摘要
已有研究证明，散发型（>95%的病例）阿尔茨海默病（AD）的临床前期可持续数十年，但疾病何时开始发展及其成因仍是一个未解之谜。研究表明，AD的易感性可能受到生命早期形成的脑部解剖和功能参数的影响。我们对加速衰老的OXYS大鼠（一种独特的AD模型）的研究支持了这一观点。在这些大鼠中观察到的大脑成熟延迟与胶质支持不足相关，而胶质细胞是神经网络功能的关键调节因子；OXYS大鼠AD症状的出现和发展之前及同时伴随着线粒体功能障碍。这引发了一个问题：线粒体的结构和功能特征是否会影响大脑成熟过程，从而决定日后发展AD症状的易感性。本研究比较了OXYS大鼠和Wistar大鼠（对照组）在大脑成熟完成期（从出生到20天龄）前额叶皮层和海马体中线粒体生物发生、线粒体在神经元胞体、轴突和树突过程中的转运及其结构状态，以及线粒体动力学过程的活性。线粒体数量和超微结构参数的变化与通过线粒体融合或分裂频率评估的动力学过程参数、关键生物发生蛋白PGC-1α的含量，以及介导线粒体动力学的蛋白（线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2、动力相关蛋白DRP1）进行了比较。在OXYS大鼠中，我们识别出出生后早期线粒体装置形成的偏差，这些偏差可能导致这些大鼠的大脑成熟延迟、促进线粒体功能障碍、降低突触密度，并最终导致神经元死亡和早期神经退行性变化的发展。
引言
到2050年，全球60岁及以上人口预计将达到约20亿（WHO，2018），其中超过1.5亿人将患有阿尔茨海默病（AD），AD正成为老年痴呆症的主要原因[1]。因此，阐明AD发展的分子和生物学前提及机制，以及基于这些知识开发早期诊断和预防方法的相关性日益增加。现代诊断方法已确定，散发型（>95%的病例）AD的临床前期可持续数十年，但疾病何时开始发展及其成因仍是一个争论话题[2]。
根据近年来的流行病学和实验研究结果，生命后期认知能力下降和加速衰老（AD发展的主要风险因素）的前提可能已经在出生后早期形成，此时大脑发育完成[3-10]。我们对加速衰老的OXYS大鼠（一种独特的散发型AD模型）的研究也支持了这一观点。我们确定了OXYS大鼠在出生后早期（从出生到20天龄）的大脑成熟特征，这些特征可能成为早期神经退行性变化发展的前提[11-13]。特别是，我们发现OXYS大鼠大脑发育的完成是在海马体和前额叶皮层中星形胶质细胞和小胶质细胞支持减少的背景下发生的——这些是神经网络功能的关键调节因子。胶质支持不足可能是OXYS大鼠中观察到的神经元间接触形成效率降低的原因，这可以被视为通向日后AD症状发展的关键事件[14]。同时，我们先前已表明OXYS大鼠AD症状的发展之前及同时伴随着年龄相关的线粒体功能障碍[15-18]。因此，我们证实了"线粒体级联假说"的有效性[19,20]，根据该假说，散发型AD的发病机制基于年龄相关的线粒体功能障碍。我们使用OXYS大鼠进行的研究还使我们提出了一个问题：遗传决定的线粒体结构和功能特征是否会影响出生后早期的大脑成熟过程，从而决定日后发展AD的易感性。
本研究旨在调查OXYS大鼠在出生后早期前额叶皮层和海马体中线粒体生物发生、神经元胞体、轴突和树突过程中的结构状态，以及线粒体动力学和转运过程的特征，并评估它们对未来发展早期神经退行性变化的可能贡献。
材料与方法
动物。 本研究在俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞遗传学研究所"实验动物基因库"共享研究设施中使用雄性Wistar和OXYS大鼠进行。动物在标准实验室条件下（22±2°C，12小时光照/黑暗周期）饲养在笼子（57×36×20厘米）中，可自由获取水和实验动物的标准颗粒饲料（BioPro，俄罗斯）。
电子显微镜。 用二氧化碳使大鼠安乐死并斩首。分离前额叶皮层和海马体，从中切割立方形状（2×2×2毫米）的组织样本。将分离的脑碎片在缓冲液（2.5%戊二醛，1.5%多聚甲醛，0.1 M二甲砷酸盐缓冲液）中室温固定1小时，用缓冲液洗涤两次，在含有几个铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）晶体的1%四氧化锇水溶液中后固定1小时，然后在1%醋酸铀酰水溶液中孵育过夜。第二天，样品在一系列乙醇和丙酮溶液中脱水，并嵌入Epon 812树脂（Electron Microscopy Sciences，美国）中。通过在60°C下保持3天实现样品的完全聚合。使用Leica Ultracut EM UC6超薄切片机（Leica Microsystems GmbH，德国）获得超薄切片（65纳米）。使用JEOL JEM 1400电子显微镜（JEOL Ltd.，日本）在俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞遗传学研究所生物对象微观分析共享研究设施（Novosibirsk，俄罗斯）以2800×和3500×（神经元胞体）和12,000×（神经毡）的放大倍数检查切片。根据Paxinos和Watson[21]确定脑结构（前额叶皮层的第IV层（Bregma 4.68 – Bregma 3.72 mm）和海马体的CA1区域（Bregma – 2.28 – Bregma – 3.60 mm））。
为评估OXYS和Wistar大鼠（n = 3）中线粒体的结构和功能参数，在0、7、14和20天龄时分析了40-60个前额叶皮层的锥体神经元，在7、14和20天龄时分析了海马体的锥体神经元。为评估OXYS和Wistar大鼠（n = 3）前额叶皮层和海马体神经毡中线粒体的参数，从每只动物获得3-4个切片，每个切片拍摄15张照片，总计每只大鼠45-60张照片。统计分析基于每只动物每个切片的平均数据进行（每组n = 12-15）。使用ImageJ软件评估神经元胞体、轴突和树突过程中线粒体的超微结构、数量和定位，以及线粒体动力学过程的活性。评估线粒体超微结构的标准如下：1）完整线粒体——完整的嵴、线粒体膜，无脱颗粒和线粒体基质水合；2）中度改变的线粒体——部分破坏的嵴结构，脱颗粒，线粒体基质水合形成线粒体内部的空泡状"空腔"，目视估计约占其面积的15-50%；3）严重改变的线粒体——极度破坏的嵴结构：异常变薄的嵴，失去原始外观；脱颗粒，线粒体基质水合超过线粒体面积的50%；在这种情况下，线粒体显著增大（"肿胀"）/外膜完整性丧失（"破裂"）[15]。
蛋白质印迹分析。 将0、7、14和20天龄的Wistar和OXYS大鼠前额叶皮层和海马体样品（n = 5-6）使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich，美国）的RIPA裂解缓冲液进行匀浆。使用双辛可宁酸（BCA）（Thermo Fisher Scientific，美国）测定总蛋白浓度。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离，转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，美国）上，并在10 mM磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中用5%牛血清白蛋白封闭1小时。然后将膜在4°C下与针对PGC-1α、线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、Drp1、β-肌动蛋白（ab54481、ab57602、ab50838、ab56788、ab1801，Abcam，美国；1:1000）、Miro1、Miro2、Trak1和Trak2（PA572835、PA596182、PA570029、MA527606，Invitrogen，美国；1:1000）的一抗在4°C下过夜孵育，然后与二抗（抗兔和抗小鼠抗体（ab6721和ab97046；Abcam；1:5000））孵育1小时。使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad）检测信号强度，并使用ImageJ软件（NIH，美国）进行评估。
统计分析。 使用Statistica 10.0软件包（Statsoft，美国）进行统计分析。使用具有事后组均值比较（Newman-Keuls检验）的因子方差分析（ANOVA）。数据以M ± S.E.M.表示。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
结果
出生后早期的线粒体生物发生、数量和结构状态。 线粒体是与其形态和功能密切相关的动态结构。它们的数量、大小和形状由生物发生、分裂、融合和线粒体自噬过程决定；它们与其他细胞器积极相互作用，形成膜接触[22]。基于关键蛋白PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1-α）的水平[23]评估了OXYS和Wistar大鼠出生后早期前额叶皮层和海马体神经元中线粒体生物发生状态。方差分析显示，PGC-1α的水平取决于动物的基因型，在OXYS大鼠的前额叶皮层（F1,32 = 8.26，p < 0.008；图1a和c）和海马体（F1,32 = 14.13，p < 0.001；图1b和d）中较低。根据组均值的比较，与同龄Wistar大鼠相比，OXYS大鼠在两个脑结构中的PGC-1α水平在出生时和7天龄时（海马体中p < 0.05）显著较低。
图1.
Wistar和OXYS大鼠出生后大脑成熟完成期间前额叶皮层（PFC）（a）和海马体（b）中PGC-1α蛋白含量。前额叶皮层（c）和海马体（d）的代表性印迹图像。使用β-肌动蛋白作为对照。锥体神经元（e，上层面板）和神经毡（e，下层面板）的代表性电子显微镜图像。线粒体（m）位于神经元胞浆中。神经元胞体被神经毡包围；在轴突和树突过程中可见线粒体（黄色箭头）。显示了前额叶皮层（f，h）和海马体（g，i）神经元胞浆和神经毡中每100μm²的线粒体数量。数据以M ± S.E.M.表示。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
通过电子显微镜（EM）（图1e）使用其数量和结构状态评估了出生后早期OXYS和Wistar大鼠前额叶皮层和海马体锥体神经元中线粒体装置形成的效率。在两个大鼠品系中，前额叶皮层神经元胞体中线粒体的数量在此期间单向变化（F3,143 = 3.6，p < 0.02；图1f）。在海马体中，它取决于动物的基因型（F1,316 = 7.99，p < 0.005）和年龄（F2,316 = 5.8，p < 0.004；图1g）。在Wistar大鼠中，线粒体数量在7天龄时达到最大值，并在两周龄时减少（p < 0.001）。相反，在OXYS大鼠中，神经元胞体中的线粒体数量在7天龄时最小，并在20天龄时增加（p < 0.01）。结果，与同龄Wistar大鼠相比，OXYS大鼠在7天龄时神经元线粒体的密度（p < 0.01）较低，而在14和20天龄时较高（分别为p < 0.01和p < 0.001）。
方差分析显示，前额叶皮层和海马体神经毡（轴突和树突过程）中线粒体的数量（图1h和i）取决于基因型（F1,91 = 13.2，p < 0.0005和F1,66 = 18.5，p < 0.0001）并且随着两个品系大鼠的年龄增长而增加（F3,91 = 136.4，p < 0.0001和F2,66 = 90.1，p < 0.0001）。然而，在OXYS大鼠中，该参数在海马体中14天龄时和在两个脑结构中20天龄时高于Wistar大鼠（所有p < 0.01）。
根据结构状态评估线粒体。 根据结构状态评估线粒体显示，在出生后早期两个品系大鼠的前额叶皮层中，具有完整超微结构的细胞器的特定含量单向变化（F3,313 = 26.7，p < 0.0001），在14天龄时达到最大值，在20天龄时最小（图2a）。具有中度改变超微结构的线粒体含量也仅取决于年龄（F3,313 = 18.6，p < 0.0001）：在Wistar和OXYS大鼠中，该参数在两周龄时减少，并在20天龄时增加两倍。具有明显改变的细胞器的特定含量在两个大鼠品系中在一周龄时减少，并在20天龄时增加（F3,313 = 13.4，p < 0.0001），并且在OXYS大鼠中在7和20天龄时较高（F1,313 = 6.1，p < 0.02）。
图2.
按结构退化程度在前额叶皮层（a）和海马体（b）神经元中的线粒体特定含量。14天龄OXYS大鼠海马体CA1区域中锥体神经元（N）和神经毡（神经毡）的代表性电子显微镜（EM）图像（c）。具有中度明显破坏性变化的线粒体（m）（黄色虚线）。数据以M ± S.E.M.表示。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
在两个大鼠品系的海马体中（图2b），具有完整超微结构的细胞器的特定含量在一周龄时达到最大值，在20天龄时减少（F2,193 = 89.2，p < 0.0001），并且在OXYS大鼠中较低（F1,193 = 4.8，p < 0.03）。具有中度改变超微结构的线粒体含量（图2c）仅取决于年龄（F2,193 = 61.6，p < 0.0001）：在Wistar和OXYS大鼠中，该参数在20天龄时增加。具有明显改变的细胞器的特定含量在OXYS大鼠中较高（F1,193 = 6.6，p < 0.02）并且在两个大鼠品系中在20天龄时增加（F2,193 = 54.8，p < 0.0001）。
出生后早期的线粒体动力学。 通过存在正在进行融合或分裂的接触线粒体（图3a）来评估线粒体动力学过程。发现前额叶皮层神经元胞体中此类线粒体的特定含量不依赖于年龄（F3,143 = 0.05，p = 0.98），并且与Wistar大鼠相比，在14和20天龄时在OXYS大鼠中显著较低（p < 0.05；图3b），表明线粒体动力学强度显著降低。在两个大鼠品系的海马体中，接触线粒体的比例在7天龄时达到最大值，并在两周龄时减少（F2,315 = 3.9，p < 0.05；图3c）。在神经毡中，该参数仅依赖于年龄——在前额叶皮层中在14天龄时减少，并在20天龄时增加（F3,91 = 5.3，p < 0.003；图3d），而在海马体中则相反，在20天龄时减少（F2,66 = 3.4，p < 0.05；图3e）。
图3.
神经毡的代表性EM图像；轴突过程包含正在进行分裂/融合的线粒体（黄色箭头）。右侧面板显示更高放大倍数的线粒体（a）。前额叶皮层和海马体神经元胞体（b，c）和神经毡（d，e）中正在进行分裂/融合的线粒体占线粒体总数的特定含量。数据以M ± S.E.M.表示。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
直接参与线粒体动力学调节的蛋白Mfn1和Mfn2在线粒体融合过程中起关键作用，而Drp1对它们的分裂和线粒体自噬是必需的[24]。使用蛋白质印迹分析评估了OXYS和Wistar大鼠出生后早期大脑中这些蛋白含量的变化。
在前额叶皮层（图4a）中，两个品系大鼠Mfn1的含量随年龄单向变化（F3,40 = 6.069；p < 0.002），在Wistar大鼠中，该水平在14天龄时显著增加，在20天龄时减少（两个p < 0.002）。Mfn2的含量取决于动物的基因型（F1,40 = 40.2；p < 0.001）：在OXYS大鼠中，其水平在出生时、7天龄和20天龄时低于同龄Wistar大鼠，但在14天龄时高于Wistar大鼠（分别为p < 0.001，p < 0.012，p < 0.001和p < 0.009）。随着年龄增长，两个大鼠品系中Mfn2的含量发生变化（F3,40 = 4.3；p < 0.010），但其动态不同。在Wistar大鼠中，Mfn2水平在7天龄时减少（p < 0.008），在20天龄时增加（p < 0.001）。在OXYS大鼠中，Mfn2水平从7天龄到14天龄增加（p < 0.001），在20天龄时减少（p < 0.001）。
图4.
根据蛋白质印迹分析，Wistar和OXYS大鼠出生后早期前额叶皮层（a）和海马体（b）中Mfn1、Mfn2和Drp1含量的变化。Mfn1/2、Drp1、Mfn1/Drp1和Mfn2/Drp1的代表性印迹图像和相对量，以β-肌动蛋白为标准化。数据以M ± S.E.M.表示（n = 6）。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
方差分析显示，前额叶皮层中Drp1的含量取决于基因型（F1,40 = 51.5；p < 0.0001）：在7天龄和20天龄时，其水平在OXYS大鼠中较高（分别为p < 0.001和p < 0.005），这可能表明线粒体分裂过程增强。Mfn1/Drp1（F1,40 = 21.9；p < 0.0001）和Mfn2/Drp1（F1,4040 = 91.2；p < 0.0001）指数在OXYS大鼠中低于Wistar大鼠也支持了这一点，这反映了融合和分裂过程平衡的状态。
在海马体中（图4b），两个大鼠品系中Mfn1和Mfn2的含量也随年龄单向变化（F3,4040 = 11.1；p < 0.001和F3,40 = 5.0；p < 0.005），并且它们在出生时的水平在OXYS大鼠中较低（分别为p < 0.01和p < 0.034）。大鼠海马体中Drp1的含量取决于年龄（F3,440 = 15.5；p < 0.001）：在Wistar大鼠中，其水平在两周龄时增加（p < 0.001），而在OXYS大鼠中，它在出生后第一周结束时增加（p < 0.02），在20天龄时减少（p < 0.015）。结果，与Wistar大鼠相比，OXYS大鼠在7天龄时Drp1含量较高，在20天龄时较低（分别为p < 0.002和p < 0.015）。
对融合/分裂过程平衡（Mfn1/Drp1和Mfn2/Drp1指数）的评估显示，它在出生后早期两个大鼠品系中发生变化（F3,4040 = 5.3；p < 0.003和F3,40 = 5.1；p < 0.005）。在OXYS大鼠中，Mfn1/Drp1比率在14天龄和20天龄时增加（分别为p < 0.015和p < 0.05），Mfn2/Drp1比率在20天龄时增加（p < 0.017）。在Wistar大鼠中，Mfn2/Drp1比率在两周龄时减少（p < 0.050）。同时，在OXYS大鼠中，出生后第一周Mfn1/Drp1和Mfn2/Drp1的减少（p < 0.05）表明分裂过程增强，而它们在20天龄时水平的增加表明线粒体融合。
出生后早期的线粒体转运。 为评估神经元中线粒体转运的状态，使用蛋白质印迹分析确定了线粒体运输系统衔接蛋白——GTP酶Miro1和Miro2的水平[25]——它们确保线粒体与运输蛋白——动力蛋白和驱动蛋白——的结合——在出生后早期Wistar和OXYS大鼠的前额叶皮层和海马体中。还研究了运输蛋白——驱动蛋白TRAK1和TRAK2[26]——的含量。
根据方差分析结果，在Wistar和OXYS大鼠的前额叶皮层（图5a）中，Miro1、Trak1和Trak2的含量不取决于基因型且不随年龄变化（p > 0.05）。Miro2的含量在OXYS大鼠中在7天龄和14天龄时较高（F1,40 = 4.57；p < 0.038），到20天龄时，OXYS大鼠中其减少导致品系间差异趋于平缓（p < 0.01）。
图5.
根据蛋白质印迹分析（n = 5），Wistar和OXYS大鼠出生后早期前额叶皮层（a）和海马体（b）中Miro1/2、Trak1/2含量的变化。Miro1/2、Trak1/2的代表性印迹图像和相对量，以β-肌动蛋白为标准化。数据以M ± S.E.M.表示。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
在Wistar和OXYS大鼠的海马体中，Miro1/2、Trak1/2（图5b）的含量不取决于动物的基因型且不随年龄变化（p > 0.05）。值得注意的是，从14天龄到20天龄，OXYS大鼠中Trak2的含量增加（p < 0.02），但与Wistar大鼠相比并未显著更高。
此外，对Wistar和OXYS大鼠前额叶皮层和海马体神经元树突过程中线粒体特定含量的评估未发现品系间差异或年龄相关变化（图6a-c）。关于轴突线粒体，在14天龄时OXYS大鼠海马体中的特定含量低于Wistar大鼠（p = 0.052；图6e）。在前额叶皮层中，该参数在7天龄和14天龄时较低（p < 0.05），在20天龄时较高（p < 0.01；图6d），这表明神经元线粒体转运发生变化。
图6.
神经毡的代表性电子显微镜（EM）图像。轴突（A，伪彩色紫色，下层面板）和树突（De，伪彩色绿色，下层面板）过程包含线粒体（m）。突触的前（Pre）和突触后（PSD）隔室（a）。前额叶皮层和海马体神经元树突（b，c）和轴突（d，e）过程中线粒体的特定含量。数据以M ± S.E.M.表示。*与同龄Wistar大鼠相比的显著差异；#与先前年龄相比。当p < 0.05时，差异被认为具有统计学意义。
讨论
据推测，生命早期形成的成年大脑解剖（神经元数量和连接性）和功能（激活替代神经网络的能力）参数可能影响其对AD发展的易感性以及大脑实现其补偿储备的能力[27]。当发育中大脑的线粒体生物发生符合能源资源需求时，神经元的成功分化和成熟、神经网络的形成以及大脑整体形成的完成是最佳的[23]。在出生后早期，大脑中的代谢率、能量消耗和血流量显著高于成年生物（在小鼠中——在出生后前2-3周高3-7倍，在人类中一直升高到5岁）[28]。很明显，出生后早期完成大脑成熟的过程可能受到线粒体任何功能中断的潜在影响：钙稳态、活性氧生成、凋亡调节、线粒体生物发生、其动力学、线粒体自噬以及转运——线粒体向受生长因子影响的能量消耗增加位点的移动。在本研究中，我们比较了从出生到20天龄（大脑形成完成期）Wistar和加速衰老的OXYS大鼠——散发型AD模型——皮层和海马体中线粒体装置形成的特征。
线粒体在神经发生中起关键作用，调节神经干细胞向神经祖细胞的转化，最终转化为神经元[29-31]。大鼠海马体中的神经发生在波浪中进行：它在产前开始并延续到出生后时期[32,33]。大鼠神经发生活动的高峰出现在7天龄[34]，这对应于人类妊娠第三孕期胎儿大脑的发育——人类神经系统发育特别关键的时期。我们发现，在出生后第一周结束时，OXYS大鼠海马体神经元胞体中线粒体的数量较低，而具有明显结构改变的细胞器比例高于Wistar大鼠。
在神经发生和迁移的同时，新形成的神经元开始彼此建立联系，这些联系后来发展为突触。在不成熟神经元迁移到其功能位点的过程中，会发生选择性凋亡选择，导致特定表型的神经母细胞。随后是与新形成神经元整合到神经网络相关的第二波选择性选择[35]。新形成神经元的轴突和树突在出生后发育的前2-3周继续生长和成熟，在出生后第一个月结束时达到成熟形态。线粒体生物发生的主要调节因子PGC1α的表达增加导致神经元过程的增强生长和其内线粒体数量的增加（神经元胞体中数量不减少）[23]。我们发现OXYS大鼠的大脑成熟在出生后早期发生在线粒体生物发生减少的背景下，如前额叶皮层和海马体中与Wistar大鼠相比PGC1α水平较低所示。之前，我们确定了神经干细胞分化受损的迹象、齿状回中神经发生高峰延迟[12]、产前和产后凋亡波延迟[11]，以及OXYS大鼠海马体和前额叶皮层中神经元过程和突触密度降低[36]。必须强调的是，OXYS大鼠大脑中所有这些神经元成熟延迟的迹象都是在星形胶质细胞和小胶质细胞支持不足的条件下表现出来的[14]。
线粒体形态的变化是胚胎和成年神经发生中神经元和胶质细胞的分化和多能阶段的特征[31,37]。线粒体向细胞核的逆行信号传导调节负责分化的基因转录，并决定神经干细胞分化过程中线粒体动力学的变化[38]。Drp1调节线粒体重塑周期，诱导其分裂以刺激糖酵解代谢，而Mfn1/2在线粒体融合中起关键作用以促进氧化磷酸化[24,31]。我们结果的分析表明，在出生后第一周，OXYS大鼠大脑中融合过程（通过Mfn1/2水平评估）的活性降低，线粒体分裂（Drp1水平增加）增强。Mfn1/Drp1和Mfn2/Drp1指数进一步支持了这一点，它们反映了融合和分裂过程之间的平衡。
到出生后第二周结束时，OXYS大鼠海马体神经元胞体和神经毡中线粒体的数量高于Wistar大鼠。到这个年龄（14天），两个大鼠品系前额叶皮层神经元胞体和神经毡中线粒体的数量增加，并且具有完整超微结构的细胞器比例达到最大值。然而，OXYS大鼠表现出线粒体动力学活性降低：神经元胞体中进行融合/分裂的细胞器比例显著低于Wistar大鼠。
在大脑出生后早期成熟过程中，线粒体转运不仅对于向神经元过程供应ATP至关重要，而且对于它们的适当形成也至关重要，此期间的能量不足会导致神经元可塑性受损[39-43]。我们没有检测到出生后早期OXYS大鼠大脑中线粒体转运的明显中断。然而，注意到神经元线粒体转运在轴突过程中的改变迹象：在OXYS大鼠海马体中，细胞器数量略低于Wistar大鼠（p = 0.052）在14天龄时，在前额叶皮层中，它在前两周较低但在20天龄时增加。
在大脑成熟完成期间（20天），前额叶皮层神经元胞体中的线粒体含量没有发现品系间差异。然而，OXYS大鼠中进行融合/分裂的细胞器比例降低表明这些动物中线粒体动力学降低。与出生后第一周一样，OXYS大鼠大脑皮层中的融合过程（Mfn2）减少，而分裂（Drp1和Mfn2/Drp1）增强。在皮层神经毡中，线粒体数量由于轴突过程中的含量而更高。在此期间，OXYS大鼠海马体中神经元胞体和神经毡中的线粒体数量高于Wistar大鼠，并且根据线粒体动力学活性评估，融合/分裂平衡向线粒体融合倾斜。作为线粒体动力学中断的迹象，我们考虑先前确定的[44]在OXYS大鼠皮层神经元过程中具有不寻常表型——"线粒体串"（MOAS）——的线粒体数量增加。这种线粒体已在AD患者和AD小鼠模型的大脑神经元中发现，被认为与不完全分裂相关[45]。重要的是，在大脑成熟完成期间（20天龄），OXYS大鼠神经毡中MOAS的特定数量增加最为显著——8倍——此时有效的轴突线粒体转运是神经元网络形成的必要条件。
可以合理地假设，OXYS大鼠中识别的线粒体结构和功能变化是由相关基因表达变化支撑的。之前，我们分析了从出生后早期到AD进展年龄（P3、P10、P20（P — 出生后天数）、5个月和18个月）Wistar和OXYS大鼠大脑皮层和海马体转录组的变化（RNA-seq数据），确定了在OXYS大鼠中先于和伴随疾病发展的代谢途径和过程。值得注意的是，在出生后早期和明显神经退行性变化阶段，OXYS大鼠和AD患者之间观察到的基因表达和相关过程的差异最为显著和可比[16,18]。OXYS大鼠在3天和10天龄时已经出现线粒体相关基因表达改变[18]，在20天龄时（AD发展的"临床前期"），并在疾病表现和进展期间保持改变[19]。
结论
我们之前已经表明，OXYS大鼠中所有AD关键症状的表现和进展——破坏性变化和神经元死亡、突触不足、tau蛋白过度磷酸化、Aβ1-42（Aβ — 淀粉样β）积累增强以及大脑中淀粉样斑块的形成，以及记忆障碍和学习能力——都是在线粒体功能障碍增加和海马体和大脑皮层神经元中线粒体特定数量显著减少的背景下发生的[15,16]。总体而言，本研究和先前研究获得的结果表明，早在出生后早期（从出生到20天龄），OXYS大鼠在海马体和大脑皮层神经元中表现出线粒体的结构和功能变化，这些变化在AD症状表现（3-5月龄）及其进展（24月龄）期间随后增加。导致OXYS大鼠大脑加速衰老和AD症状发展的原因尚不清楚，但我们认为本研究中在出生后早期识别的线粒体装置形成偏差可能有助于OXYS大鼠的大脑成熟延迟、促进线粒体功能障碍、降低突触密度，并最终导致神经元死亡和早期神经退行性变化的发展。因此，我们已经表明，线粒体功能障碍介导和/或可能甚至启动了OXYS大鼠中AD发展的病理分子级联，可以被认为是人类散发型AD早期发展的预测因素。
缩写词
AD：阿尔茨海默病
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