对于从事脑血管疾病研究的学者而言，显然需要一种不受手术干扰的实验性脑梗塞模型。先前用于制造脑梗塞的外科技术未能满足我们认为合适的实验模型应具备的标准。因此，我们开发了一种通过眼眶后空间的硬膜外途径接近大脑中动脉的方法，并使用Zeiss手术显微镜。我们将详细描述该技术并说明其在制造脑梗塞方面的有效性。
技术方法
实验梗塞的制造。—虽然该技术适用于大多数实验动物，但我们将详细描述在猫身上使用的方法。动物以戊巴比妥（25 mg/kg）轻度麻醉，注射到胸膜腔内。经气管插管后，手术部位剃毛并用六氯酚（pHisoHex）作为消毒剂准备。头部置于头架中并覆盖消毒巾。
使用Bovie电外科设备的切割电流从头部中线到颧弓作一线性切口（图1）。用伤口夹将皮肤边缘和浅表头皮肌肉牢固地固定在消毒巾上，以防止血液渗出。用切割电流将软组织从前、后方与骨性眶缘分离。用咬骨钳切除眶缘连同部分颧弓。将软骨蜡填入骨的粗糙边缘，以防止可能出现的少量出血。
图1. 手术切口
在颞肌上从眶上嵴到颧弓后部作一弧形切口。此时可在肌肉浅筋膜中识别颞浅动脉。烧灼该动脉以减少失血。再次使用切割电流分离颞肌的两层。通过肌肉可触知下颌骨髁状突的骨性突起；用咬骨钳将其切除。
剥离前、后方的颅骨骨膜。确定骨膜确实向前方剥离很重要，因为这层组织连同眶周筋膜一起维持眶内容物的连续性，使操作者能够向前方移位眶内容物而不损伤眼睛，也不使软性眶周脂肪组织突入手术视野。剥离颅骨骨膜后，放置一自持式拉钩。
在颞骨上钻一小孔。将颅骨切除开口扩大至蝶骨翼（图2）。颅骨切除是主要的失血来源；通过尽可能远离中线并频繁使用小块骨蜡可将失血量降至最低。硬脑膜保持完整，但由于在这些动物中硬脑膜较薄，皮层的浅表血管可通过硬脑膜看到。
图2. 手术视野位于图中央，介于向前移位的眶内容物（左侧）与未牵拉的脑组织之间。硬脑膜完整；浅表皮层血管可通过其看到。
在手术的其余部分，使用带有200毫米物镜和x20目镜的Zeiss手术显微镜；在接下来的步骤中，放大倍数设定为6。用弯头咬骨钳切除蝶骨翼。脑膜中动脉通过此骨进入颅中窝。其进入部位可变，但易于识别。用低电流在骨的硬脑膜侧和眶侧（其起源处）烧灼该动脉。将蝶骨翼切除至视神经。视神经覆盖的硬脑膜上有数条小脑膜血管；这些血管也应以非常低的电流在远离神经硬脑膜鞘起源处烧灼。
将手术显微镜的放大倍数设定为10。用11号刀片在视神经鞘起源处切开硬脑膜。切口向前延伸约1厘米。此时脑脊液涌入手术视野；用轻柔的负压缓慢吸除。
将手术显微镜的放大倍数设定为16。通过硬脑膜切口可见覆盖Willis环主要血管的细小蛛网膜组织。用11号刀片分离此半透明网状结构。如使用新刀片，蛛网膜提供的阻力很小，通常只会切割所需量的组织。该步骤无出血。
去除蛛网膜组织后，相对容易抬高大脑中动脉环，该动脉从中线附近的颈内动脉起源。颈内动脉和大脑中动脉均沿视神经走行，但方向不同（图3）。将小型Mayfield夹（或其他适当尺寸的动脉夹）跨整个大脑中动脉宽度夹闭。
图3. 通过手术显微镜拍摄的照片，显示夹闭前暴露的大脑中动脉（MCA）。还可看到颈内动脉（ICA）、前 cerebral artery（ACA）（位于蛛网膜下）、左视神经（LON）、右视神经（RON）和视交叉（OC）。
通过改变手术显微镜的角度并观察夹子中的整个血管，可验证血管的阻塞。白色血栓常可在夹子远端形成并向大脑中动脉的第一个分支传播。通过手术显微镜观察完整硬脑膜下的皮层浅表静脉中血流速度的降低，也可看到并用于验证动脉阻塞的完整性。
手术过程中无需牵拉脑组织；眶内容物向前方移位。完成手术时，仅Mayfield夹的夹臂靠近脑组织；夹子其余部分位于硬膜外的软性眶组织中，不会造成脑组织的硬膜外压迫。此外，避免了Willis环附近小穿支血管的牵拉，若夹子放置得当，则不会阻塞这些血管。
如果动物用于短期皮层血流研究，可单独切开并移除覆盖大脑凸面的硬脑膜。如果动物用于长期研究，则冲洗并分三层缝合伤口。随后可打开覆盖大脑凸面的硬脑膜，以观察和拍摄浅表微血管。
梗塞面积的估计。—在阻塞大脑中动脉后5至7天处死猫。动物死亡前原位检查大脑，并通过臂头动脉用10%福尔马林灌注。大脑在10%福尔马林中固定数天，然后在轮廓斜切盒中切片（图4）。获得相当均匀的额状切片。
图4. 用于大脑切片的轮廓斜切盒
在每块脑组织切片中，梗塞区域的面积在照片上（图5）用测面积计测量。用平均端面法估算梗塞体积：将单一切片两面的梗塞面积相加，除以2，再乘以切片厚度。将这些单一切片体积相加，提供整个梗塞体积的估计值。用相同方法计算脑切片的总体积。
图5. 左侧大脑中动脉阻塞6天后取出的猫脑额状切片。注意梗塞的位置和范围
为比较不同动物中梗塞的大小，需要校正因子，因为照片大小略有差异，且脑体积存在微小差异。照片中脑切片的位移在量筒中测量为20至25毫升。我们任意选择25毫升作为所有脑组织参考的标准。将每个标本照片切片的计算总体积除以25，得到校正因子。然后将计算的梗塞体积乘以校正因子，通常在0.90至1.10之间。所得值（立方厘米）称为"校正梗塞体积"。
结果
失血和低血压。—该大脑中动脉入路在8只猫中开发。在这些动物以及用于短期研究的其他动物中，通过放置在股动脉内的留置导管监测系统血压。平均血压始终在100至120毫米汞柱之间，手术过程中无下降。称量纱布，并估算吸管中的血液量。这些动物中最大失血量在5至10毫升之间。后续动物中的失血量未超过此量，尽管在技术初步开发后仅进行了粗略估计。
脑梗塞的制造。—在16只猫中阻塞了大脑中动脉。所有动物临床检查均显示脑梗塞证据：对侧肢体明显无力和痉挛，向阻塞侧转圈，以及警觉性降低。通常，神经功能缺损的程度与内囊受累程度相关，而非与后来检查脑组织确定的梗塞大小相关。然而，动物的反应性似乎与梗塞大小更为密切。
在那些处死时在脑表面观察到梗塞的动物中，梗塞周围区域的小血管显著扩张。然而，靠近梗塞中心处，扩张的血管逐渐减少，事实上，可见的任何类型血管都较少。此外，根据血细胞成分聚集物（"颗粒流"或"淤滞"）的缓慢移动判断，浅表血管中的血流速度明显降低。
在全部16只动物中，病理检查检测到脑梗塞。梗塞大小各异，如每只动物的校正梗塞体积变化所示（表）。此外，梗塞位置也略有不同。在某些动物中，梗塞较深，靠近中线和基底节；在其他动物中，梗塞延伸至皮层表面。
讨论
实验模型的标准。—为使实验动物中的脑梗塞尽可能接近临床情况，应满足以下标准：
- 梗塞产生时不应有明显失血或低血压。
- 脑组织不应受到牵拉或操作。
- 硬脑膜包膜应保持完整，以防止伴随脑水肿的人工减压。
- 大脑中动脉的穿支和其他可能作为侧支供应来源的小血管不应受损。
- 除为产生梗塞而阻塞的血管外，对较大血管的操作应保持在最低限度。
我们认为，我们对大脑中动脉的入路满足了这些标准。在所有动物中，当夹闭动脉时均发生梗塞，尽管没有低血压。因此，这可能是一种比已报道的一些方法更有效的产生梗塞的方法。仅提到了16只猫的结果；我们已在另外60只猫中使用该技术评估各种治疗方法。通过小改动，该技术可轻松适应犬；我们已在45只松鼠猴和5只猕猴的脑梗塞研究中使用它。
梗塞大小和位置的变异性。—在每只动物中，大脑中动脉阻塞后均发生梗塞，但梗塞的大小和位置在不同动物间差异很大。这与手术期间的系统血压变化或失血无关。这种变异可能是由于血管解剖排列的差异以及流向通常由阻塞动脉供应区域的侧支通道中实际和潜在血流量的差异所致。推测梗塞发生在侧支供血不足的区域，而较小的梗塞发生在具有更发达侧支血供的动物中。由于这种变异性，使用此实验模型评估治疗方法需要对动物组的梗塞体积进行统计分析和比较。
与临床情况的比较。—显然，任何依赖于暴露和操作大脑主要血管以产生脑梗塞的外科技术都无法完全模拟人类的临床情况。此实验模型与患者之间不可避免的差异包括：
- 在人类非栓塞性血管疾病中，通常在数年内逐渐发展出血管的主要或轻微狭窄。这导致(a)大量侧支供血通道的形成和(b)通过受影响血管的血流逐渐减少。在我们的研究中，在原本无疾病的血管系统中产生急性、突然的血管阻塞。
- 不同物种之间在脑表面和内部血管的吻合程度以及Willis环的模式上存在显著差异。
- 不同物种之间脑血管的神经源性控制可能存在显著差异，导致对血管突然阻塞的不同反应。
- 凝血机制和血液本身对血流速度降低的反应可能存在显著的种间差异。
这些困难不易克服。然而，尽管存在差异，我们相信我们的技术确实提供了一个适合研究脑梗塞自然发展史以及脑梗塞治疗和修正的实验模型。
总结
尽管实验性产生脑梗塞不能完全复制临床情况，但实验模型要适用，至少必须满足某些标准。这些标准包括：无明显失血和低血压、无脑组织牵拉和操作、保持硬脑膜完整，以及无不必要的血管操作或损伤。本文所述的使用手术显微镜的硬膜外途径接近大脑中动脉满足了这些标准。暴露后，用夹子或钳子阻塞动脉。在猫、松鼠猴和猕猴中， invariably产生大小和位置各异的脑梗塞。该技术也应适用于犬和其他动物。可对所产生梗塞的发展、修正和治疗进行短期或长期研究。
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