摘要
细胞外囊泡（EVs）介导关键的细胞间通讯，然而调控多泡内体（MVE）与质膜融合及外泌体释放的分子机制仍不甚明了。磷脂酶D1（PLD1）产生磷脂酸（PA），这是一种参与膜重塑的脂质，但PLD1和PA在何时以及如何作用于外泌体分泌过程尚未明确。本研究中，我们利用免疫荧光和全内反射荧光显微镜（TIRFM）在A549细胞中追踪单个CD63⁺ MVE以及荧光标记的PLD1或PA报告蛋白（GFP-PASS）。PLD1在访问、停靠和融合阶段均定位于CD63⁺ MVE上。PLD1的抑制或敲低显著降低了MVE融合频率，减少了分泌的小细胞外囊泡数量，同时仅轻微降低了质膜处的囊泡可用性。PLD1抑制还增加了膜近端溶酶体的数量，表明当融合受损时，MVE被导向降解途径。同时，PA动态呈阶段特异性：在访问阶段的囊泡上PA水平保持较低，在停靠阶段逐渐积累，并在融合阶段出现急剧升高后迅速下降。已有报道称PA可稳定负曲率，并可能在融合过程中发挥作用。为测试PA是否影响融合孔行为，我们量化了单个融合事件的CD63衰减持续时间（t₁/₂）。K均值聚类分析显示，衰减持续时间较长的囊泡具有更高的PA水平，而短衰减事件则显示最小PA水平。PA强度与衰减持续时间呈正相关，而细胞质GFP则无此相关性，表明PA与外泌体释放速率之间存在特定关系。此外，PLD1的药理学激活增加了长衰减事件的比例。综上，这些发现表明PLD1生成的PA在两个层面上调控MVE命运：它促进停靠到融合的转变并延长外泌体释放时间。这揭示了一种同时控制外泌体分泌效率和动力学的基于脂质的机制。
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