循环肿瘤细胞（CTC）簇的存在与多种癌症类型的疾病进展和生存率降低有关。在乳腺癌中，临床前研究表明，Na+/K+ ATP酶抑制剂可以抑制CTC簇并阻止转移。本研究是一项前瞻性、开放标签的概念验证研究，旨在确定Na+/K+ ATP酶抑制剂地高辛是否能减少转移性乳腺癌患者的平均CTC簇大小。
该研究分析了九名接受每日维持剂量地高辛治疗（血清水平0.7–1.4 ng/ml）的患者，结果显示治疗后平均簇大小减少了2.2个细胞/簇（P = 0.003），达到了研究的主要终点。从机制上看，CTC转录组分析表明地高辛治疗后细胞间黏附和细胞周期相关基因下调，这与其簇溶解活性一致。未发生与治疗相关的不良事件。
因此，我们的数据首次证明了地高辛治疗可部分溶解CTC簇，鼓励进行更大规模的后续研究，包括使用更精细的Na+/K+ ATP酶抑制剂并纳入临床结局终点。
乳腺癌是全球女性中最常见的癌症。尽管近年来多模式方法和创新疗法的发展改善了患者的生存率，但每年仍有近685,000名女性死于乳腺癌，主要原因是不可治愈的远处转移。在这种情况下，抗癌药物的基本原理可能是一个潜在的关键因素。标准治疗方法通常基于其细胞毒性活性开发，并不一定设计用于干扰与转移相关机制。因此，开发靶向转移机制的药物具有广阔前景。
CTC是从原发或转移病灶脱落进入血液的活细胞，作为转移的先驱。CTC的存在已被证实是乳腺癌患者预后不良的预测因子。最近的研究表明，CTC簇（由癌细胞组成的同型或多细胞聚集体，或与免疫细胞结合的异型）比单个CTC具有更强的转移能力和更差的预后关联。临床前研究还揭示了这些簇的独特生物学特性和脆弱性，如依赖于细胞间黏附完整性的干细胞样和增殖特征。一项针对2,486种美国食品药品监督管理局批准的药物筛选表明，Na+/K+ ATP酶抑制剂（如强心苷）可以有效将CTC簇分解为单个细胞，在乳腺癌小鼠模型中抑制转移。
因此，开展了DICCT（地高辛诱导的CTC簇溶解）试验，这是一项多中心、前瞻性、首次人体概念验证、单臂、治疗探索性1期研究，旨在评估Na+/K+ ATP酶抑制剂地高辛是否能在安全且耐受良好的剂量下破坏转移性乳腺癌患者的CTC簇（NCT03928210；DICCT/Swiss-GO-07）。
研究的主要目标是评估地高辛对转移性乳腺癌患者CTC簇大小的影响。值得注意的是，CTC簇的大小而非其总体丰度最能反映簇溶解特性。次要目标包括地高辛对CTC簇总体丰度的影响、CTC簇溶解的动力学以及剂量-反应关系。符合条件的患者包括年龄18岁及以上、局部复发或转移性乳腺癌且病情进展不适合治愈性治疗的患者。总共筛查了58名患者，其中11名基线时CTC簇阳性的患者被纳入DICCT并接受了地高辛治疗（意向治疗人群）。其中两名患者因无法达到目标血清水平或与地高辛无关的不良事件而被排除。九名（n = 9）患者接受了每日地高辛剂量治疗7天，达到了≥0.7 ng/ml的目标血清水平（按方案人群）。另外九名（n = 9）具有CTC簇且匹配临床特征的患者被非随机分配到未治疗对照组，目的是检查未用地高辛治疗患者的CTC簇大小和组成在一周内的病理生理波动情况。所有患者（包括治疗组和对照组）均在2020年7月至2024年7月期间入组，基线临床特征见表1及扩展数据表1和2。血液样本采集于第0天（治疗前立即采集以及治疗后2小时）、第3天和第7天，并在4小时内用美国食品药品监督管理局批准的Parsortix设备处理。经微流控捕获和免疫荧光染色后，识别并计数单个CTC和同型及异型簇（图1b）。同型和异型CTC簇的大小、数量和比例在不同时间点和个体患者之间有所不同（扩展数据表3和4）。尽管在外周血采样相对较小体积的情况下存在预期的变异性，但线性混合效应（LME）模型分析表明，在7天的地高辛治疗期内CTC簇大小整体减少（回归系数-0.33，95%置信区间（CI）-0.89至0.24）（图1c和扩展数据图1），在同型和异型簇中均明显（图1d）。未用地高辛治疗的对照患者的LME系数也进行了计算，与地高辛治疗组相反，未观察到簇大小减少（回归系数0.13，95% CI -0.25至0.51）（图1c,d和扩展数据图1）。研究达到了其主要终点，即治疗前后平均簇大小显著减少（平均差异-2.2个细胞，单侧配对t检验P值0.0032）（图1e），其中治疗后值取自第3天或第7天，具体取决于最佳反应，考虑到地高辛剂量调整的已知挑战。值得注意的是，平均簇大小的显著减少仅出现在治疗患者中，而不是在对照样本中（图1e,f和扩展数据图2a,b）。有趣的是，尽管治疗队列较小，但在较高地高辛血清浓度下观察到平均簇大小的数值趋势更明显减少（次要终点）（线性回归系数-4.65，P = 0.14；图1g），提示更高地高辛血清水平或更有效的Na+/K+ ATP酶抑制剂可能在簇溶解方面更有效。地高辛治疗对给定浓度下单个CTC和CTC簇的比例无显著影响（扩展数据图3）。治疗耐受良好，未发生与地高辛治疗相关的不良事件。
为了阐明CTC簇大小如何影响疾病结局，我们接下来进行了动物实验。我们将4T1乳腺癌细胞注射到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠的乳腺脂肪垫中，待肿瘤发展后，分离自发生成的不同大小的CTC簇。将由不同大小簇组成的12个细胞（2细胞、3细胞、4细胞、6细胞和12细胞簇）静脉注射到无肿瘤受体小鼠体内，以测量其直接转移能力。有趣的是，至少四细胞的CTC簇表现出更高的转移潜力，通过生物发光成像测定（双侧Mann-Whitney检验P值0.0089）（扩展数据图4）。
我们之前的研究表明，CTC簇的解离会导致患者来源细胞系和异种移植中干细胞性和细胞周期相关基因下调，同时破坏细胞间黏附。在此基础上，我们旨在跟踪一名索引患者在接受地高辛治疗前后新鲜分离的CTC中基因表达模式的变化，以确认我们的临床前观察结果。为此，在CTC富集和计数后，我们对患者5的连续CTC样本进行了RNA测序（RNA-seq），该患者因其多个治疗前样本（最早在地高辛给药前几个月）和各种治疗之间的长期停药，允许纵向基因表达分析，最大限度减少混淆因素的可能性。血液样本分别在地高辛治疗前三个时间点（第-86天、第-17天和第0天治疗前）和治疗后一个时间点（第32天）采集，然后在下一线全身抗癌治疗之前（扩展数据图5a）。样本按照先前描述的方法收集和处理以进行下一代RNA-seq（扩展数据图5b）。治疗后CTC与治疗前样本相比，差异表达708个基因，其中685个下调，23个上调（扩展数据图5c和补充表1和2）。令人惊讶的是，通路分析显示，与治疗前样本相比，治疗后CTC中细胞周期相关基因（如G2/M转换和E2F靶标，例如CCNB2、PLK1、CHECK2和CDC25；P < 0.05）和细胞间黏附分子（例如PCDH12、CHD4和CHD24；P < 0.05）显著下调（扩展数据图5d，显示前30个本体论，扩展数据图6）。这一观察结果与我们使用患者来源异种移植的临床前发现高度一致，证实了Na+/K+ ATP酶抑制后的细胞间黏附破坏和细胞周期干扰。
总之，DICCT试验证实，通过抑制Na+/K+ ATP酶可以在转移性乳腺癌患者中实现部分CTC簇溶解。我们在同型和异型簇中均观察到了类似的溶解效果，以及细胞周期调节和细胞间黏附相关基因显著下调。虽然这项概念验证研究未评估临床结局终点，但DICCT试验为新型转移预防方法的设计提供了首例证据。值得注意的是，CTC簇在小叶和导管乳腺癌亚型中均有观察到。这一发现特别有趣，因为小叶癌通常表现为E-钙粘蛋白丢失，但与先前关于细胞间黏附成分在维持CTC簇中的作用的知识相兼容。尽管本研究达到了主要终点，但我们认识到一些局限性并有机会改进未来研究设计。例如，外周血样本中CTC数量普遍较低，加上患者内部和患者间的变异性，影响了检测变化的统计功效。此外，地高辛在较低（维持）剂量下的簇大小效应虽显著但较为轻微。我们期待未来的进一步研究，设计更长的治疗持续时间、更频繁监测药物血清水平或更高剂量或使用更精细的Na+/K+ ATP酶抑制剂，以更强的簇溶解活性为目标，旨在测量与新转移发展相关的临床终点。
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