p63影响角质形成细胞衰老过程中的不同代谢途径，通过代谢组学谱型和基因表达分析进行评估
Maria Cristina Piro1, Rosalba Pecorari2, Artem Smirnov1,2, Angela Cappello1,3, Erica Foffi1
摘要
本文通过代谢组学谱型和基因表达分析，探讨了p63在角质形成细胞衰老过程中的作用。结果表明，p63影响多个代谢途径，包括能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢。这些发现为进一步了解p63在细胞衰老中的功能提供了重要线索。
引言
细胞衰老是一个复杂的生物学过程，涉及多种分子机制。p63是一种转录因子，与p53家族成员密切相关，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。近年来，越来越多的研究表明p63在细胞衰老过程中也扮演着关键角色。然而，p63如何影响代谢途径的具体机制尚不明确。本研究通过代谢组学谱型和基因表达分析，系统地探讨了p63在角质形成细胞衰老中的作用。
材料与方法
代谢组学分析
样品在两种独立的注射条件下使用专用柱进行负离子优化条件下的代谢组学分析。酸性条件下的提取物使用含有0.1%甲酸的水和甲醇进行梯度洗脱，而碱性提取物则使用含有6.5 mM碳酸氢铵的水/甲醇进行洗脱。质谱分析交替进行MS和数据依赖性MS2扫描，采用动态排除法。
气相色谱/质谱（GC/MS）分析
用于GC/MS分析的样品在真空干燥器中至少干燥24小时，然后在干燥氮气下用双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化。GC柱为5%苯基，温度梯度从40°C升至300°C，时间为16分钟。样品在Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四极杆质谱仪上使用电子轰击电离进行分析。仪器每天调谐和校准，以确保质量分辨率和准确性。从原始数据文件中自动提取信息输出。
高精度质量测定和MS/MS片段化（LC/MS），（LC/MS/MS）
平台的LC/MS部分基于Waters ACQUITY UPLC和Thermo-Finnigan LTQ-FT质谱仪，前端为线性离子阱，后端为傅里叶变换离子回旋共振质谱仪。对于计数大于2百万的离子，可以进行高精度质量测量。高精度质量测量可以在母离子及其片段上进行，典型的质量误差小于5 ppm。计数小于2百万的离子需要更多的努力来表征。片段化光谱（MS/MS）通常以数据依赖性方式生成，但必要时也可以使用目标MS/MS，例如在低水平信号的情况下。有关Metabolon分析角质形成细胞样品的更多信息，请参阅补充材料。
RNA提取和RT-qPCR
使用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。通过NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度和纯度。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）将1 μg RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行定量PCR。每个反应均设置三个技术重复。使用GAPDH基因进行数据归一化。每个基因的表达由阈值循环（Ct）定义，相对表达水平通过2-ΔΔCt方法计算。统计分析使用GraphPad Prism 9.5.1.733软件进行。
Western印迹
总细胞提取物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到Amersham Hybond PVDF膜（GE Healthcare）上。膜在4°C下与一抗孵育过夜，洗涤后在室温下与相应的二抗（兔和小鼠；Bio-Rad，Hercules，CA，USA）杂交1小时。使用以下一抗：抗p63（Cell Signaling，D9L7L）；抗p16（Santa Cruz Biotechnology（JC8）：sc-56330），抗p53（Santa Cruz Biotechnology（DO-1）：sc-126），抗β-actin（Sigma，AC-15：A5441）和抗GAPDH（Sigma：G8795）。未裁剪的印迹文件见补充材料。
参考文献
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贡献
EC设计研究；AML准备sip63和p1Vsp2角质形成细胞的代谢组学实验样品；MCP、RP、AC和EF进行WB和RT-qPCR实验，RP对可用数据集进行ChIP-seq生物信息学分析。MCP分析代谢组学数据。GM、AS和EC讨论和分析数据并修订草稿。MCP撰写论文。
通讯作者
通讯作者：Eleonora Candi
伦理声明
利益冲突
YS是《Cell Death & Disease》的编辑，EC和GM是编辑。
出版商注释
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补充信息
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