HDAC9特异性地在人类和小鼠脑神经元中表达，且其表达随年龄增长而下降。HDAC9缺失损害了年轻小鼠的认知功能和突触可塑性。选择性删除海马CA1区神经元中的HDAC9也会导致认知障碍。相反，在前脑谷氨酸能神经元中过表达HDAC9可以保护老年小鼠的认知功能。此外，HDAC9在AD小鼠模型的脑组织中也下调，而神经元中HDAC9的过表达减轻了AD相关的认知和突触缺陷，并减少了Aβ沉积。这些发现表明，神经元HDAC9对维持老化和AD背景下的认知和突触功能既必要又充分。
引言
老化与认知能力下降及阿尔茨海默病（AD）易感性增加相关，AD是痴呆的主要原因，占病例的60-80%。虽然淀粉样β（Aβ）斑块和神经原纤维缠结是AD的传统神经病理学标志，但它们与认知下降的相关性相对较弱。相比之下，突触功能障碍和缺失是AD最早和最一致的病理变化之一，与认知下降显示出最强的相关性。表观遗传修饰在突触可塑性、学习和记忆形成中发挥关键作用。随着老化，这些精细调控的过程变得越来越失调，扰乱支持突触功能和认知表现的基因表达程序。在AD中，表观基因组功能障碍进一步导致神经元易损性、突触丢失和认知缺陷增加。
组蛋白乙酰化是特征最明确的表观遗传修饰之一，由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）动态调控。HATs通过乙酰化松弛染色质结构，促进转录激活，而HDACs则促进染色质压缩并抑制基因表达。HDACs已被证实参与调控记忆形成和突触可塑性的分子通路。HDACs的药理学抑制可导致组蛋白高乙酰化、染色质去凝缩和转录去抑制。在AD前临床模型中，HDAC抑制已被证明可增强突触可塑性，改善记忆并减轻认知障碍。然而，目前HDAC抑制剂的主要局限性是缺乏亚型特异性，可能导致非预期的脱靶效应。
哺乳动物HDACs分为四类：I类（HDACs 1、2、3、8）、II类（IIa：HDACs 4、5、7、9；IIb：HDACs 6、10）、III类（Sirtuins SIRT1-7）和IV类（HDAC11）。当前HDAC抑制剂通常靶向锌依赖性HDACs共有的保守催化口袋，导致亚型选择性有限。IIa类HDACs由于催化活性极低，常规HDAC抑制剂对它们影响甚微。大量证据表明IIa类HDACs主要作为转录共抑制因子发挥作用，通过作为支架蛋白招募酶活性类I HDACs（如HDAC3）到染色质上。IIa类HDACs的N端作为独特的衔接结构域，与各种转录因子结合，从而以情境依赖的方式调控基因表达。这些独特的结构和结合特性表明，IIa类HDACs主要通过去乙酰化酶活性无关的机制发挥作用，依靠与特定表观遗传调节因子和转录因子的相互作用来调控基因表达。
鉴于IIa类HDACs固有的酶活性有限，其亚型特异性功能已通过分子和遗传方法进行研究，但仍有许多未知之处。在果蝇中，HDAC4的过表达和敲低都会损害记忆，表明HDAC4既是过量时的记忆抑制因子，又是正常记忆功能所必需的。在小鼠中，HDAC4敲除对空间和恐惧记忆的影响取决于所使用的Cre品系。HDAC5敲除损害空间和联想记忆，但不影响记忆提取或消退。相反，HDAC7过表达损害长期记忆，而敲低则增强记忆。这些发现表明IIa类HDACs在调控认知行为方面具有复杂且情境依赖的作用。
HDAC9作为另一个IIa类HDAC，在神经元中高表达；然而，其在大脑中的具体功能仍基本未明。转录组学分析显示，与AD相关的死后脑组织中HDAC9表达减少；此外，HDAC9表达似乎与Braak分期呈负相关，表明较低的HDAC9水平可能与疾病进展有关。本研究旨在表征人类和小鼠大脑中HDAC9的表达，研究其在老化和AD小鼠模型中的调控，并进一步探讨其在年轻、老年和AD小鼠认知表现和突触可塑性中的功能作用。研究发现HDAC9在老化大脑和两种AD小鼠模型中表达下调。HDAC9缺失导致年轻小鼠认知和突触功能障碍，而神经元特异性HDAC9过表达则可保护老年小鼠的认知功能，并在AD小鼠中缓解认知和突触缺陷以及Aβ病理。
材料和方法
人类死后脑组织获取
人类死后脑组织样本来自埃默里大学阿尔茨海默病研究中心的神经病理学核心实验室。所有标本均经过完全去标识化处理。因此，该研究经奥古斯塔大学机构审查委员会审查，确定不构成人类受试者研究。
动物
小鼠饲养在个体通风笼中，食物和水自由摄取，12小时明暗循环（灯亮时间：早上6点）。
雄性和雌性野生型（WT）C57BL/6小鼠（品系#000664）、Emx1-ires-Cre小鼠（品系#005628）购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港）。用于老化相关研究的雄性小鼠来自美国国立老化研究所（NIA）老化啮齿动物种群。HDAC9敲除小鼠品系（C57BL/6背景）删除了外显子4的大部分和外显子5的全部，由Eric Olson博士开发，并通过与C57BL/6J小鼠回交维持在我们的种群中。雄性和雌性HDAC9杂合子敲除小鼠（HDAC9+/−）杂交以产生HDAC9纯合子敲除（HDAC9−/−）小鼠和WT同窝对照。HDAC9条件性敲除小鼠（C57BL/6背景），其中小鼠HDAC9基因的外显子4两侧有loxP位点，如前所述生成。HDAC9条件性敲除小鼠与C57BL/6J小鼠回交，随后建立杂合子后代的繁殖群，用于Cre介导的细胞和区域特异性敲除研究。
为生成HDAC9条件性过表达小鼠模型，合成了编码3×FLAG-小鼠HDAC9（mHDAC9）的DNA片段（Genewiz），并克隆到CAG-STOP-eGFP-ROSA26TV载体（CTV载体，Addgene质粒#15912）中。该载体在CAG启动子下游包含一个loxP-STOP-loxP盒，允许在Cre介导切除后实现细胞类型特异或时间特异的基因表达。合成的DNA片段克隆到LSL盒和Frt-IRES-eGFP-Frt-polyA盒之间的AscI位点。将构建体用AsiSI线性化，电穿孔到G4胚胎干细胞（ES细胞）中。通过位于5'和3'同源区域外的引物集进行PCR筛选，鉴定出正确靶向的ES细胞。将成功靶向的克隆注射到C57BL/6J白化胚泡中，嵌合创始者与C57BL/6J小鼠杂交，产生生殖系传递的HDAC9-Tgflox-STOP-flox杂合子。雌性杂合子HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠与雄性Emx1-ires-Cre小鼠杂交，产生Emx1-ires-Cre;HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠和Emx1-ires-Cre同窝对照。
5xFAD和APP/PS1转基因小鼠来自突变小鼠资源与研究中心（MMRRC）。5xFAD小鼠过表达突变人淀粉样β前体蛋白695（APP）及其携带的五个家族性AD突变，以及突变人早老素1（PSEN1）的两种家族性AD突变。这两种转基因由小鼠Thy1启动子驱动，特异性地在神经元中过表达。雄性半合子5xFAD小鼠与雌性杂合子HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠杂交，产生5xFAD/HDAC9flox-STOP-flox小鼠、5xFAD小鼠和WT同窝对照。APP/PS1小鼠表达携带瑞典突变（K595N/M596L）的嵌合小鼠/人APP和突变人PSEN1（ΔE9），受控于小鼠朊病毒蛋白启动子元件。
海马CA1区靶向AAV载体注射的立体定位手术
为靶向海马CA1区基因敲除，如前所述进行立体定位注射。将AAV5-CMV-Cre-GFP（AAV-Cre-GFP）和对照AAV5-CMV-GFP（AAV-GFP）各500 nl（每侧），以0.1 μl/min的速率注射到成年雄性HDAC9flox/flox小鼠的背侧海马CA1区（坐标：前-后（AP）= -2.1 mm，中-侧（ML）= ±1.5 mm，背-腹（DV）= -1.7 mm）。注射后，针头留置5分钟，然后缓慢拔出。三周后进行行为测试。通过检查脑切片中的GFP荧光验证注射位点。
静脉（尾静脉）AAV注射
在静脉注射前将小鼠轻轻加温以扩张静脉，然后将其置于约束器中。使用AAV-PHP.eB.hSyn.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40（AAV-PHP.eB.eGFP.Cre）和AAV-PHP.eB-EF1a-GFP进行静脉注射，稀释至100 μl体积，缓慢注射到尾静脉中。
行为程序
Y迷宫自发交替测试
使用Y迷宫评估短期空间工作记忆。每只小鼠被放置在Y迷宫一端，面向中心，允许在10分钟内自由探索所有三个臂。自发交替行为反映了小鼠探索迷宫中先前未访问过的臂的自然倾向，源于其对新奇事物的天生好奇和偏好。序列和进入频率由不知晓基因型和治疗的实验人员记录。进入定义为所有四只肢体进入一个臂。自发交替百分比计算公式：自发交替(%) = [连续进入所有三个臂的次数/(进入总次数 - 2)] × 100%。
新物体识别（NOR）测试
NOR测试广泛用于评估物体识别记忆，基于啮齿动物对探索新物体而非熟悉物体的天生倾向。该测试包括三个连续会话：适应会话、训练会话和测试会话。在第一天，将小鼠放入空旷场环境适应5分钟。第二天，放置两个相同物体，让小鼠自由探索5分钟。2小时后，在NOR测试中引入一个新物体，记录探索新物体和熟悉物体的时间。
社交识别记忆测试
社交识别测试采用两阶段范式。在社交互动阶段，测试小鼠被置于包含两个线笼的矩形区域：一个笼子包含陌生社交目标小鼠（M1），另一个空置。允许测试小鼠自由探索10分钟。2小时后进行社交辨别阶段，将第二个新社交目标小鼠（M2）放入先前空置的笼子。测试小鼠再次探索5分钟，记录与每个社交目标小鼠的互动时间。
情境恐惧条件反射测试
情境恐惧条件反射测试是一种评估联想恐惧学习和记忆的常用范式。训练日，小鼠在条件化箱内自由探索3分钟后接受四次足部电击（0.8 mA，每次2秒，间隔60秒）。24小时后，测试小鼠在相同环境中的冻结行为以评估情境恐惧记忆。
热板测试
热板测试用于评估对热刺激的伤害感受反应。热板保持在55°C恒温。记录小鼠对热刺激的反应时间，如后肢舔舐或跳跃。
活动性测试
使用开放场活动系统测量活动性。测试箱由透明丙烯酸制成，周围有三组光束阵列检测水平和垂直运动。记录30分钟内的活动，前5分钟的总行进距离用于统计分析。
高架十字迷宫测试
高架十字迷宫测试广泛用于评估焦虑，基于探索新环境的自然驱动力与回避危险（开放）区域的倾向之间的冲突。小鼠在十字迷宫中央平台面向角落放置，允许探索5分钟。记录在开放和封闭臂的时间和进入次数。
免疫组织化学
小鼠经心灌注，4%多聚甲醛固定。40μm冠状切片用TBS冲洗，然后在阻断缓冲液中处理。脑切片与兔单克隆抗HDAC9抗体和其他细胞类型特异性抗体共同孵育。抗体在4°C下与脑切片过夜孵育，然后在室温下与Alexa Fluor荧光二抗孵育2小时。使用KEYENCE全功能荧光显微镜和Nikon A1R MP+多光子/共聚焦显微镜观察免疫染色并捕获图像。
RNA提取和实时定量PCR分析
小鼠快速断头处死，将海马和前额叶皮层快速冰上解剖。组织在液氮中速冻，-80°C保存用于RNA提取。使用RNeasy Plus Mini试剂盒提取总RNA。cDNA合成后进行实时PCR定量。使用2(-ΔΔCT)方法获得基因表达相对倍数变化。
蛋白质印迹
前额叶皮层和海马组织在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中匀浆。样品在4°C下溶解30分钟，14,000 rpm离心15分钟。使用BCA测定法定量蛋白浓度。使用Odyssey CLx成像系统可视化信号并进行定量分析。
海马中突触可塑性/长时程增强
麻醉小鼠，脑快速转移到冰上切割溶液中。准备400μm厚的水平切片，恢复1小时。脑切片转移至界面室，使用人工脑脊液灌注。记录CA1区场兴奋性突触后电位（fEPSPs）。通过施加一系列增加刺激强度的脉冲测量输入/输出。使用1秒100 Hz的高频刺激诱导LTP。
统计分析
所有结果以均值±标准误差（SEM）表示。使用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。使用Shapiro-Wilk检验和F检验评估正态性和方差齐性假设。对于正态分布数据且方差相等的两组比较，使用双尾非配对t检验。对于三组以上比较，使用单向方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验。对于非正态分布数据，两组比较使用Mann-Whitney U检验，多组比较使用Kruskal-Wallis检验及Dunn多重比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
HDAC9在神经元中表达并在前额叶皮层和海马中随年龄下降
内侧前额叶皮层（mPFC）和海马在认知功能中发挥重要调节作用，这两个区域在正常老化和AD中特别容易受到神经退行性变的影响。鼠类mPFC在功能上与人类背外侧前额叶皮层（DLPFC）同源。为确定HDAC9在大脑中的细胞类型特异性表达，我们使用针对HDAC9的特异性抗体对人死后脑背外侧前额叶皮层（布罗德曼9区）切片进行免疫染色。HDAC9与神经元标记NeuN共定位，但与星形胶质细胞标记GFAP或小胶质细胞标记IBA1不共定位，表明HDAC9在神经元中特异性表达。在小鼠脑中，HDAC9表达主要存在于神经元中，在星形胶质细胞或小胶质细胞中几乎没有可检测的表达。
我们接下来研究了HDAC9表达随年龄在这些两个脑区域的变化。收集了三个不同年龄（3、12和24个月）的野生型小鼠PFC和海马。定量实时PCR分析显示，PFC和海马中的HDAC9 mRNA表达均随年龄增长而显著下调。一致地，蛋白质印迹分析显示，这两个脑区域中的HDAC9蛋白水平也随年龄增长而相应降低。
HDAC9缺失导致年轻小鼠认知功能障碍
为研究HDAC9表达年龄相关下调是否促进认知衰退，我们评估了4-6个月龄的全局HDAC9敲除（HDAC9−/−）小鼠及其野生型（WT）同窝对照的认知表现。使用Y迷宫自发交替测试测量短期空间工作记忆。与WT小鼠相比，HDAC9−/−小鼠表现出显著降低的自发交替率，总臂进入次数无变化，表明空间工作记忆受损。
为评估物体识别记忆，使用新物体识别测试评估区分熟悉和新物体的能力。在2小时保留间隔后的训练阶段后，WT小鼠显著偏好新物体，而HDAC9−/−小鼠则无偏好。新物体与熟悉物体探索时间的差异归一化为总探索时间，表达为辨别指数，HDAC9−/−小鼠的该指数显著低于WT对照组，表明物体识别记忆受损。
HDAC9缺失损害海马突触可塑性
长时程突触增强（LTP）是突触可塑性的一种形式，被广泛认为是学习和记忆的主要细胞机制，特别是在海马中。值得注意的是，LTP受损与老化和AD等多种病理和生理条件下观察到的记忆障碍密切相关。HDAC9−/−小鼠表现出正常的基线突触传递，但无法维持海马LTP，表明突触可塑性受损。突触可塑性与认知表现的并发降低进一步支持了HDAC9对于维持突触可塑性和认知功能是必需的。
脑源性神经营养因子（BDNF）是突触可塑性和记忆形成的关键调节因子，其失调与年龄相关认知衰退和AD均有关联。小鼠BDNF基因包含九个独特的5'非编码外显子（I-IXa），每个外显子由其自身启动子驱动，并与共同的3'编码外显子拼接。虽然所有转录变体编码相同的BDNF蛋白，但它们独特的上游启动子使BDNF表达能够进行精确的时空和活动依赖性调控。值得注意的是，包含BDNF外显子IV和VI的转录本受神经元活动调控，其翻译失调与记忆丧失有关。为确定HDAC9缺失是否影响BDNF表达，我们测量了HDAC9−/−小鼠及其WT同窝对照在4-6月龄海马中的总BDNF mRNA水平。结果表明，HDAC9−/−小鼠中总BDNF mRNA水平显著降低。这种减少可能反映了由非编码外显子产生的特定转录变体的变化。确实，在HDAC9−/−小鼠海马中，BDNF外显子IV转录水平显著降低，而外显子VI转录水平保持不变。
CA1特异性HDAC9缺失导致年轻小鼠认知障碍
为确定HDAC9在海马CA1区域内的特定作用，我们利用Cre/loxP系统在成年小鼠（4-6月龄）中诱导CA1区域特异性敲除HDAC9。行为测试在AAV注射后3周进行。在Y迷宫中，接受AAV-Cre-GFP注射的小鼠表现出受损的空间工作记忆，表现为Y迷宫测试中自发交替率降低。此外，AAV-Cre-GFP注射小鼠增加了总臂进入次数，表明CA1特异性HDAC9缺失导致的活动增加。在新物体识别测试中，对照小鼠（AAV-GFP）对新物体表现出显著偏好，而AAV-Cre-GFP注射小鼠无法区分新旧物体，辨别指数在AAV-Cre-GFP注射小鼠中降低，表明CA1特异性HDAC9缺失导致的记忆障碍。
为评估联想学习和记忆，进行了情境恐惧条件反射测试。AAV-Cre-GFP注射小鼠在获取阶段表现出较少的冻结行为，但在条件化24小时后表现出正常的恐惧记忆。热板测试未检测到组间差异，表明条件化过程中的冻结反应降低反映了学习障碍，而非感觉敏感性改变。
HDAC9过表达保护老年小鼠的认知功能
鉴于HDAC9表达在PFC和海马随年龄增长而下调，且HDAC9敲除导致认知障碍，我们研究了HDAC9过表达是否能改善年龄相关认知障碍。然而，HDAC9表达盒的较大尺寸使其无法通过AAV载体递送。因此，我们开发了一种条件性HDAC9敲入小鼠模型。在该模型中，小鼠HDAC9（mHDAC9）cDNA在CAG启动子控制下，N端带有3×FLAG标签，位于loxP-STOP-loxP盒之后。该设计防止转基因表达，直到Cre重组酶切除STOP序列，从而实现HDAC9的条件性、组织特异或时间调控表达。构建体靶向到Rosa26位点，该位点是小鼠模型中的"安全港位点"。
为生成敲入系，将靶向载体引入C57BL/6品系衍生的胚胎干细胞。将正确靶向的ES克隆注射到C57BL/6J白化胚泡中，嵌合创始者与C57BL/6J雌性小鼠杂交，建立生殖系传递的杂合子小鼠，称为HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠。将HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠与Emx1-ires-Cre敲入小鼠杂交，在前脑谷氨酸能神经元中驱动HDAC9过表达。结果表明，Emx1-ires-Cre;HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠海马中HDAC9 mRNA和蛋白水平升高。
为评估HDAC9过表达对年龄相关认知衰退的影响，我们在不同年龄段（6、15、21个月）对小鼠进行了一系列行为测试。在年轻成年（6个月）和中年（15个月）小鼠中，HDAC9过表达对短期工作记忆无显著影响。然而，21个月龄的Emx1-ires-Cre对照小鼠表现出明显的记忆缺陷，自发交替率接近随机水平（50%）。同龄的Emx1-ires-Cre;HDAC9flox-STOP-flox小鼠表现出更高的交替率。此外，15-21个月龄的Emx1-ires-Cre;HDAC9flox-STOP-flox小鼠在Y迷宫中进行更多臂进入，表明探索活动增加。
在15-21个月龄时进行短期物体识别记忆测试。在15个月龄时，Emx1-ires-Cre;HDAC9flox-STOP-flox小鼠和Emx1-ires-Cre同窝对照均能区分新旧物体，两组间无显著差异。到21个月龄时，两组均表现出物体识别记忆障碍。社会识别记忆在21个月龄时进一步评估。Emx1-ires-Cre小鼠对熟悉和新同伴小鼠的探索时间相似，表明社会识别记忆受损。相比之下，Emx1-ires-Cre;HDAC9flox-STOP-flox小鼠显著增加与新同伴的互动时间，且社会偏好指数更高，表明社会识别记忆得到保护。这些发现表明，HDAC9过表达可保护老年小鼠的工作记忆和社会记忆。
鉴于BDNF在记忆形成中的关键作用，我们测量了Emx1-ires-Cre;HDAC9flox-STOP-flox小鼠海马中BDNF mRNA水平。HDAC9过表达增加了总BDNF mRNA的表达。进一步评估外显子IV和外显子VI的表达，发现HDAC9过表达显著增加了BDNF外显子IV转录本的水平，而BDNF外显子VI转录本水平保持不变。
HDAC9表达在两种AD小鼠模型的前额叶皮层和海马中下调
为研究HDAC9是否参与AD的病理生理，首先测量了5-6月龄5xFAD小鼠脑组织中的HDAC9表达。该AD模型过表达人APP和PSEN1转基因，特别在神经元中。5xFAD小鼠PFC和海马中的HDAC9 mRNA水平较WT同窝对照显著降低。蛋白质印迹分析确认了5xFAD小鼠PFC中HDAC9蛋白表达的相应降低。
还检查了APP/PS1小鼠海马中的HDAC9 mRNA表达。这些小鼠表达携带瑞典突变的嵌合小鼠/人APP和突变人PSEN1（ΔE9）。与5xFAD小鼠类似，APP/PS1小鼠海马中HDAC9 mRNA表达较WT同窝对照显著降低；在APP/PS1小鼠的PFC中也观察到下降趋势。总体而言，这些结果表明HDAC9在AD小鼠模型脑中表达下调，提示HDAC9可能与AD相关表型有关。
神经元HDAC9过表达减轻5xFAD小鼠认知和突触缺陷
为评估HDAC9过表达是否能改善5xFAD小鼠的认知和突触缺陷，将HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠与5xFAD小鼠杂交生成5xFAD/HDAC9-Tgflox-STOP-flox、5xFAD和WT后代。通过尾静脉注射AAV-PHP.eB递送Cre重组酶，该血清型能穿过血脑屏障进行脑转导。5xFAD/HDAC9-Tgflox-STOP-flox小鼠（5xFAD/HDAC9OE）中观察到广泛的GFP-Cre脑表达，包括海马和皮层。蛋白质印迹分析确认了Cre诱导的FLAG标记HDAC9表达和海马中HDAC9蛋白水平的增加。
在AAV注射后四周，小鼠接受一系列行为测试。在Y迷宫测试中，5xFAD小鼠表现出较低的自发交替率，表明空间工作记忆受损。HDAC9过表达通过提高Y迷宫中的交替率改善了空间工作记忆。此外，HDAC9过表达降低了5xFAD小鼠的总臂进入次数，表明活动过度减少。在NOR测试中，5xFAD小鼠无法区分熟悉和新物体，辨别指数低于WT小鼠。相比之下，HDAC9过表达挽救了这一缺陷，使辨别指数正常化。
为确定HDAC9过表达改善的认知功能是否与突触可塑性改善相关，对另一组小鼠进行海马切片fEPSPs记录。与WT对照组相比，5xFAD小鼠在一系列刺激强度下表现出降低的fEPSP反应。5xFAD小鼠中HDAC9过表达未显著改变输入-输出反应。LTP通过高频刺激诱导后评估。5xFAD小鼠表现出LTP受损，而HDAC9过表达部分恢复了这一缺陷，表明5xFAD/HDAC9过表达小鼠的LTP维持显著改善。
神经元HDAC9过表达减少5xFAD小鼠中的Aβ斑块沉积
为确定HDAC9过表达是否影响5xFAD小鼠的神经病理学，行为测试后采集脑组织进行免疫组织化学分析。使用6E10抗体检测Aβ沉积，该抗体识别APP和Aβ肽的N端氨基酸1-16，检测多种形式的Aβ。在与学习和记忆调节相关且易受AD影响的三个脑区进行了Aβ斑块沉积的定量分析，包括mPFC、海马和内嗅皮层（EC）。
在mPFC中，前边缘（PrL）和下边缘（IL）亚区具有相似的细胞组成和不同的认知过程功能。HDAC9过表达降低了5xFAD/HDAC9OE小鼠mPFC中PrL和IL亚区的Aβ斑块负荷。在海马中，Aβ斑块负荷在CA1、CA3和齿状回（DG）中量化。HDAC9过表达在所有亚区中均导致斑块负荷显著降低，CA3中下降最为明显（CA1：44.34%，CA3：62.92%，DG：58.91%）。此外，5xFAD/HDAC9OE小鼠EC中的Aβ斑块沉积也显著降低。总体而言，这些发现表明神经元HDAC9过表达在5xFAD小鼠多个脑区减轻了Aβ病理。
讨论
在老化过程中，认知能力随着神经病理变化的积累而下降，特别是在海马和前额叶皮层等易受年龄相关退行影响的脑区。突触可塑性受损是老化过程中的特征性神经生物学变化，并与认知下降密切相关。虽然许多研究表明HDACs药理学抑制可改善认知功能和突触可塑性，但现有HDAC抑制剂的亚型选择性有限，仍是界定个体HDAC亚型作用的主要障碍。因此，研究老化和AD过程中特定细胞类型内内源性HDAC的表达和调控对阐明其在生理和病理状态下的特定作用至关重要。
本研究中，我们表征了HDAC9在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的表达，表明HDAC9在人类和小鼠脑中主要在神经元中表达，在星形胶质细胞或小胶质细胞中无或极少表达。这些结果表明HDAC9作为受限于神经元的细胞类型特异性表观遗传或转录调节因子。此外，我们评估了不同年龄HDAC9的表达，发现其在对学习和记忆至关重要的海马和PFC中随年龄增长而减少，表明HDAC9表达改变可能在年龄相关神经元功能障碍和认知衰退中发挥作用。在5xFAD小鼠（一种广泛使用的AD模型）的海马和PFC中也观察到mRNA和蛋白水平的HDAC9表达降低。在另一种常用的AD模型APP/PS1小鼠中，相同脑区的mRNA表达也证实降低。这些发现与人类AD研究一致。总体而言，这些结果表明，HDAC9在老化和AD病理背景下受到动态调控。
此外，HDAC9敲除小鼠表现出认知表现和突触可塑性缺陷，支持HDAC9下调与认知和突触功能障碍之间的因果关系。特别地，HDAC9缺失导致空间工作记忆和物体识别记忆受损。鉴于CA1神经元在海马依赖性记忆的形成、巩固和检索中的关键作用，我们进一步使用AAV-Cre介导的基因敲除研究了HDAC9在成人CA1神经元中的区域特异性作用。我们发现CA1特异性HDAC9敲除小鼠表现出显著的认知缺陷，强化了HDAC9对海马功能和记忆处理的必要性。由于突触可塑性是学习和记忆的基本机制，我们评估了HDAC9缺失对突触功能的影响。HDAC9敲除小鼠表现出正常的基线突触传递，但无法维持海马LTP，这是学习和记忆的细胞相关物，表明突触可塑性受损。
这些观察提出了一个关键问题：增加HDAC9表达是否能在老化过程中维持认知功能。皮层和海马中的谷氨酸能神经元特别容易受到年龄相关变化的影响，这些神经元的结构和功能改变与老化中的认知下降密切相关。为研究这一神经元群体中HDAC9的作用，我们生成了一个条件性敲入小鼠品系，特异性在前脑谷氨酸能神经元中过表达HDAC9，并从年轻成年期到中年再到老年期表征其行为表型。结果显示，HDAC9过表达在6个月和15个月龄时未显著影响认知表现，表明在年轻或中年小鼠神经元中升高HDAC9水平不会增强认知。然而，到21个月龄时，对照小鼠在多个认知领域均表现出显著缺陷，包括空间工作记忆、新物体识别和社交记忆。值得注意的是，HDAC9过表达在老年小鼠中保持了空间工作记忆并改善了社交记忆，表明对年龄相关衰退的保护作用。然而，HDAC9过表达并未改善新物体识别测试中观察到的缺陷，暗示其保护作用可能是任务特异性的。这些发现表明，调节HDAC9表达可能是增强老化脑认知韧性的有希望的策略。
HDAC9在AD小鼠模型的海马和PFC中下调的观察促使研究者调查恢复神经元HDAC9表达是否可以挽救或减轻与AD相关的表型。为解决这一问题，我们利用能穿过血脑屏障的AAV-PHP.eB载体递送由神经元特异性启动子驱动的Cre重组酶，从而在5xFAD小鼠神经元中诱导HDAC9过表达。研究发现，神经元特异性HDAC9过表达足以挽救5xFAD小鼠的认知缺陷。此外，5xFAD小鼠中受损的突触可塑性经HDAC9过表达部分逆转，表明突触可塑性的功能恢复。值得注意的是，在5xFAD/HDAC9OE小鼠中，多个与记忆高度相关且易受AD影响的脑区的Aβ斑块负荷也显著减少。这种Aβ病理的减少表明HDAC9可能通过直接或间接影响Aβ生成/清除发挥作用。
HDAC9调节认知和突触功能的机制可能涉及神经营养信号通路。在HDAC9敲除小鼠中，认知和突触功能及结构的损害伴随海马中BDNF表达降低。相反，在老年小鼠前脑谷氨酸能神经元中过表达HDAC9增加了海马中的BDNF水平。BDNF是突触可塑性和记忆形成的关键调节因子，其失调已被牵涉到年龄相关认知衰退和AD中。在AD中，皮层和海马中BDNF水平显著降低，这被认为会破坏突触可塑性并导致认知障碍。除神经营养作用外，BDNF已被证明可降低Aβ水平，可能通过增强α-分泌酶活性的机制。鉴于这些作用，我们推测BDNF可能部分介导了5xFAD小鼠中观察到的HDAC9诱导Aβ积累减少。未来研究将需确定HDAC9过表达是否增强BDNF信号传导，以及这是否导致认知和神经病理改善。
这些发现支持了一个新概念，即HDAC9下调可能是年龄相关认知衰退、突触脆弱性和AD进展的机制关联。虽然HDACs的药理学抑制通常与认知功能增强相关联，但本结果揭示了HDAC9独特的亚型特异性作用：神经元中HDAC9的过表达在老化过程中维持认知功能，并减轻AD相关认知障碍和神经病理。未来研究应阐明HDAC9调控的下游分子通路。结合HDAC9在老化和AD模型中的下调，我们的数据表明HDAC9不仅对维持认知和突触功能是必要的，而且足以在老化和AD大脑中保持突触认知表现。这些发现将HDAC9定位为缓解年龄相关认知衰退和AD的有希望的治疗靶点。
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