背景
认知障碍是神经系统发育异常或功能失调的常见表现之一。甲基丙二酸（Methylmalonic acid，MMA）是丙酸代谢途径中的二羧酸，涉及维生素B12（B12），也是人体B12检测中常用的生物标志物之一。然而，MMA与认知之间的关系尚未完全阐明。
目的
本研究进行了一项基于人群的横断面研究，以评估循环MMA与认知表现之间的相关性。
方法
本横断面研究最终纳入了4,464名年龄在60岁及以上的参与者，他们参加了1999年至2002年以及2011年至2014年的美国国家健康与营养检查调查（NHANES）。除了认知评分[数字符号替代测试（DSST）]和循环MMA水平外，协变量包括性别、年龄、种族、教育水平、婚姻状况、家庭贫困收入比（PIR）、BMI、吸烟、饮酒、血清B12、血清叶酸和红细胞叶酸。统计分析中使用单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验和Pearson卡方检验比较不同组之间的差异。非线性关系使用限制性立方样条模型分析。Pearson和Spearman相关分析用于评估关联性。回归模型采用多元线性回归模型。
结果
最终纳入4,464名参与者，平均年龄为70.05岁（标准差：7.2），其中男性2,215人（49.6%）。在Spearman相关分析中，血清MMA水平与认知水平呈显著负相关（ρ = −0.12，p < 0.001）。单变量线性回归分析结果显示，MMA平方根（sqrt）与认知评分之间存在显著负相关（B = −0.47，p < 0.001）。在控制各种协变量后，MMA平方根与认知评分仍保持显著负相关，B值分别为−0.13、−0.13和−0.14。分层分析结果表明，一些协变量可能影响模型的稳定性。敏感性分析结果显示，在调整协变量同型半胱氨酸（HCY）后，或排除高血压或慢性肾病（CKD）患者后，MMA平方根与认知评分的相关性不再具有统计学意义。
结论
在60岁及以上的普通人群中，循环MMA与认知之间存在显著的负相关性，其中HCY、高血压和CKD被确定为重要的影响因素。
引言
甲基丙二酸（MMA）是甲基丙二酰辅酶A代谢的副产物。甲基丙二酰辅酶A是一种线粒体中间代谢产物，来源于奇链脂肪酸和几种氨基酸（异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苏氨酸）的分解代谢。它可以转化为琥珀酸并进入克雷布斯循环，而B12在此过程中作为关键催化酶的辅助因子发挥重要作用。在以往的研究中，MMA主要被视为一种代谢物或疾病标志物，对其内在功能的研究有限。然而，最近的研究表明，MMA可能具有重要的生物学功能。例如，一项重要研究表明，随着年龄增长积累的MMA可以通过增强SRY-box转录因子4（SOX4）基因的表达来诱导转录重编程，从而促进肿瘤进展和侵袭性。此外，MMA诱导神经内分泌特异性转录因子FOXA2激活抑制素βA（INHBA）的转录，进而促进胰腺神经内分泌肿瘤的进展。血清MMA还与成年癌症患者的长期死亡风险升高有关，特别是在血清钴胺素水平较高的患者中。钴胺素相关的B蛋白（MMAB）通过MMA促进胆固醇稳态的负反馈控制。此外，MMA损害SH-SY5Y神经元细胞的线粒体呼吸并降低分化标志物的表达。
认知障碍是神经系统功能障碍的常见表现，发生在甲基丙二酸血症、亨廷顿病、脑瘫和抑郁症等遗传性、神经性和精神疾病中。认知功能与B12的关系已被广泛研究。B12是神经系统发育和维持的关键营养素，其缺乏与神经和精神疾病（包括认知能力下降）相关。
MMA作为一种代谢副产物，是B12状态的重要功能指标，可以反映细胞内B12的可用性。许多研究将MMA用作B12的标志物之一，甚至有人将血清MMA水平等同于整体B12状态。尽管这些发现间接支持了MMA与认知障碍之间的关联，但MMA的确切作用仍存在争议，因为其他研究未报告显著相关性。为了澄清这种关系，我们进行了基于人群的横断面研究，以评估普通人群中MMA与认知之间的关联。
材料与方法
研究人群
美国国家健康与营养检查调查（NHANES）由美国疾病控制与预防中心（CDC）开展。该计划采用分层、多阶段和概率集群设计，评估所有年龄组美国居民的健康和营养状况。调查通过标准化问卷、体检和实验室测试进行，研究设计和详细程序已公开披露。
在我们的分析中，我们使用了来自四个NHANES数据周期（1999-2000、2001-2002、2011-2012和2013-2014）中包含MMA测量的38,372名参与者的数据。我们排除了缺乏MMA测量或认知评估数据的参与者（n = 32,947），认知评估仅适用于60岁及以上的参与者。此外，我们依次排除了缺乏教育状况记录（n = 7）、婚姻状况记录（n = 124）、家庭贫困收入比（PIR）记录（n = 506）、BMI记录（n = 147）、吸烟状况记录（n = 4）、饮酒状况记录（n = 96）、B12测量记录（n = 28）、血清叶酸测量记录（n = 17）和红细胞（RBC）叶酸测量记录（n = 32）的参与者（总计961）。最终，共有4,464名60岁及以上的参与者被纳入本研究。
MMA测量和认知评估
MMA水平在血浆或血清样本中测量。在1999-2000和2001-2002周期中，NHANES使用气相色谱-质谱法（GC/MS）测量MMA。在2011-2012和2013-2014周期中，使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测量MMA。这两种方法表现出极好的一致性且偏差最小。根据NHANES实验室协议描述，MMA的总变异系数（CV）为2.3%-8.4%。在本研究中，MMA水平以nmol/L为单位测量。
数字符号替代测试（DSST）是韦克斯勒成人智力量表（WAIS III）中的一个性能模块，测试受试者的反应速度、持续注意力、视觉空间技能、联想学习和记忆，并已在大规模筛查、流行病学和临床研究中使用。测试使用一张表格，要求参与者在120秒内将对应符号复制到数字旁边的133个方框中。分数是正确匹配的总数，完成的项目越多，得分越高，最高总分为133。
协变量测量
所有人口统计变量均通过问卷获得。种族/民族分类为：墨西哥裔美国人、其他西班牙裔美国人、非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人和其他种族（包括多种族）。教育水平分为三类：高中以下、高中和大学及以上。婚姻状况分为三大类：已婚或与伴侣同居、分居或丧偶或离婚、从未结婚。连续变量家庭PIR通过将家庭收入除以贫困指南计算得出，具体到家庭规模、适当的年份和州，由于披露问题，值大于或等于5.0的编码为5.0。BMI通过体重（kg）除以身高平方（m²）计算得出。吸烟状况分为吸烟者和非吸烟者，吸烟者定义为过去吸过超过100支烟的人。饮酒状况分为饮酒者和非饮酒者，饮酒者定义为过去一年至少饮酒12次的人。
血清B12和叶酸使用“Quantaphase II Folate/B12”放射试剂盒（Bio-Rad Laboratories，1993）测量。测量通过将血清或全血裂解样品与含二硫苏糖醇（DTT）和氰化物的溶液中的57Co标记B12或125I标记叶酸混合进行。血清B12和叶酸的总CV分别为<5%和3.1%-16.8%。在RBC叶酸测试中，样品首先用抗坏血酸溶液按1:11稀释并在测试前孵育90分钟，或立即冷冻以备将来测试。RBC叶酸的总CV为3.1%-8.0%。血清同型半胱氨酸（HCY）使用Abbott特定分析仪上的荧光偏振免疫测定法（FPIA）测量，这是一种Abbott的自动化分析方法，HCY的总CV为2.7%-4.8%。
血清或血浆总胆固醇（TC）通过一系列耦合和酶促反应测量，水解胆固醇酯并氧化胆固醇的3-OH基团，副产物H2O2在过氧化物酶催化的反应中发生颜色变化，颜色强度与TC浓度成正比。TC的总CV为1.1%-1.6%。血红蛋白（Hb）通过光度法测定，使用标准公式计算波长525 nm处的光密度，总CV为<1.5%。糖尿病定义为随机血糖水平≥11.1 mmol/L或空腹血糖水平≥7.0 mmol/L。空腹血糖水平的总CV为0.9%-2.5%。高血压定义为招募时平均收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg。慢性肾病（CKD）定义为估算的肾小球滤过率（eGFR）<60 mL/min每1.73 m²，eGFR使用慢性肾病流行病学合作（CKD-EPI）方程计算。
统计分析
统计分析使用R版本4.2.2和SPSS软件版本26进行。统计检验为双尾检验，统计显著性定义为p < 0.05。我们首先展示了总人群和MMA水平四分位数的基线特征。使用单因素方差分析和Kruskal-Wallis检验对连续变量进行比较，使用Pearson卡方检验对分类变量进行比较。连续变量表示为均值（标准差，SD），分类变量表示为计数（百分比，%）。
在后续分析中，原始MMA值被转换为其平方根（sqrt），以开发更稳健的回归模型。为了检查MMA水平平方根与认知评分之间的非线性关联，进行了具有三个节点（第10、50和90百分位数）的限制性立方样条（RCS）分析。分析限制在第10和90百分位数之间的值，以最小化异常值的潜在影响，使用第25百分位数作为参考。为了检查MMA与其他协变量之间的关系，进行了Spearman相关分析和Mann-Whitney U检验。
使用多元线性回归模型评估MMA平方根（自变量）与认知水平（因变量）之间的关联。为了验证协变量的潜在影响，逐步构建了三个多变量调整模型。模型1调整了性别、年龄、种族、教育、婚姻状况和家庭PIR；模型2进一步调整了BMI、吸烟和饮酒；模型3进一步调整了B12、血清叶酸和RBC叶酸。
进一步按性别（男性和女性）、年龄（≤70岁和>70岁）、种族（墨西哥裔美国人、其他西班牙裔美国人、非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人和其他种族）、教育水平（高中以下、高中和大学及以上）、婚姻状况（已婚或与伴侣同居、分居或丧偶或离婚和从未结婚）、BMI（<30 kg/m²和≥30 kg/m²）、吸烟（吸烟者和非吸烟者）、饮酒（饮酒者和非饮酒者）、血清B12（≤400 pmol/L和>400 pmol/L）、血清叶酸（≤40 nmol/L和>40 nmol/L）和RBC叶酸（≤1,000 nmol/L和>1,000 nmol/L）进行了分层分析。
进行了两项敏感性分析：(1) 对几个生物标志物进行了进一步调整，包括HCY、TC和Hb。(2) 从回归分析中进一步排除了糖尿病、高血压和CKD患者。
结果
基本特征
最终队列包括4,464名参与者，平均年龄为70.05岁（标准差：7.2，均≥60岁），其中包括2,215名男性，占49.6%。总体而言，在MMA四分位数之间的比较中，认知评分随着MMA四分位数的增加而逐渐下降。MMA水平较高的个体往往年龄较大、来自低收入家庭、血清B12水平较低以及RBC叶酸水平较高。
MMA和协变量
在Spearman相关分析中，血清MMA与年龄（p < 0.001）和RBC叶酸水平（p=0.002）呈正相关；但与家庭PIR（p < 0.001）和血清B12（p < 0.001）呈负相关；还与婚姻状况（p < 0.001）和种族（p = 0.038）相关；与教育水平（p = 0.194）、BMI（p = 0.532）和血清叶酸（p = 0.108）无相关性。在Mann-Whitney U检验中，不同性别、吸烟和饮酒状态下的MMA水平无显著差异。
MMA和认知
在Spearman相关分析中，血清MMA水平与认知评分之间观察到显著的负相关（ρ = −0.12，p < 0.001）。在RCS分析中，MMA平方根与认知评分之间没有非线性关系的证据（非线性p值= 0.596）。单变量线性回归分析结果表明，MMA平方根与认知评分之间存在高度显著的负相关（B = −0.47，p < 0.001）。尽管相关性显著，但关联强度相对较弱（β = −0.12，调整后的R平方= 0.01）。在三个不断增加协变量的多元线性回归模型中，MMA平方根与认知评分之间存在显著的负相关，B值分别为−0.13、−0.13和−0.14，p值<0.05。与单变量线性回归相比，B值大幅下降，调整后的R平方值大幅上升。多元线性回归解释了认知表现约40%的方差。
分层分析和敏感性分析
在分层分析中，MMA平方根与认知评分之间的反向关联在男性、墨西哥裔美国人、其他种族、高中教育水平、未婚状态、家庭PIR > 2.5、BMI ≥ 30 kg/m²、血清叶酸 ≤ 40 nmol/L和RBC叶酸 ≤ 1,000 nmol/L中减弱（p ≥ 0.05）。
在进一步分析中，分别调整血清TC和Hb的回归模型p值<0.05。然而，在调整HCY后，回归变得不显著（p = 0.85）。在排除特定疾病的情况下，原始单变量线性回归p值均<0.001。在排除高血压和CKD患者后，模型1、2和3中回归系数的p值均>0.05，而排除糖尿病患者的模型仍然显著（p < 0.05）。
讨论
普通人群中血清MMA浓度在18至20岁之间开始上升，并随着年龄的增长继续增加。因此，探索这种代谢物的生物学功能和健康影响具有临床意义。一些研究报告称MMA与认知功能之间没有关联。De Lau等人在其随访期间未观察到MMA与认知能力下降率之间的显著相关性。在另一项研究中，尽管高MMA与认知表现之间存在显著相互作用，但升高的MMA浓度与认知能力下降无关联。在以MMA水平显著升高为特征的甲基丙二酸血症中，精神运动迟缓和智力障碍是常见的临床表现，尽管一些患者仍保持认知完整。类似地，一项随访队列表明，持续中低水平尿MMA升高的个体表现出正常的认知表现。
然而，新兴证据表明MMA与认知能力下降之间存在关系。在我们之前的荟萃分析中，6项横断面研究中有4项支持这种相关性。值得注意的是，MMA浓度加倍与认知能力下降约60%的速度加快相关。此外，MMA与整体认知和情景记忆呈逆相关。虽然社区研究未发现高MMA水平与脑体积损失之间的关联，但他们发现了与认知障碍的联系。在使用混合效应模型的多变量分析中，只有MMA与较低的整体认知评分显著相关；较高的MMA浓度预测了6年随访期间更快的认知能力下降。然而，应该注意的是，这些结论源于研究B12-认知关系的研究，主要是在老年人群中，MMA作为B12状态的替代标志物。因此，这些发现可能间接反映了MMA-认知关联。直接分析MMA和认知得出了相同结论。值得注意的是，血清MMA和HCY与认知障碍的相关性比B12更强。MMA升高也被牵涉到老年中风幸存者的认知障碍中。另一项基于NHANES的研究显示，在患有蛋白尿的老年CKD患者中，MMA水平与残余肾功能和营养状况呈逆相关。至关重要的是，在多变量调整后，升高的血清MMA成为认知能力下降的独立预测因子。
升高的MMA水平与典型认知神经疾病相关。在痴呆病例对照研究中，病例的MMA水平显著高于对照组。由升高的MMA定义的B12缺乏与痴呆风险增加相关。重要的是，升高的MMA和HCY，而不是血浆B12，与病理确诊的阿尔茨海默病相关。在预测AD和认知功能障碍的潜在生物标志物中，MMA显示出最强大和一致的预测价值。血浆MMA升高的人群也显示出认知障碍和抑郁的患病率更高。在cblC-MMA病例中，血清外泌体MMA水平，特别是神经元来源的外泌体，可能作为识别MMA诱导的认知障碍的生物标志物。
新兴证据表明MMA具有神经毒性作用。在帕金森病中，较高的黑质回声性与较高的血浆MMA浓度相关。高MMA浓度还与更严重的白质病变（WML）相关，尽管这种关联在统计学上仅在脑室周围WML中显著。机制上，一项病例对照研究提出，升高的MMA可能会触发免疫细胞释放诸如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等因素；这些因素以及MMA本身可能能够穿过血脑屏障并诱发认知障碍。
在敏感性分析中，排除高血压患者后，MMA与认知测试评分之间的关联减弱。作为认知能力下降的一个既定风险因素，高血压可能通过MMA导致认知功能障碍。这些发现表明MMA和高血压可能对认知功能障碍有协同作用，需要进一步研究。通过控制HCY或排除CKD患者后，MMA与认知之间的关联也显著减弱。这表明MMA可能不是认知功能的独立风险因素，而是HCY或CKD的潜在替代标志物。事实上，CKD是老年人MMA和HCY水平升高的重要决定因素。肾功能受损导致MMA和HCY的同时增加，而HCY本身已被报道与认知呈逆相关。因此，在调整HCY或排除CKD患者后，这种关联的减弱并不令人惊讶。其他能显著影响HCY的因素，如有毒金属，也可能直接或间接干扰MMA与认知之间的关联，需要进一步研究。
值得注意的是，尽管在MMA和认知评分的单变量和多变量回归分析中都获得了显著的p值，但调整后的R平方值从单变量模型中的0.01大幅增加到多变量模型中的约0.4，表明与其它协变量相比，MMA仅占认知评分方差的最小比例。MMA的B和β值在协变量调整后显著减弱进一步支持这一发现。实际上，在模型3中，具有最高绝对β值的协变量是教育水平（β = 0.37）、年龄（β = −0.24）和家庭PIR（β = 0.24）。本研究还有几个局限性。首先，认知评估仅依赖于DSST，尽管其敏感性高，但并未全面评估所有认知领域（如执行功能、语言）。其次，MMA和实验室变量的单时间点测量可能无法捕捉长期生物状态。此外，观察性设计排除了因果推断，残余混杂因素仍可能存在。需要进一步的实验研究来确定两者之间的因果关系和确切机制。
总之，这项横断面研究表明血清MMA与老年人的认知表现呈负相关，HCY、高血压和CKD被确定为关键调节因素。
(全文结束)
