摘要
放射性药物的"放射杂合"(rh)设计最近产生了一些新的诊疗剂，适用于正电子发射断层扫描(PET)成像和肽受体放射性核素治疗(PRRT)。这一方法旨在通过提供一种新策略来解决当前医学放射性核素的局限性，该策略可结合先前缺乏治疗和诊断应用的放射性核素。本文报道了一种靶向生长抑素受体亚型2(sstR2)的放射杂合化合物rhTATE4，它具有一个双功能硅基氟化物受体(SiFA)——命名为(SiFA)SeFe——用于¹⁸F标记，以及一个DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)螯合剂用于¹⁷⁷Lu配位。该放射杂合诊疗剂表现出与金标准[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE和SiFAlin-TATE相似的体外行为，同时在AR42J荷瘤小鼠中注射后1小时表现出异常高的肿瘤摄取(53.58 ± 5.51% ID/g用于放射性氟标记版本)，使其非常适合成像。此外，在注射后24小时，[¹⁷⁷Lu]Lu-TATE4在正常组织中的清除和显著的肿瘤滞留(10.32 ± 7.04%ID/g)表明其具有良好的治疗适用性。
引言
"theranostics"一词指的是两种医疗程序的整合，使诊断成像和治疗性治疗成为可能。在核医学的背景下，这涉及到使用含有放射性同位素的相同或相似放射性药物化合物。经典的诊疗设计分类包括以下主要策略：同位素匹配对、"真正"的诊疗核素使用，以及匹配的放射性药物。
碘放射性同位素是"同位素匹配对"的一个显著例子，它是奠定诊疗应用基础的第一个放射性药物。碘-123(γ发射体)用于单光子发射计算机断层扫描(SPECT)诊断，而碘-131(γ和β-发射体)用于甲状腺癌的治疗。这类放射性药物包含同一元素的治疗或诊断放射性核素，使得两种化合物在化学和生物学上表现相同，从而实现精确的剂量测定和治疗控制。
对于"真正"的诊疗方法，所掺入的放射性核素会发射可用于成像的γ射线或正电子，以及用于治疗的α或β-辐射。这一类别中的第一个核素是上述用于甲状腺癌成像和治疗的I-131。这种方法的另一个突出例子是已经在临床中使用的核素镥-177，它以高亲和力靶向生长抑素受体亚型2(sstR2)的[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE(TATE = (Tyr³)-octreotate，DOTA = 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)(Lutathera®)用于神经内分泌肿瘤的治疗。镥-177的γ射线可用于SPECT成像，从而在第一个治疗周期后进行剂量测定计算。然而，由于分辨率较低，基于¹⁷⁷Lu的SPECT扫描在临床实践中不用于治疗规划。为了克服这一限制，"匹配放射性药物"方法提供了成像和治疗核素的组合。对于神经内分泌肿瘤，[⁶⁸Ga]Ga-DOTA-TATE(NETSPOT®)被用作正电子发射断层扫描(PET)成像，作为治疗性[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE的补充。然而，Ga³⁺和Lu³⁺的不同放射性金属复合物导致不同的药代动力学特征，从而产生不同的药理特性。
除了上述经典设计方法外，"放射杂合"策略正在出现，其中单个分子具有两个不同的放射性核素结合位点（图1A）。这旨在为放射性结合物建立更一致的药理学特征，从而产生更个性化和有效的治疗方案。具体而言，如图1A所示，该概念通常包括一个硅基氟化物受体(SiFA)，用于通过¹⁸F/¹⁹F同位素交换反应进行快速高效的¹⁸F氟化，以及DOTA(2-[1,4,7,10-四氮杂环十二烷]-戊二酸)螯合剂用于放射性金属化(例如与¹⁷⁷Lu)。这创造了一种化学相同的化合物对(要么是natF/放射性金属，要么是F-18/非放射性金属)，从而实现精确的剂量测定和治疗监测。此外，它提供了经济和战略优势，因为治疗性放射杂合剂的批准可以在诊断对应物获批后简化流程。这种方法的第一个例子是由Wurzer等人报道的，并成功获得了FDA批准，化合物为[¹⁸F]Ga-rhPSMA-7.3(POSLUMA®，图1B)，用于前列腺癌的PET成像。其治疗对应物[¹⁷⁷Lu]Lu-rhPSMA7.3及其DOTA类似物[¹⁷⁷Lu]Lu-rhPSMA10.1显示出良好的临床前结果。
在放射杂合示踪剂的经典设计中的一个主要关注点是SiFA构建模块(SiFA)BA(4-(二叔丁基氟硅基)苯甲酸)的高脂溶性，这会影响所得放射性示踪剂的生物分布，并可能导致不良的体内表现。在最近尝试生成基于更亲水但para-功能化的SiFAlin部分的sstR2靶向放射杂合化合物时，Wendlinger等人无法在生物分布研究中超过基准SiFAlin-TATE在肿瘤累积方面的表现，尽管在注射后1小时的肝摄取明显降低。为了解决这一局限性，我们最近报道了一种新的双功能SiFA前体3-氨基-5-(二叔丁基氟硅基)苯甲酸((SiFA)SeFe)，它包含位于Si基团两个间位的羧酸基团和氨基基团。这一特性不仅降低了SiFA前体的脂溶性，还使其能够像经典氨基酸一样嵌入到放射性示踪剂中。(SiFA)SeFe最近被用于开发三种不同的rh化合物(rhTATE1-3)，这些化合物在AR42J荷瘤雌性CD1-nu/nu小鼠中表现出高累积(最高达27%ID/g，注射后1小时)，但在肾脏中也有高累积(最高达99%ID/g，注射后1小时)。尽管与[¹⁸F]SiFAlin-TATE相比总肿瘤摄取增加(18.51 ± 4.89%ID/g，注射后1小时)，但大多数器官的肿瘤/背景(T/B)比率相当或较低。此外，[¹⁸F]Lu-rhTATE3的快速肾排泄可能阻止其治疗应用。
本文报道了一种优化的诊疗放射杂合配体rhTATE4，它可以通过(SiFA)SeFe部分快速有效地用氟-18标记，并通过DOTA螯合剂稳定地标记镥-177(图1C)。在这种情况下，双功能(SiFA)SeFe被整合连接sstR2靶向TATE和螯合剂。该化合物通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)和HR-ESI-MS(高分辨率电喷雾电离质谱)进行了表征。此外，该配体的体外特性，包括脂溶性、人血清白蛋白(HSA)结合、sstR2受体结合亲和力以及在人血浆中的稳定性，与FDA和EMA批准的PRRT基准[ⁿᵃᵗ/¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE以及临床测试的PET示踪剂[ⁿᵃᵗ/¹⁸F]SiFAlin-TATE进行了比较。此外，在AR42J荷瘤CD1-nu/nu小鼠中，在注射后1小时研究了[¹⁸F]Lu-rhTATE4的生物分布。同样，rhTATE4用镥-177标记，并在同一模型中研究了注射后1小时、6小时和24小时的生物分布。
结果
设计与合成
为生成诊疗平台，将rh概念应用于基于TATE的示踪剂rhTATE4，该示踪剂包含用于¹⁸F标记的SiFA构建模块(SiFA)SeFe和用于¹⁷⁷Lu标记的末端DOTA螯合剂(图1B)。与之前报道的rhTATE1-3示踪剂不同，该设计理念使用(SiFA)SeFe连接TATE到DOTA，而不是将其置于末端位置。原则上，这可以更好地屏蔽脂溶性SiFA基团，并同时保证DOTA与镥-177的七配位用于治疗。为了保持对sstR2的良好亲和力，首先在TATE和SiFA前体之间放置了连接单元8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，类似于SiFAlin-TATE。此外，在DOTA螯合剂和SiFA部分之间引入了D-Asp连接剂，因为在先前关于模型氨基酸构建体的工作中，所携带的负电荷是有利的。
无金属配体及其相应参考物通过标准芴甲氧羰基固相肽合成(Fmoc SPPS)在2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂上合成(详细信息见SI，表S1)，得到3–19% RP-HPLC纯化的前体(化学纯度>95%，通过RP-HPLC和质谱测定，图S1–S10)。非放射性镥标记在80°C下使用2.5倍过量的LuCl₃进行15分钟，定量完成(图S4和S9)。所得溶液在不过滤的情况下与过量LuCl₃一起使用。
放射性标记
¹⁸F对标记SiFA部分的手动操作按照文献中描述的程序进行。示踪剂的放射性氟化在30分钟内完成，放射化学产率(RCY)>38%(经过短柱纯化，Oasis® HLB plus轻型柱，30 μm粒径)，放射化学纯度(RCP)>98%。肽完整性确认和质量控制显示在补充材料中(图S11–S19和表S3)。rhTATE4与镥-177的放射性标记在70°C下5分钟内完成，RCY和RCP>97%(放射性RP-HPLC和放射性TLC，图S14和S19)，摩尔活性为30 GBq/μmol。放射性标记后，所有肽不过滤直接使用。
体外评估
化合物rhTATE4在体外进行了评估，并与临床标准[ⁿᵃᵗ/¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE和[ⁿᵃᵗ/¹⁸F]SiFAlin-TATE进行了比较，包括脂溶性、HSA结合、对表达sstR2的CHOₛₛₜᵣ₂细胞的受体结合亲和力以及人血浆稳定性测定(详细信息见SI，表1)。脂溶性通过在pH=7.4下的1-辛醇-PBS分配系数(logDₚₕ=₇.₄)使用摇瓶法测定。研究了¹⁸F和¹⁷⁷Lu标记的rhTATE4，以估计它们的化学等同性。两种标记物种的logDₚₕ=₇.₄值分别为-1.42±0.05和-1.70±0.06，差异很小。这些差异可能归因于不同的标记条件(见"实验"部分)。总体而言，这些logDₚₕ=₇.₄值与先前报道的rhTATE1-3和SiFAlin-TATE相当(图2A)；而参考[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE是最亲水的化合物(logDₚₕ=₇.₄：-3.70±0.05)。
HSA结合通过高性能亲和色谱(HPAC，图S20和表S2)测定。Lu-rhTATE4显示出高于92%的HSA结合，与SiFAlin-TATE相当(图2B)。相反，亲水性更高的Lu-DOTA-TATE的HSA结合显著降低(51%)。为了评估对sstR2的结合亲和力，通过竞争性结合实验([¹²⁵I]I-TOC作为竞争剂)在CHOₛₛₜᵣ₂细胞(稳定转染人类sstR2(在N端侧带表位标签)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)上检验了Lu-rhTATE4的半最大抑制浓度(IC₅₀)(图2C)。与基准化合物Lu-DOTA-TATE(IC₅₀=7.24±0.9 nM)和SiFAlin-TATE(IC₅₀=7.46±1.40 nM)相比，Lu-rhTATE4表现出相似的受体结合亲和力，IC₅₀为9.32±0.49 nM。这种相似性表明rhTATE4中使用的连接序列8-氨基-3,6-二氧杂辛酸有效保持了受体亲和力。
在人血浆中进行了稳定性研究，将配体在37°C下孵育1小时(¹⁸F标记)和24小时(¹⁷⁷Lu标记)(图2D)。[¹⁸F]Lu-rhTATE4以及参考[¹⁸F]SiFAlin-TATE在人血清中孵育1小时后没有降解(≥98%完整配体)。这证实了桥接(SiFA)SeFe构建模块的稳定氟化。对于治疗应用，参考配体[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE和放射杂合剂[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4在人血浆中孵育24小时后也显示出高稳定性(>90%完整配体)。
离体生物分布
为评估rhTATE4的成像能力，首先在注射后1小时分析了¹⁸F标记化合物在AR42J荷瘤CD1 nu/nu小鼠中的表现。此外，在一只小鼠中进行了与Ga-DOTA-TATE共注射(40 nmol，相对于[¹⁸F]Lu-rhTATE4为851倍过量)的竞争研究，以确定对sstR2的特异性(图3A，见SI，表S4)。注射后1小时，[¹⁸F]Lu-rhTATE4在AR42J肿瘤中检测到极高的活性水平(53.58±5.51%ID/g)，而在非靶组织(心脏、脾脏、肠道、肌肉、骨髓和无骨髓骨骼：0.34-2.50%ID/g)中的摄取较低。在血液(4.88±0.23%ID/g)和血供良好的肺(6.87±0.21%ID/g)以及肝脏(5.47±0.47%ID/g)中观察到略高的活性累积。此外，在胰腺(11.65±0.51%ID/g)和胃(10.63±0.99%ID/g)中观察到较高的活性水平，这是预期的，因为这些器官中存在内源性sstR2表达。在肾脏中观察到的活性累积(26.88±1.49%ID/g)表明主要是肾脏排泄。
在竞争研究中(n=1)，通过共注射Ga-DOTA-TATE，验证了[¹⁸F]Lu-rhTATE4在肿瘤(1.96%ID/g)、胰腺(0.75%ID/g)和胃(2.50%ID/g)中的sstR2特异性摄取。相比之下，在肺、肠道和肾上腺中未观察到摄取减少，表明这些区域的结合主要是非sstR2介导的。竞争实验中肾脏活性累积相对较高可以归因于冷竞争剂对受体的饱和，导致放射性配体的排泄率增加。为了更精确地评估成像质量，确定了T/B比率(图3B，详细信息见SI，表S5)。[¹⁸F]Lu-rhTATE4对肺(7.37±0.97)、脾脏(40.13±4.45)、胰腺(4.54±0.54)、肠道(21.31±3.54)、肾上腺(17.33±1.73)以及有骨髓(31.61±6.12)和无骨髓骨骼(77.5±27.54)都表现出高T/B比率。只有肾脏(1.85±0.26)和血液(10.87±0.78)的T/B比率较低。
从每次生物分布研究中选择一只小鼠用于[¹⁸F]Lu-rhTATE4和[¹⁸F]Lu-rhTATE4与Ga-DOTA-TATE竞争研究的代表性μSPECT/CT扫描。注射后1小时记录的μSPECT/CT图像(45分钟采集时间)如图3C所示，与体外生物分布研究一致，显示[¹⁸F]Lu-rhTATE4具有良好的成像特性，在sstR2过表达肿瘤中具有高活性摄取。此外，观察到非靶组织中摄取低，主要通过肾脏排泄。由于在两张图像中均未观察到骨摄取，进一步证实了体内稳定性，无脱氟现象。
为研究该化合物的长期体内行为，在AR42J荷瘤CD1 nu/nu小鼠中评估了¹⁷⁷Lu标记的rhTATE4在注射后1、6和24小时的表现(图3D，以及表S4和S6)。[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4的生物分布数据与[¹⁸F]Lu-rhTATE4在注射后1小时的数据一致，表明体内表现相当；尽管在肾脏(26.88±1.49%ID/g vs. 14.80±1.95%ID/g)和肿瘤(53.58±5.51%ID/g vs. 32.15±8.55%ID/g)等部位记录了统计学上不同的绝对值(表S7)。两种示踪剂之间观察到的差异原因尚未完全理解。无论如何，rhTATE4的肿瘤摄取超过了先前报道的诊疗剂[¹⁸F]Lu-rhTATE3化合物(27.32±8.86%ID/g；统计分析见表S8)，同时防止了过度的肾排泄。最重要的是，该化合物在肿瘤中的累积超过了[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE报道的值(21.35±5.90%ID/g)；尽管在这种情况下使用了不同的小鼠模型来生长AR42J肿瘤。
注射后24小时，肿瘤中仍可观察到相当数量的活性(10.32±7.04%ID/g)，仅略低于AR42J异种移植模型中治疗基准[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE的值(24小时注射后为16.14±2.07%ID/g)。值得注意的是，与[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE相比，[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4在某些器官中观察到明显较低的脱靶摄取(肺：1.30±0.68%ID/g vs 11.89%ID/g，胰腺：0.26±0.18%ID/g vs 3.99±0.47%ID/g，肾上腺：0.22±0.14%ID/g vs 4.70±1.07%ID/g，肾脏：0.55±0.26%ID/g vs. 1.76±0.35%ID/g)，这对新rh化合物的未来治疗应用是有利的。[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4的T/B比率直接随时间进行了比较(图S21和表S6)，显示所有器官相对于基准化合物都有稳定增长。
从每次生物分布研究中选择一只小鼠用于[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4的代表性μSPECT/CT扫描。图像在注射后1小时和24小时获取(图3E)。μSPECT/CT图像显示AR42J异种移植物中活性累积，以及注射后1小时略高的肾水平(图3E，左)，与[¹⁸F]Lu-rhTATE4观察到的一致。与生物分布研究的定量数据一致，活性随时间通过肾脏有效清除，24小时后几乎完全排泄(图3E，右)。此外，在注射后24小时也确认了非癌组织中的良好排泄。
讨论
分子诊疗方法近年来在现代医学中变得越来越重要。迄今为止，仅确定了有限数量的放射杂合化合物作为下一代诊疗剂，其中PET核素F-18主要通过高度脂溶性的硅基氟化物受体(SiFA)部分的同位素交换反应引入。已经采用了不同的策略来增强放射杂合的亲水性，包括引入极性辅助基团，如SiFAlin-TATE中所见，或使用三氟硼酸基放射性前体进行¹⁸F交换。在我们的工作中，rh化合物rhTATE4具有双功能前体(SiFA)SeFe，将DOTA螯合剂桥接到TATE肽上。值得注意的是，该化合物与先前开发的SiFA基放射杂合物相比表现出降低的脂溶性，与优化的[¹⁸F]SiFAlin-TATE相当。rhTATE4与氟-18和镥-177的标记可以高效实施，具有高RCY和RCP。衍生物nat/¹⁸FLu-rhTATE4表现出高HSA结合和血清稳定性，以及与基准Lu-DOTA-TATE相当的sstR2结合亲和力。[¹⁸F]Lu-rhTATE4的初始体外评估在注射后1小时显示出显著的成像特性；此外，通过竞争实验中肿瘤和其他sstR2阳性器官中摄取的缺失确认了受体特异性。此外，[¹⁷⁷Lu]Lu-rhTATE4的生物分布研究显示即使在注射后24小时也有高肿瘤累积，与基准[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-TATE相当。
总体而言，我们的研究进一步证明了放射杂合方法在开发靶向诊疗剂方面的潜力。此外，它突显了(SiFA)SeFe部分的优势，能够实现更通用的设计。未来的工作将致力于将这种前体整合到靶向不同受体的rh示踪剂中，如趋化因子受体4(CXCR4)或胃泌素释放肽(GRPR)受体，以扩大基于肽的诊疗剂的范围。
方法
一般实验
溶剂从Sigma-Aldrich(德国慕尼黑)、Alfa Aesar(德国卡尔斯鲁厄)、Carl Roth GmbH & Co. KG(德国卡尔斯鲁厄)或VWR International GmbH(德国达姆施塔特)获得HPLC级或技术级。用于HPLC溶剂的水由Thermo Fischer Scientific Inc的内部Millipore Barnsted MicroPure-系统提供(美国北卡罗来纳州莫里斯维尔)。(SiFA)SeFe的合成按照既定程序进行。液相合成和氘代溶剂的化学品购自VWR International GmbH(德国达姆施塔特)、Carl Roth GmbH & Co. KG(德国卡尔斯鲁厄)、Tokyo Chemical Industry(日本东京)、Gelest Inc.(美国宾夕法尼亚州莫里斯维尔)和Sigma-Aldrich(德国慕尼黑)，未经进一步纯化使用。氨基酸购自Carbolution Chemicals GmbH(德国圣英贝特)、IRIS Biotech GmbH(德国马克特雷德维茨)、Millipore-Sigma HGaA(德国达姆施塔特)或Sigma Aldrich(德国慕尼黑)。螯合剂DOTA(tBu)₃购自CheMatech(法国第戎)。肽合成所需的偶联试剂和其他化学品购自Macrocyclics Inc(美国达拉斯)、Molekula GmbH(德国加兴)或Sigma Aldrich(德国慕尼黑)。2-CTC树脂购自IRIS Biotech GmbH(德国马克特雷德维茨)。三氟乙酸铊、甘油、咪唑和羟胺盐酸盐购自Sigma Aldrich(德国慕尼黑)。所有试剂未经进一步纯化使用。
放射性标记
对于¹⁸F标记，水性氟-18(120 MBq)保留在预处理过的SAX柱上，用10 mL H₂O预处理。柱子用空气干燥，然后用干DMSO(8 mL)缓慢洗涤，再用空气干燥。干燥的氟-18用500 μL甲酸铵(40.0 mg在500 μL干DMSO中)洗脱到1.5 mL反应管中。通过在40°C下向30 μL(30 nmol)配体(1 mM在DMSO中)加入反应5分钟。通过加入10 mL PBS pH=3(用1 M水性HCl调整)停止反应。然后缓慢将溶液加载到预处理过的Oasis HLB Plus Light柱上，该柱用绝对EtOH和H₂O预处理。柱子用PBS pH=7.4洗涤，然后用空气干燥。使用洗脱混合物绝对EtOH和PBS pH=7.4(7/3 v/v；300 μL)洗脱¹⁸F标记配体。
对于¹⁷⁷Lu标记，将水性[¹⁷⁷Lu]LuCl₃(30 MBq)加入1 μL(1 nmol)配体(1 mM储备液在DMSO中)、10 μL NaOAc缓冲液(pH=5.5)、22 μL 0.04 M HCl中，并在70°C下反应5分钟。
脂溶性(logDₚₕ=₇.₄)测定
为确定辛醇-PBS分配系数(logD₇.₄值)，将500 μL 1-辛醇和500 μL PBS加入1.5 mL反应管中(n=6)。随后加入1 MBq的每种¹⁸F或¹⁷⁷Lu标记化合物，并在室温下涡旋3分钟。离心后(9000 rpm，5分钟，室温)，分别取200 μL每层，并通过γ计数器量化活性。
人血清白蛋白(HSA)结合测定
HSA结合研究按照先前发表的程序进行，使用RP-HPLC和固定在Chiralpak HSA柱(50×3 mm，5 μm)上的HSA。室温下使用0.5 mL/min的流速。使用新制备的50 mM水性NH₄OAc溶液(pH=6.9)作为流动相A，使用异丙醇(HPLC级)作为流动相B。使用0-3分钟100% A，3-40分钟80% A的梯度进行实验。在分析所有化合物之前，使用九种参考物质确定校准曲线，这些物质具有文献报道的HSA结合范围(13-99%)。所有化合物在异丙醇和50 mM水性NH₄OAc溶液(1/1，v/v，pH=6.9)的混合物中制备，最终浓度为0.5 mg/mL。
受体结合亲和力测定(IC₅₀)
体外竞争研究在CHOₛₛₜᵣ₂细胞(在N端稳定转染人类sstR2的CHO细胞)上进行，这些细胞在24孔板中播种(1.0×10⁵个细胞/孔，DMEM/F12 GlutaMax含10% FBS)，并在实验前在37°C下孵育24±2小时。在实验当天，移除培养基，每孔用300 μL HBSS(补充1%牛血清白蛋白)洗涤。加入200 μL HBSS后，每孔加入25 μL HBSS(对照，n=3)或浓度范围为10⁻¹⁰至10⁻⁴ M的相应配体(n=3)。随后，向每孔加入25 μL放射性标记参考[¹²⁵I]I-TOC(1 nM在HBSS中)。在室温下孵育1小时后，移除上清液，用冰PBS(300 μL)洗涤，洗涤液与上清液合并。通过加入NaOH(300 μL，1 M)裂解细胞。在室温下孵育20分钟后移除细胞裂解液，并用NaOH(300 μL，1 M)洗涤，将两种含NaOH的组分合并。随后，分别测量上清液和裂解液的活性，并在γ计数器中单独测量，使用GraphPad Prism软件计算IC₅₀值(取代受体上50%参考竞争剂所需的浓度)。当R²拟合>0.95时，数据视为有效。每次实验进行三次。
人血清中的稳定性研究
将5 MBq的相应¹⁸F或¹⁷⁷Lu标记化合物加入200 μL人血清中，在37°C下孵育1小时。加入50%冷乙醇和150%冷MeCN后，在13,000 rpm下离心20分钟。倾倒上清液，并在带有0.45 μm醋酸纤维素滤膜的离心管中以13,000 rpm离心10分钟。将约0.2 MBq的剩余滤液注入RP-HPLC，并量化完整放射性配体的量。
离体生物分布研究
动物实验由认证人员按照先前发表的方法进行。实验按照德国一般动物福利法规和机构动物护理和使用指南进行。5-6周龄的雌性CD1-nu/nu小鼠在接种前在内部动物设施中适应1周。肿瘤异种移植物使用AR42J细胞(7.0×10⁶个细胞/200 μL)制备，悬浮在RPMI 1640培养基和Cultrex® Basement Membrane Matrix Type 3(1/1，v/v)的混合物中。该悬浮液皮下接种在右肩上，当肿瘤体积>100 mm³时(接种后1-2周)使用动物。生物分布研究(n=3-5)在注射后1小时、6小时、24小时进行，大约2-3 MBq(300 pmol)通过尾静脉给药。通过CO₂窒息后颈椎脱位实施安乐死。通过组织分离后测定每个器官中的活性来测量生物分布。使用Excel和OriginPro软件对收集的数据进行统计分析。
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