摘要
角质形成细胞是肿瘤启动期间黑色素瘤微环境中的主导细胞类型，对黑色素瘤的进展表现出多样化的影响。利用黑色素瘤的斑马鱼模型和人类细胞共培养，我们观察到在黑色素瘤存在的情况下，角质形成细胞经历了类似于伤口愈合过程中的上皮-间质转化（EMT）样转变。令人惊讶的是，在角质形成细胞中过表达EMT转录因子Twist反而导致斑马鱼黑色素瘤模型的总体生存率提高，尽管肿瘤启动率没有变化。这种生存获益归因于黑色素瘤侵袭的减少，这通过人类细胞共培养实验得到了证实。单细胞RNA测序显示，在Twist过表达条件下存在一个独特的黑色素瘤细胞簇，表现出更加分化、侵袭性更低的表型。进一步分析确定了过表达Twist的角质形成细胞与黑色素瘤细胞之间的同型jam3b-jam3b和pgrn-sort1a相互作用可能是抑制侵袭的潜在媒介。我们的研究结果表明，肿瘤微环境中的EMT可能通过改变细胞间相互作用而矛盾地限制黑色素瘤侵袭。
引言
癌症细胞与其微环境之间的复杂相互作用已成为肿瘤进展和治疗反应的关键决定因素。在黑色素瘤中，肿瘤微环境（TME）包含多种细胞类型，包括免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞。然而，在黑色素瘤启动期间，TME中的主导细胞类型是角质形成细胞，这是一种构成我们皮肤表面大部分的上皮细胞。在正常稳态下，每个黑色素细胞与30-40个角质形成细胞相互作用，这种相互作用对皮肤和头发颜色至关重要。尽管经过数十年的研究，我们对黑色素瘤背景下角质形成细胞的理解仍然不完整。
角质形成细胞已被证明既能促进又能抑制肿瘤启动。它们与黑色素细胞紧密粘附，这可以抑制肿瘤发展，因为新生的黑色素瘤细胞无法逃离表皮。先前的研究表明，新启动的黑色素瘤细胞必须通过丢失PAR3等蛋白质来逃离这种粘附网络。相比之下，角质形成细胞也可以通过分泌内皮素等生长因子或通过两种细胞类型之间的GABA能串扰来促进肿瘤发展。
这些相互矛盾的数据突显了角质形成细胞与新生黑色素瘤细胞之间的相互作用可能是动态的，并且在肿瘤启动过程中迅速变化。在人类样本中研究这些相互作用的性质具有挑战性，因为活检是在患者就诊后进行的，这意味着肿瘤启动的最早期相互作用将被错过。因此，需要能够忠实地重现肿瘤启动最早阶段的模型，同时具有细胞分辨率来测量黑色素瘤细胞和角质形成细胞之间的相互作用。
在这项研究中，我们利用斑马鱼黑色素瘤模型来研究黑色素瘤细胞与其邻近角质形成细胞之间的最早期相互作用。斑马鱼已成为癌症研究的有力工具，因为它们具有遗传可操作性、保守的生物学特性，以及能够在完整生物体的背景下实时可视化肿瘤发展和进展的能力。通过细胞类型特异性遗传操作、体内成像和单细胞转录组学的组合，我们发现肿瘤相关角质形成细胞（TAKs）经历了与EMT相关的改变，类似于伤口皮肤中发现的变化。出乎意料的是，我们发现这种角质形成细胞EMT抑制了黑色素瘤的进展。这种角质形成细胞的变化发生在黑色素瘤启动后不久，导致这些新生肿瘤细胞更具粘附性，阻止它们移出表皮。我们的数据表明，黑色素瘤启动修订了附近皮肤环境中的进化保守伤口反应，这种反应作为一种细胞外在肿瘤抑制因子，防止新转化的细胞变成完全致瘤性。
结果
黑色素瘤启动与角质形成细胞中的EMT相关
为了研究角质形成细胞和黑色素瘤细胞之间的关系，我们创建了一个转基因斑马鱼系，在该系中GFP在krt4启动子下表达。该品系准确地标记了存在于鱼表皮和鳞片中的所有成年角质形成细胞。然后，我们在该背景下启动黑色素瘤，使用TEAZ方法（成年斑马鱼的转基因电穿孔），在这种方法中，包含致癌基因或针对肿瘤抑制因子的sgRNAs的质粒可以直接引入皮肤。这种方法的主要优势是我们可以在肿瘤处于早期阶段时可视化黑色素瘤启动，此时肿瘤仅由少量细胞组成。我们使用BRAFV600E、针对PTEN（ptena/b）的sgRNAs以及p53的生殖系缺失来启动肿瘤。
为了评估TAKs变化时对电穿孔引起的皮肤伤口的考虑，我们还使用了对照载体进行了TEAZ，该载体标记了黑色素细胞前体但不诱导黑色素瘤形成。电穿孔后8周的荧光成像显示，对照载体处理的鱼表皮无伤口，而使用致癌载体处理的斑马鱼则表现出明显的黑色素瘤发展。
为了更好地研究角质形成细胞的变化，我们对TEAZ后8周的鱼进行了共聚焦显微镜检查。这揭示了肿瘤携带鱼中角质形成细胞形态的明显破坏，在对照鱼中未观察到这种现象。我们特别注意到细胞-细胞连接的破坏、角质形成细胞的无序排列模式以及正常六边形细胞层的丧失。这些变化类似于角质形成细胞EMT，这在先前的伤口表皮中已被注意到。
为了进一步评估这种可能性，我们切除肿瘤和对照皮肤组织，并使用FACS分离角质形成细胞（GFP+）和黑色素瘤细胞（tdTomato+）并进行qPCR。如预期，我们发现黑色素瘤细胞中mitfa富集，角质形成细胞中krt4富集，验证了成功细胞类型分离。TAKs与无黑色素瘤皮肤中的正常角质形成细胞（NKCs）之间的比较分析显示EMT标志物波形蛋白和N-钙粘蛋白上调，与我们的成像结果一致。
我们接下来询问这些变化是否也在人类样本中看到。为此，我们进行了角质形成细胞和黑色素瘤细胞之间的共培养实验。我们将GFP标记的HaCaT角质形成细胞单独培养或与A375黑色素瘤细胞共培养21天，然后通过FACS分离用于批量RNA测序。与我们在鱼体内的结果一致，共培养HaCaT细胞中改变的前通路是EMT富集。差异基因表达分析显示，与单培养对照相比，共培养角质形成细胞中间充质标志物波形蛋白和N-钙粘蛋白显著上调，与体内发现类似。综合来看，我们的数据表明黑色素瘤细胞在附近的角质形成细胞中诱导了EMT的形态和分子标志。
EMT转录因子在肿瘤相关角质形成细胞中上调
EMT通常由上游转录因子驱动，这些转录因子随后作用于下游靶标，以抑制粘附分子如E-钙粘蛋白或激活其他粘附分子如N-钙粘蛋白。接下来，我们想知道这些转录因子中哪一个负责我们角质形成细胞中EMT样行为。为此，我们利用了现有的斑马鱼黑色素瘤单细胞RNA测序数据集。通过UMAP的降维和后续聚类显示了两个角质形成细胞群体，如通过针对角质形成细胞群体中富集基因的模块评分所示。后续差异基因表达和基因集富集分析（GSEA）显示一个角质形成细胞簇中EMT富集，与我们上面观察到的类似。我们将这个EMT簇称为TAKs，另一个簇称为NKCs。我们关注了三个在斑马鱼角质形成细胞中表达的EMT转录因子：snai1a、snai2、twist1a，它们是人类SNAIL、SLUG和TWIST的斑马鱼同源物。差异表达显示TAK与NKC簇之间snai1a和twist1a显著富集。TAK簇中twist1a的显著富集，加上其在NKCs中的罕见表达，使twist1a成为进一步研究其在驱动角质形成细胞EMT样变化中潜在作用以及对黑色素瘤进展影响的有希望候选者。
角质形成细胞Twist抑制斑马鱼中的黑色素瘤侵袭
在确定Twist可能是TAKs中EMT样变化的潜在驱动因素后，我们接下来询问它如何影响黑色素瘤表型。我们在BRAF驱动的黑色素瘤背景下创建了新的转基因斑马鱼，在这些鱼中krt4启动子用于驱动两个斑马鱼TWIST旁系同源物（twist1a和twist1b）。在这个实验中，我们使用标准的1细胞注射质粒而不是TEAZ，以确保结果对不同的黑色素瘤启动测定更具普遍性。在受精后5天对注射的胚胎进行分选，选择tdTomato（黑色素细胞）和GFP（角质形成细胞）表达，表明黑色素细胞和角质形成细胞转化成功。这些是嵌合动物，而不是稳定品系，因此我们可以直接评估TWIST对黑色素瘤生长的影响（尽管这阻止了我们检查TWIST在角质形成细胞中但附近无黑色素瘤时的影响）。我们在接下来的26周内监测鱼的肿瘤自由生存率和总体生存率。有趣的是，我们发现TWIST过表达条件下与空载体相比，黑色素瘤启动率没有差异。然而，出乎意料的是，我们注意到在角质形成细胞中表达TWIST的转基因动物总体生存率有所提高。
这种黑色素瘤自由生存率和总体生存率之间的差异表明，TWIST条件下的肿瘤表型应与对照肿瘤不同。为了评估这一点，我们对对照和TWIST条件下的肿瘤（每个条件n=3）及其周围组织进行了免疫组织化学分析。该黑色素瘤模型中的致癌驱动因子是hBRAFV600E，作为肿瘤细胞的IHC标记物。hBRAFV600E染色的比较显示，在对照条件下黑色素瘤显著侵入斑马鱼体内，而在TWIST条件下几乎是非侵入性肿瘤。当黑色素瘤在其他解剖位置发育时也观察到缺乏黑色素瘤侵袭，尽管因为生存率在约26周时开始下降，我们无法让这些鱼生长更长时间以观察它们是否最终在很晚的时间点变得具有侵入性。这些发现表明krt4启动子驱动的twist1a/twist1b过表达不会损害肿瘤启动，而是通过在微环境中表达来损害黑色素瘤侵袭并提高生存率。
因为这是一个有些出乎意料的发现，我们想要确保这并非斑马鱼系统的假象。因此，我们开发了一种测量人类角质形成细胞和黑色素瘤细胞之间相互作用的测定方法。为了模拟黑色素瘤侵入邻近细胞，我们开发了一种新型基于细胞培养的侵袭测定，使用HaCaT系和多种黑色素瘤细胞系。将培养在聚-L-赖氨酸包被盖玻片上的黑色素瘤细胞置于角质形成细胞顶部，允许在20小时后评估黑色素瘤细胞浸润。
HaCaT角质形成细胞通过慢病毒感染转化，过表达TWIST1（HaCaT-TWIST）或空载体对照（HaCaT-CTRL）。Western blot分析确认了HaCaT-TWIST与HaCaT-CTRL相比Twist蛋白的稳健过表达，并且免疫荧光成像显示了Twist的核定位。HS294T黑色素瘤细胞与HaCaT-TWIST的共培养导致与HaCaT-CTRL相比，黑色素瘤细胞侵入角质形成细胞显著减少，这与我们在斑马鱼系统中上面观察到的相似。这一发现通过使用SKMEL2得到证实，证明了在角质形成细胞中TWIST1过表达对黑色素瘤侵袭的抑制作用在不同细胞系中是一致的。
然而，也有可能TWIST角质形成细胞中缺乏某些东西导致黑色素瘤侵袭减少（而不是主动抑制侵袭）。为了测试这一点，我们还进行了一项对照测定，允许tdTomato黑色素瘤细胞侵入相同细胞系的未标记黑色素瘤。使用HS294T和SKMEL2细胞，这些细胞在这种设置中确实具有一些迁移能力。该测定无法区分TWIST角质形成细胞是否主动抑制侵袭vs. 缺少促进侵袭的东西，这将是未来研究的领域。综合来看，我们的结果表明，角质形成细胞中EMT的诱导与黑色素瘤侵袭减少和动物生存率提高相关。
角质形成细胞EMT促进与新生黑色素瘤细胞的异常粘附
虽然肿瘤细胞内的EMT被广泛认为促进侵袭，但我们的数据显示微环境中的EMT矛盾地抑制肿瘤侵袭。我们想要更好地了解导致这一结果的下游机制。因此，我们使用单细胞RNA测序分析了我们的对照vs. TWIST肿瘤，这将使我们了解黑色素瘤细胞如何与这些角质形成细胞相互作用的潜在机制。
将三条鱼每种条件（对照或TWIST）的黑色素瘤和相邻皮肤分离成单细胞悬液，并通过FACS分选eGFP+角质形成细胞和tdTomato+黑色素瘤细胞。为了富集角质形成细胞群体，将角质形成细胞和黑色素细胞悬液按每种条件7:3的比例组合，并准备用于单细胞RNA测序。得到的对照和TWIST数据集按照描述进行了质量控制过滤。
整合数据集的UMAP降维显示了黑色素瘤和角质形成细胞的独特簇，角质形成细胞簇中具有高eGFP表达，黑色素瘤簇中具有高tdTomato表达。此外，我们在对照和TWIST条件中都发现了两个角质形成细胞簇，而在TWIST条件中发现了第三个角质形成细胞簇。我们对簇之间进行了差异基因表达分析，并对两种条件中都存在的两个簇之间差异表达的基因进行GSEA，显示EMT富集，如图2所示，确定了EMT富集群为TAK，另一个为NKC。如预期，我们还确定了一个仅在TWIST数据集中存在的独特角质形成细胞簇，该簇高表达twist1a/b，这是我们过表达的基因，并将该簇标记为Twist-High。
我们首先通过将它们的基因特征与人类黑色素瘤细胞状态的精心注释特征进行比较，分析了在对照vs. TWIST动物中出现的黑色素瘤。现在已经广泛认识到，黑色素瘤至少存在四种不同的转录状态，从未分化/侵袭性到神经嵴，再到中间状态，再到黑色素细胞/增殖性。这些不同的状态是相互排斥的，但表现出高度可塑性，在状态之间相互转换。有趣的是，我们发现仅在TWIST条件下发育的黑色素瘤细胞簇富集了黑色素细胞/增殖状态，而非未分化/侵袭性基因标志物。与此一致，TWIST条件的GSEA也显示氧化磷酸化显著富集，我们先前已证明这代表黑色素细胞状态。由于这种状态是侵袭性最低的状态之一，这与我们的体内观察结果一致，即这些黑色素瘤表型侵袭性较低。
我们假设这种细胞状态的变化可能是由TWIST角质形成细胞和黑色素瘤细胞之间的物理相互作用引起的。为了解决这个问题，我们使用CellChat分析了潜在的细胞间相互作用，这是一个软件工具，允许我们使用精心策划的斑马鱼配体-受体相互作用数据库定量表征和可视化细胞间通信。
确定了两个仅在TWIST角质形成细胞和在这些动物中出现的黑色素瘤之间发生的独特配体-受体配对：同型jam3b-jam3b相互作用和pgrn-sort1a（progranulin-sortilin）相互作用。
jam3b相互作用对我们特别感兴趣，因为该蛋白最近被确定为斑马鱼中黑素细胞存活所需的关键蛋白，以及人类黑色素瘤转移所需的关键蛋白。在正常人类皮肤中，JAM3在表皮浅层的角质形成细胞中表达，而其异型伙伴JAM1仅在基底角质形成细胞中表达。由于黑色素瘤主要在该基底层中形成，这表明TWIST在角质形成细胞中的表达导致jam3b的异常表达，形成这些角质形成细胞和黑色素瘤细胞之间更强的同型jam3b-jam3b连接，阻止它们侵袭。
人类研究中的保守性
最后，我们希望确定斑马鱼模型中我们的TWISThi状态是否也存在于人类黑色素瘤中。我们使用GeoMX空间转录组学平台来研究一系列早期黑色素瘤前体病变，这是使用该方法研究黑色素瘤阶段空间组织的更大研究的子集。我们首先使用抗体染色切片以标记角蛋白（标记角质形成细胞）和SOX10/MART1（标记黑色素细胞和黑色素瘤细胞）。这允许选择微区域（MR），然后对其进行RNA测序。从中，我们查询了在斑马鱼中发现的TAK/TWIST基因集。虽然正常皮肤黑色素细胞未显示这种富集，但随着病变从早期进展到晚期前体，这些特征富集（图6E）。这表明角质形成细胞中的EMT样改变是斑马鱼和人类黑色素瘤中的早期事件。
讨论
在这项研究（总结于图7）中，我们观察到斑马鱼黑色素瘤模型中的角质形成细胞在黑色素瘤存在的情况下经历EMT样转变。这种改变类似于角质形成细胞在伤口愈合过程中的行为，在伤口愈合过程中，角质形成细胞表现出与发育中EMT相关的标志物和形态变化。有趣的是，我们还在角质形成细胞中观察到N-钙粘蛋白表达的增加，这通常归因于黑色素瘤，因为当黑色素瘤变得更加侵袭性并侵入真皮与成纤维细胞相关联时。我们的发现表明，如果角质形成细胞也上调N-钙粘蛋白表达，它们对黑色素瘤的正常接触为基础的调控可能仍然相关，尽管不是通过E-钙粘蛋白起作用。
此外，对已发表的斑马鱼黑色素瘤单细胞RNA测序数据集的重新分析显示了表达EMT标志物的独特角质形成细胞群体，证明了使用我们的斑马鱼模型研究该角质形成细胞群体的可行性，并提名Twist1作为该细胞中有效的EMT-TF。Twist表达已被发现在用bFGF处理的伤口皮肤边缘上调，bFGF是黑色素瘤中公认的生长因子。如果黑色素瘤作为皮肤上的开放伤口，那么Twist1可能在TAKs中上调以关闭这个伤口。
我们的斑马鱼黑色素瘤生存实验显示，在角质形成细胞过表达Twist的斑马鱼中总体生存率有所提高，尽管这些鱼形成肿瘤的速率与接受空载体的鱼相同。这种生存率的提高被证明是由黑色素瘤侵袭减少引起的，这表明过表达Twist的角质形成细胞可能抑制黑色素瘤侵袭。人类细胞共培养显示，过表达Twist的HaCaT细胞共培养导致黑色素瘤细胞浸润减少，这与我们在体内斑马鱼模型中的发现相似。
为了了解黑色素瘤和TME角质形成细胞之间的动态，我们对我们的斑马鱼黑色素瘤模型进行了单细胞RNA测序，以同时考虑与黑色素瘤接触的角质形成细胞和周围角质形成细胞。这在过表达Twist的鱼中产生了三个角质形成细胞簇，而在接受空载体的鱼中则有两个簇；这对应于我们在先前对斑马鱼黑色素瘤单细胞RNA测序数据集的重新分析中观察到的角质形成细胞群体。
有趣的是，我们在TWIST条件下发现了一个独特的黑色素瘤细胞簇，其共享与Tsoi等人发表的过渡态和黑色素细胞态相似的基因特征。这些细胞状态被定义为更加分化，具有更高的MITF表达，并与Hoek等人报告的更具增殖性但侵袭性更低的群体相关。因此，这个在TWIST条件下独特的黑色素瘤细胞簇很可能是导致黑色素瘤总体侵袭减少的原因。
通过CellChat进一步分析确定了pgrn-sort1a和jam3b-jam3b作为Twist-High角质形成细胞和TWIST-黑色素瘤细胞之间的独特相互作用。如前所述，jam3b已被确定为斑马鱼中黑素细胞存活所需的关键蛋白，与黑色素瘤转移有关。过表达Twist的角质形成细胞上jam3b的异常表达可能表明与黑色素瘤jam3b的同型相互作用将黑色素瘤保留在表皮中。尽管progranulin-sortilin相互作用在黑色素瘤中尚未表征，但sortilin已被确定为调节progranulin水平的关键因子。Progranulin已知由角质形成细胞组成型表达，可被切割成促进角质形成细胞增殖的epithelins。Progranulin也是由真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞产生的伤口反应的强效介质。也许progranulin的增加被黑色素瘤细胞通过sortilin清除，导致sortilin的内吞和溶酶体运输。Sortilin的降解可能是细胞迁移和侵袭减少的原因，因为sortilin需要与黑色素瘤产生的神经营养因子proNGF与NGFR相互作用以促进黑色素瘤迁移。需要进一步研究来阐明所确定的相互作用jam3b-jam3b和pgrn-sort1a的精确机制，并探索它们作为黑色素瘤治疗靶点的潜力。
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