正文
全球60岁及以上人口已达10亿，占全球人口的10%，预计到2050年这一比例将达到22%，并已在世界范围内造成紧迫的医疗和社会挑战。白色脂肪组织（WAT）在生命早期即出现衰老，这会导致全身性代谢紊乱，包括肝脏疾病，因为肝脏通过门静脉直接暴露于内脏脂肪分泌的脂肪因子。因此，需要更好地理解WAT-肝脏轴在衰老过程中的变化，以便开发能够延缓全身衰老进程和相关疾病的疗法。
目前，除小鼠异时性血液交换外，人类临床研究和啮齿动物衰老模型都非常耗时，而小鼠异时性血液交换作为一种侵入性操作，无法直接应用于人类衰老研究。考虑到不同物种间的差异，人类体外模型在研究异时性血液交换的关键机制方面更具临床相关性，但面临维持肝细胞和脂肪细胞活力与功能性的挑战，并且常常缺乏重现器官间串扰的能力。基于人类原代细胞的系统还存在可重复性、可扩展性差以及基因操作方法有限的问题。基于人类诱导多能干细胞（hiPSC）的方法可以克服这些限制，但生成功能性iPSC来源的脂肪细胞并将其与肝细胞连接的技术直到最近才被开发出来。
在此，我们研究了血液异时性对人类iPSC来源的WAT-肝脏轴微生理系统（MPS）的影响，这是一种我们最近开发的临床前动物系统替代品，受到FDA现代化法案2.0的倡导。我们微型化的体外人类功能性组织模型将老龄捐赠者血清的用量减少了2-3个数量级。我们发现，来自年长（>62岁）捐赠者的人类血清在4天内就建立了衰老的标志性特征，准确地代表了在体内需要数十年才能完成的人类衰老过程。此外，相互连接的WAT-肝脏MPS允许持续培养基灌注，并能够模拟器官间串扰。我们揭示了衰老从脂肪向肝脏的传播机制以及人类衰老可塑性的背后机制，通过这种新的芯片上人类衰老方法增强了对这一基本过程的理解。
结果
人类血清诱导WAT MPS和肝脏MPS衰老，以及衰老脂肪对肝脏的促衰老作用
hiPSC来源的MPS（iADIPO和iHEP MPS，也简称为WAT和肝脏MPS）用含有5%来自年长或年轻人类捐赠者血清的类人血浆培养基（HPLM）灌注4天，我们分别称之为衰老循环环境（OCM）和年轻循环环境（YCM）。我们评估了多个衰老标志，包括细胞衰老、氧化性DNA损伤、炎症基因表达，以及衰老相关脂肪细胞祖细胞标志物LIFR表达的变化，以及WAT和肝脏代谢的几个关键分子和功能特征。结果表明，OCM在WAT和肝脏MPS中迅速且强有力地建立了多种衰老表型，既有普遍性的也有组织特异性的。
关于衰老的普遍标志，基于衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、CDKN1A和CDKN2A的表达，以及通过免疫荧光强度和ELISA定量确定的p16核定位和总蛋白水平的增加，OCM增加了人类组织衰老。我们检测到更高水平的衰老相关分泌表型（SASP，TNF，IL-6）的表达和分泌。氧化性DNA损伤（通过8-OHdG检测）在WAT MPS中也由OCM强烈诱导，在肝脏MPS中观察到类似但较弱的趋势。
接下来，我们检查了脂肪和肝脏的代谢标志物和功能。与YCM相比，OCM诱导了脂肪生成和脂肪脂质代谢的标志物（PPARG，FABP4，LPL，HSL），以及肥胖/衰老相关脂肪因子（LEP）和增加的内脏脂肪储库特征，即更高的EBF2。此外，OCM不仅增加了脂质合成，还提高了WAT和肝脏MPS对外源性脂肪酸的摄取。在肝脏MPS中，OCM诱导了脂肪生成主调节因子SREBP1c表达升高的趋势。
除了脂质代谢，葡萄糖代谢也受到OCM的干扰，表明存在胰岛素抵抗状态：胰岛素调节的肝脏糖异生标志物PCK1增加，胰岛素诱导的脂肪葡萄糖摄取和肝脏葡萄糖生成调节均受损。值得注意的是，与无血清的常规MPS培养基相比，YCM和OCM以相反的方向驱动了WAT MPS基因和肝脏MPS基因。
重要的是，YCM和OCM还根据血清捐赠者的性别建立了二态性模式。在WAT MPS中，这包括脂肪生成标志物、脂肪因子、胰岛素敏感性葡萄糖和脂质代谢的差异基因表达，以及炎症和皮下脂肪生成的性别差异趋势。同样，暴露于男性YCM的肝脏MPS与暴露于女性YCM的MPS相比，表现出更高的炎症、脂肪生成和衰老。
衰老诱导的内脏脂肪组织脂肪因子和代谢物分泌功能障碍通过门静脉直接影响肝脏。我们通过首先在WAT MPS中建立对YCM或OCM暴露的细胞记忆，然后将脂肪芯片与未处理的肝脏MPS通过从WAT到肝脏的单向灌注连接起来，使用基础HPLM培养基，重现了这一过程。数据表明，经OCM预处理而非YCM预处理的WAT MPS迅速在肝脏MPS中诱导了衰老标志，包括IL6、CDKN2A、PCK1和SREBP1c的更高表达，衰老和胰岛素抵抗，表现为肝脏葡萄糖生成增加和脂质积累增加。有趣的是，这种后续的肝细胞功能障碍与OCM驱动的肝脏MPS衰老表型在衰老、炎症和葡萄糖代谢的关键特征基因上有所不同。
为了进一步剖析这些芯片上衰老模式的蛋白质组学驱动因素，我们使用了来自稳定表达甲硫氨酰-tRNA合成酶突变体（MetRSL274G）的hiPSC系的WAT MPS，用于生物正交非规范氨基酸标记。该系统能够将叠氮正亮氨酸（ANL）整合到新合成的蛋白质中，然后通过叠氮基团的点击化学进行检测。使用这种方法，我们发现OCM迅速促进了新蛋白质的合成，同时激活了炎症信号通路。相反，YCM诱导了促进细胞增殖、发育途径和核心稳态生物过程的新合成生长因子群。值得注意的是，OCM下蛋白质组输出的变化也反映了在自然衰老和异时性联体共生研究中广泛观察到的与年龄相关的基因表达下降。
总之，这些结果建立了一个快速且性别特异性的体外衰老系统，使用人类iPSC来源的脂肪细胞和肝细胞，在OCM处理4天内，显示出衰老的关键特征，包括炎症/SASP标志物的分泌、氧化性DNA损伤、胰岛素敏感性降低以及葡萄糖和脂质代谢失调。此外，OCM暴露建立了一种细胞记忆，即使在停止持续暴露于OCM后，也能将衰老相关的功能障碍从一个组织传播到另一个组织。
芯片上衰老基于全基因组转录组学密切重现自然人类衰老
对经过4天血清处理的WAT MPS进行了批量RNA测序分析。主成分分析（PCA）区分了由YCM和OCM分组的两个特征聚类。差异分析表明，芯片上人类血清的异时性影响了生物医学上相关的和已知的年龄特异性基因表达模式：免疫-组织串扰和炎症调节因子、代谢、衰老标志物（如ADP-核糖基转移酶活性、胞质DNA感应、DNA损伤、寿命相关的TORC2）、细胞命运和增殖调节因子以及组织重塑因子。
为了确定芯片上衰老是否忠实地重现了人类衰老的模式，我们将RNA-seq数据与GTEx的人类皮下脂肪组织（SAT）数据库进行了比较。我们发现，人类研究和异时性WAT MPS之间重叠的前10个基因本体论（GO）术语是一致的，并且重要的是，表明OCM中炎症增加，YCM中代谢过程改善。
在对芯片上衰老的生物医学相关性进行更严格测试时，我们比较了YCM与OCM中脂肪MPS的绝对年龄与人类脂肪捐赠者的实际年龄。为此，我们开发了一个基于转录组的机器学习年龄预测模型，用于人类WAT。这种方法避免了转录本特征选择中的偏差，最大限度地减少了任意错误，并且是全面的。该机器学习流程被设计为普遍适用于WAT衰老研究。模型在GTEx数据库的70%随机选择样本上进行了训练，并根据性别和脂肪储库分别进行训练；在剩余30%的测试中，模型对男性SAT的准确率达到90%，对女性SAT为92%；对男性内脏脂肪组织（VAT）为97%，对女性VAT为94%。接下来，我们使用在人类SAT数据库上训练的模型，来预测用YCM与OCM灌注的WAT MPS的生物学年龄。我们发现，hiPSC来源的组织年龄迅速向血清捐赠者的年龄平衡。
总之，由异时性血清在芯片上迅速建立的全局基因表达反映了人类种群中的衰老模式，并且人类MPS的年龄受血清捐赠者年龄的影响。
人类WAT衰老的生物标志物和可塑性机制
为了确认并推断我们研究结果与人类衰老基本过程的相关性，我们在异时性MPS的RNA-seq与公共数据库CellGen、GenAge和Aging Atlas之间进行了更全面的比较。
首先，我们专注于识别在芯片上（YCM vs OCM）和体内（年轻 vs 年长人类）表现出相同差异的人类衰老生物标志物，即系统影响的人类WAT衰老可塑性的保守决定因素。我们通过GTEx SAT数据库对所有衰老数据集的并集进行了门控，得到了24个重叠基因，其中11个也与我们的WAT-MPS RNA-seq重叠，这些是存在于人类群体中并在4天内由人类血清在芯片上建立的11个衰老生物标志物。与YCM相比，这11个基因在GTEx中随衰老平均增加2.57倍，在OCM中平均增加1.91倍，与MPS中的人类组织衰老高度一致。确认了我们发现的重要生物医学意义并扩展了对衰老的理解，这11个生物标志物包括中心枢纽基因CXCL8（IL8）、JUN、FOS、CDKN2A、IL6，以及衰老相关通路网络，如TNF、细胞衰老、NOD样和TGFβ/SMAD。
芯片上衰老的全局mRNA水平不仅与自然人类衰老相关，另一个衰老标志——转录噪音也是如此。GTEx和MPS RNA-seq数据集之间的比较揭示了37个转录噪音生物标志物，与YCM相比，这些基因在老年人和暴露于OCM的WAT MPS中具有更高的标准偏差。这些转录噪音生物标志物，加上10个STRING预测的伙伴基因，构成了系统调节的人类组织衰老可塑性的基础，有趣的是，它们提供了与mTOR和胰岛素信号的关键联系，并勾勒出几个在衰老研究中较少涉及的网络。在较高阈值下，5个波动最大的基因连同5个预测伙伴将mTOR信号通路确定为与衰老相关的转录噪音增加的核心网络。
人类肝脏衰老的生物标志物和机制
脂肪组织在生命早期就开始衰老，并有助于其他器官系统（如肝脏）的衰老，这使我们能够比较肝脏的两种衰老诱导范式：直接血清暴露和通过异时性OCM预处理WAT与肝脏MPS之间的组织间通讯。我们发现血清异时性在脂肪和肝脏MPS中诱导了一些共同的通路，包括细胞因子相互作用。对血清异时性与异时性WAT-肝脏芯片中肝脏基因表达的初步转录组比较揭示了每种范式的共同和独特特征。
在生物医学重要性的严格验证中，这些数据集中与衰老相关的基因进一步与GTEx数据库中的人类体内肝脏衰老特征进行了比较。所有三种衰老背景都显示出一些重叠的GO术语，但两种肝脏MPS模型表现出不同的衰老特征。由OCM诱导的肝脏衰老与GTEx人类体内衰老数据共享代谢和氧化性DNA损伤特征，并且还以TGF超家族信号为特征。相比之下，经OCM处理的WAT诱导的肝脏衰老比直接OCM处理具有更明显的炎症衰老特征；重要的是，炎症术语也在体内GTEx肝脏数据中有所体现。人类肝脏的生物学年龄预测模型性能有限，并且仅略微区分了男性YCM和OCM处理的肝脏MPS之间的预测年龄。
基于与WAT MPS类似的工作流程，我们在两种条件下识别并比较了肝脏MPS中的衰老生物标志物。在表达水平上，由OCM单独诱导的8个衰老相关基因主要是生长因子，而由OCM预处理WAT诱导的15个基因不仅包括生长因子，还包括炎症介质，最显著的是IL-6。两种条件共享CDKN2B，该基因虽然独立于两个主要网络，但可以与5个预测伙伴形成PPI网络，富含TGFβ相关的衰老通路。关注生物学噪音，OCM单独处理条件显示出与mTOR信号强烈的关联，与WAT MPS中确定的核心PPI网络一致，并突出了mTOR失调作为异时性循环介质的一个核心特征。相比之下，异时性CM预处理WAT显示出染色体组分的维持和修复失调，而不涉及mTOR，考虑到异时性血清因子不再存在于培养环境中，这是一个合理的结果。
总之，我们描述了在基因表达和转录噪音水平上，系统影响的人类组织衰老可塑性的关键生物标志物和机制。
测试重要人类组织的年轻化策略
MPS以其支持药物筛选的能力而闻名，但尚未应用于测试年轻化策略。在这里，我们使用人类芯片上衰老模型在两个关键方向进行药物筛选：延缓衰老和逆转衰老。在第一种方法中，WAT MPS在存在或不存在抗衰老药物组合（达沙替尼+槲皮素，简称DQ）、ALK5抑制剂、催产素或mTOR抑制剂雷帕霉素的情况下，用OCM处理4天。在第二种药理学逆转衰老的方法中，WAT MPS先用OCM处理4天建立衰老，然后在存在或不存在DQ、Alk5i、OT或Rapa的情况下，继续用OCM处理4天。作为逆转衰老方法的一种变体，我们还研究了稀释老年血清是否会与DQ、Alk5i、OT或Rapa产生协同作用。
所有四种药物在所有方案以及稀释老年血清均减弱了WAT MPS中衰老标志物CDKN2A的表达。然而，并非所有衰老参数在持续存在OCM的情况下都能被测试药物减弱，其中ALK5i和OT对脂肪生成的影响较弱。当老年血清稀释与测试的长寿候选药物联合使用时，观察到最显著的年轻化效果，包括SASP减少和代谢参数改善。此外，在这种设置下，DQ和催产素强烈增加了胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白GLUT4的表达，导致葡萄糖摄取试验中胰岛素敏感性的功能恢复。催产素在克服老年血清影响方面最为有效，减少了衰老，减轻了炎症，促进了多个重要脂肪生成和功能标志物的最高表达，并改善了葡萄糖和脂质代谢。
为了测试转录组分析确定的调控节点的功能相关性，我们在脂肪细胞MPS中建立了基于芯片内小干扰RNA（siRNA）的敲低策略。基于我们的衰老标志分析，一个关键的衰老生物标志物CDKN2A（p16）成为核心调控节点，与衰老密切相关，并通过上游和下游信号通路与其他10个标志物功能性连接。例如，敲低CDKN2A可抑制衰老相关的细胞周期停滞，减弱SASP的自分泌促衰老效应，并增强小鼠的长期代谢健康。为了验证这些p16相关的年轻化特征是否在我们的芯片上人类衰老模型中显现，我们在OCM处理期间和处理后进行了siRNA介导的CDKN2A敲低。在两种情况下，CDKN2A敲低均显著减少了衰老表型并增强了代谢功能，在OCM移除后（即与血清稀释结合）施加敲低时效果更佳。
受异时性联体共生和异时性血液交换系统的启发，我们接下来研究了从OCM切换到YCM是否可以逆转WAT MPS和肝脏MPS的实验性芯片上衰老。MPS先用含有5%老年捐赠者血清的培养基顺序灌注4天，然后切换到含有5%年轻捐赠者血清的培养基再培养4天（OY）。对照等时性MPS用含有5%老年捐赠者血清的培养基处理8天（OO）。
与OO相比，WAT MPS中的OY血清切换导致CDKN2A水平降低，代谢标志物GLUT4、FATP1和HSL水平升高，同时伴有葡萄糖摄取试验中胰岛素敏感性的恢复和脂肪酸摄取的减少。基于WAT MPS的批量RNA-seq，OY切换促进了免疫反应、代谢、细胞命运、组织重塑的转录组年轻化，使CEBPB、CEBPD和SLC2A4（GLUT4）网络恢复活力，并正常化了TGFβ/Smad信号，表明脂肪生成、胰岛素敏感性、葡萄糖代谢和信号转导有所改善。在YCM预处理后暴露于OCM的WAT MPS（YO）与YY相比，诱导了促衰老特征，包括通过p53的DNA损伤反应，以及更高的肥胖和胰岛素抵抗模式。
对于肝脏MPS，从老年血清切换到年轻血清（OY）与OO相比，减少了几个炎症标志物（TNF、NFKB1、NFKB2）并降低了衰老（基于CDKN1A水平）。葡萄糖代谢的关键标志物PCK1和脂质代谢的决定因素SREBP1c被减弱，同时伴随着更健康的生理反应：更少的葡萄糖生成、更好的胰岛素敏感性和更低的脂质积累。
总体而言，上述结果不仅表明人类组织衰老可以在芯片上快速诱导，而且人类组织年轻化同样迅速，并且只有某些方法才能实现，从而能够选择性地筛选长寿疗法。
讨论
这项研究为衰老可塑性的范式、其可诱导性和可减弱性提供了深刻的见解，并将这些概念应用于离体人类重要组织的细胞类型。我们承认WAT和肝脏分别由比脂肪细胞和肝细胞更多的细胞类型组成，因此WAT和肝脏MPS是对复杂组织的简化，但OCM驱动的这些人类iPSC来源细胞在芯片上的衰老准确地反映了生理性的体内过程，与临床观察一致，同时显著提升了我们超越动物模型和细胞培养的理解。它揭示了人类系统性环境对健康、功能以及人类组织间串扰的关键年龄相关影响。所发现的衰老属性，例如信号网络、脂肪衰老对肝脏的连锁效应、性别多态性和组织年龄记忆，使用以前的方法很难或不可能发现，包括先前发表的动物替代衰老模型。
尽管性染色体被认为是性别二态性的主要驱动因素，但本研究证明，即使使用单一的XY hiPSC系，性别二态性反应也可以由血清捐赠者的生物学性别引发。据我们所知，这种在iPSC来源的脂肪细胞和肝细胞中诱导性别偏向基因表达的策略此前未见报道。此外，MPS中血清诱导的性别二态性转录组特征被发现是组织特异性的，并且与已发表的人类数据库进行基准测试后，证实了在芯片上忠实地重现了人类WAT和肝脏中发现的性别特异性模式。具体来说，在女性血清WAT MPS中，炎症和免疫调节通路更高，而代谢过程更低，但男性血清肝脏MPS中观察到这种模式，表明芯片上的性别二态性是由复杂的血清衍生因子驱动的，具有超越炎症细胞因子的组织特异性效应。
值得注意的是，扩展的SASP列表也揭示了性别偏向的衰老表型。在OCM与YCM条件下，男性MPS表现出更强的炎症标志物差异表达，表明比女性更明显的衰老反应，尤其是在WAT MPS中。这与男性通常比女性衰老更快、寿命更短的公认观察结果一致。然而，在相同的YCM条件下，女性WAT MPS与男性WAT MPS相比，表现出更明显的促炎反应。
另一个性别特异性影响是，在女性血清处理的MPS中，OCM与YCM诱导的表型分辨率降低。这包括PCA中更广泛的分布、更高的转录噪音以及MPS年龄预测的准确性或可靠性较低。这种芯片上的性别差异与临床观察一致，即女性衰老更复杂、更多变且可能更不可预测，或许是由于激素波动、怀孕和更年期。此外，我们用于女性衰老表型的模型由于可用的机器学习样本较少，预测能力预计较弱。有限的样本量突显了皮下WAT是比肝脏更实用的模型训练和衰老预测组织，因为通过腹腔内手术进行肝脏取样比相对容易的皮下脂肪取样更具侵入性且风险更大。
MPS RNA-seq与人类转录组学（包括通过我们的ML年龄预测器）的全面比较表明，芯片上可控的衰老密切重现了体内的人类衰老。这改变了生物衰老的范式，减少了其对时间流逝的依赖，并突出了循环环境在人类组织衰老的时间非依赖诱导和减少中的关键作用。
作为一个技术限制，我们应指出我们的结果基于批量RNA-seq数据而非单细胞RNA-seq方法，因此我们使用群体噪音而非细胞间噪音来研究基因表达噪音。然而，鉴于成熟脂肪细胞的大规模单细胞RNA-seq数据队列可用性有限，我们的分析策略是目前的最佳选择。
除了基于转录组的年龄预测模型，利用蛋白质组学、代谢组学和成像模式的衰老时钟算法正在开发中。我们的系统能够通过分析微流控芯片上的BONCAT新生蛋白质组、流出培养基和显微成像，快速监测代谢物和细胞因子动态，从而在不中断MPS培养的情况下持续追踪衰老过程。整合流出培养基中的多种指标，包括脂肪酸、葡萄糖和SASP因子，以及通过成像获得的细胞形态和细胞内脂滴尺寸，为活体MPS的衰老状态评估提供了正交验证并提高了精度。
我们的系统显示，炎症细胞因子和生长因子是SASP的两个主要组成部分，是衰老的主要驱动因素，但它们在WAT和肝脏中的作用不同：OCM诱导的肝脏衰老更依赖于生长因子而非炎症细胞因子。这伴随着通过TGFβ/SMAD途径激活生长因子反应性细胞周期调节因子CDKN2B（p15），以及诱导炎症抑制因子TNFAIP3（A20）以抑制NF-κB通路。相比之下，WAT衰老显示出明显的炎症倾向，其特征是涉及即早转录因子、衰老中心CDKN2A（p16）以及关键炎症触发因子、调节因子和SASP的衰老循环，这些因子强化了自分泌衰老并传播了旁分泌衰老信号。
TGFβ是一种在衰老过程中升高的生长因子和SASP成分，可能是区分WAT与肝脏衰老的核心调节因子，因为它抑制脂肪生成，同时与其它生长因子协调对肝细胞表现出复杂效应。这一作用得到了我们研究结果的有力支持：在WAT MPS中，YCM和OCM诱导了不同的基因型和表型结果，而在肝脏MPS中，两种条件均持续向增强的发育和肝源性程序收敛。
有趣的是，OCM预处理的WAT引起的肝脏衰老与OCM诱导的衰老具有相似的特征，并且两种过程都密切类似于体内衰老（重叠的GO术语以及表达和生物噪音的衰老生物标志物）。生长因子和衰老相关调节通路以及炎症抑制因子TNFAIP3在暴露于OCM衰老WAT的肝脏中上调。然而，炎症衰老特征和促炎细胞因子/SASP也升高。基于OCM与YCM处理WAT的分泌组分析和TNF ELISA，异时性器官间特征是由于OCM衰老WAT分泌的SASP和YCM暴露的年轻WAT分泌的肝源性生长因子造成的。
WAT炎症与衰老密切相关，但也可由其他病理事件诱导，例如肥胖导致促炎巨噬细胞募集。尽管肥胖和衰老共享许多相似标志并相互促进，但对其差异的理解仍然有限。在这里，我们通过将芯片上衰老与我们先前研究中由等基因iPSC来源的M1样活化巨噬细胞驱动的芯片上炎症进行比较，扩展了这一重要议题。两种条件都表现出炎症特征；然而，M1浸润后发生了具有强烈白细胞介素产生的WAT重塑，而OCM处理的WAT在转录和翻译过程中发生了严重改变，这在衰老中很常见，并在异时性联体共生中观察到。这种方法突出了我们系统区分炎症、衰老和肥胖的临床相关细节的能力。
虽然并非详尽无遗，但我们测试了多种抗衰老策略，以证明我们的衰老芯片系统在长寿药物发现应用中的价值。血清稀释虽然是一种简单的方法，但被证明在去除衰老相关系统性因子方面非常有效，从而减弱了芯片上的衰老表型，并增强了其他干预措施的功效。这一发现与治疗性血浆交换作为一种新兴年轻化方法的临床兴趣日益增长相一致。催产素在逆转芯片上衰老方面显示出功效，并在体内对小鼠表现出抗衰老作用：同时促进脂肪分解、减少炎症和纠正内脏脂肪重新分布。通过ALK5抑制TGFβ信号也在芯片上产生了强大的年轻化效果，与体内缓解TGFβ/SMAD3驱动的衰老，并同时使小鼠的肌肉、肝脏和大脑年轻化一致。此外，在优秀的进化和体内到MPS的保守性中，对已经年老体弱的小鼠使用催产素加Alk5i治疗，将其寿命和健康寿命延长了超过72%，有趣的是，仅在雄性中如此，并且允许老年雄性和雌性小鼠在无心脏纤维化和炎症的情况下进行运动。
我们的WAT MPS表现出清晰的衰老组织记忆，包括从表观遗传调控到持续性衰老的复杂过程。尽管某些表型得到了部分缓解，但在血清撤除后，衰老特征在OCM处理的WAT中至少持续了4天，如OO对照与稀释条件所示。这种保留的衰老记忆通过循环培养基以旁/内分泌样方式传播给相互连接的肝脏MPS，导致在OCM处理的WAT MPS中独特观察到的表型，但在OCM处理的肝脏MPS中不存在。这种记忆的持久性也可能解释了异时性微流控条件下YCM的年轻化效果减弱，以及OCM的促衰老影响减弱。这些现象与在人类WAT中观察到的致肥胖记忆相似，即使在肥胖减轻后，该记忆仍使组织易发生长期炎症和胰岛素抵抗。同样，在婴儿期和儿童期有肥胖史的人，体重更容易反弹，也更难减轻。
通过血源性因子诱导衰老的一个局限性是单个捐赠者之间血清成分的变异性。在我们的初步研究中，我们观察到这种变异性在肥胖率高的地区样本中尤为明显。为了最大限度地减少这种偏差，我们选择了来自撒哈拉以南非洲人群的血清样本，该地区的平均肥胖率仍低于15%。同样，其他混杂因素，如药物使用、饮食习惯和生活方式，可能进一步影响衰老诱导的结果。从积极的角度来看，这种变异性为研究由地理、遗传和生活方式驱动的队列特异性效应提供了机会，在未来的工作中可以利用更大的捐赠者库和具有高实验可扩展性的平台进行探索。鉴于人类血清可用性的实际限制，我们微型化和成本效益高的系统为这种未来探索建立了可控人类组织芯片上衰老的关键参数。
总的来说，我们希望我们这种有前景的衰老芯片方法将有助于研究，进一步理解人类衰老，为异时性血清交换提供机制性见解，并在具有高度人类相关性的临床前模型中发现和测试抗衰老策略。
方法
伦理声明
本研究遵守所有适用的伦理法规。研究方案每年获得加州大学伯克利分校实验室与环境生物安全委员会、干细胞研究监督办公室以及环境、健康与安全办公室的批准。
本研究中使用的所有人血清样本均从商业供应商处获得，确保符合美国卫生与公众服务部的规定。由于这些样本由供应商完全去标识化，因此无法获取任何识别信息，并且根据研究规定，它们不构成“人类受试者”。本质上，这些样本是匿名的，不与任何活着的个体相关联。血清样本来自撒哈拉以南非洲血统的健康捐赠者，包括年轻（21-34岁）和年长（62岁及以上）捐赠者。补充表2提供了详细信息，包括性别和确切年龄。
MPS设备制造
MPS设备按照我们之前的方案制造。简言之，通过光刻图案化的SU-8母模板通过软光刻法复制到聚二甲基硅氧烷中。使用0.75毫米活检穿孔器打出入/出口孔。细胞室为圆形，直径1500微米，厚度60微米。聚对苯二甲酸乙二醇酯等孔膜经氧等离子体活化，然后在2%双(3-(三甲氧基硅基)丙基)胺溶液中进行化学修饰，在80°C下处理30分钟。修饰后，膜在纯异丙醇中冲洗，并夹在氧等离子体活化的PDMS细胞室和培养基通道板之间。然后将设备在110°C下烘烤30分钟，以去除溶剂、稳定键合并对设备进行灭菌。
iPSC细胞培养和分化
所有实验均使用健康人类男性G15.AO iPSC系，除新生蛋白质组学分析使用了稳定表达突变型甲硫氨酰-tRNA合成酶（MetRSL274G）的健康人类男性WTC11 iPSC系。两种iPSC均在传代次数低于80时使用。当iPSC达到80%融合度时，使用ReLeSR解离，并以1:10的比例在Matrigel包被的基质上的mTeSR Plus培养基中传代。在实验前通过单核苷酸多态性分析确认了身份。在实验前和每年进行支原体检测。每天检查无菌性。在每次分化前，通过集落形态验证未分化状态。在实验前和定期，基于特征基因表达与内胚层和中胚层分化状态的比较，并使用t检验进行统计分析，评估多能性。
脂肪细胞的分化在我们之前的研究中有所描述。简言之，hiPSC首先分化为间充质祖细胞，并转导化学诱导型PPARγ。iPSC-MSC的脂肪分化在完全培养基中诱导，并添加地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮和胰岛素，持续4天。随后在补充有胰岛素和罗格列酮的培养基中完成分化。从第0天开始，用1 µg/ml的多西环素诱导外源性PPARγ，直至结束。在第14天，脂肪表达与从人类活检中收集的原代脂肪细胞相当。
肝细胞如前所述生成。在37°C、5% CO2和5% O2条件下进行分化，除非另有说明。使用内胚层诱导培养基诱导内胚层，为期7天。在分化过程中，在前3天将以下化合物添加到EIM中：第1天添加3 µM CHIR99201，第1天和第2天添加20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和10 ng/ml骨形态发生蛋白4，第1-3天添加50 nM PI103，以及在第1天添加2%敲除血清替代物，第2天添加1%，第3天添加0.2%。在第8-17天，细胞在肝脏诱导培养基中培养，该培养基由IMDM组成，含有2%不含胰岛素的B27、1% Glutamax、1% NEAA、100 nM地塞米松、100 nM胰岛素和0.5 mM 1-硫代甘油。在HIM中添加以下化合物：在第8-17天之间添加10 ng/ml FGFb和20 ng/ml BMP4，在第12-17天之间添加20 ng/ml肝细胞生长因子。在第18-22天，细胞在Hepatocyte Culture Media BulletKit中培养，不含表皮生长因子，但添加20 ng/ml抑瘤素M和20 ng/ml HGF。在分化和维持期间，每天更换培养基。
MPS培养
对于WAT MPS，将第4天分化的iPSC-MSC解离并以8×10^7细胞/ml的密度加载到细胞室中。MPS连接到导管耦合器和管道。使用注射泵以10 µl/h的流速灌注培养基。对于肝脏MPS，将第22天的肝细胞以类似WAT MPS的方式加载，并在HCM中培养。
年轻和衰老循环环境处理
首先在WAT MPS中评估和验证了年轻和衰老循环环境的有效性，使用含有5%人类血清的HPLM培养基灌注4天，血清分别来自8位捐赠者：4位男性（2位年轻和2位老年）和4位女性（2位年轻和2位老年），每位捐赠者有n=3或4个重复。一项使用OCM的时间过程先导研究表明，4天暴露足以诱导强烈的衰老相关改变，因此被用作所有后续实验的标准条件。我们确认，尽管存在个体差异，但衰老的诱导在不同捐赠者之间是一致的，并且在男性血清中反应更明显。尽管肝脏MPS中的性别二态性不如WAT MPS明显，但在比较年轻男性和年轻女性CM时仍可观察到。为了聚焦于衰老并最大限度地减少捐赠者和性别相关的变异性，使用含有5%合并男性血清（每个年龄组来自5位捐赠者）的HPLM培养基作为OCM和YCM，用于肝脏MPS、连锁效应处理和抗衰老干预。
WAT和肝脏MPS的互连
基于我们之前建立的设计我们通过一个微升级管道系统将经CM预处理的WAT MPS和肝脏MPS互连起来，该系统实现了从WAT到肝脏的单次流。脂肪细胞和肝细胞之间的细胞比例维持在5:1，正如我们之前的研究中优化的那样，这使得肝脏MPS既不会直接负担过重，同时又对来自WAT MPS的脂质通量和炎症环境保持敏感。在连接之前，WAT MPS用补充有5% KSR的HPLM以30 µl/min的流速连续冲洗1分钟，以去除残留的含血清培养基并消除潜在的气泡。之后，互连的WAT-肝脏MPS系统使用注射泵，以20 µl/h的受控速率，用补充有5% KSR的HPLM从WAT到肝脏进行灌注。
药物管理
对于药物测试，将200 nM达沙替尼与20 µM槲皮素的抗衰老药物组合、342 nM ALK5抑制剂、15 µM醋酸催产素和20 nM雷帕霉素分别添加到测试培养基中，持续4天。药物在三种情况下给药：在未处理的WAT MPS中与OCM一起持续4天；在经4天OCM预处理的WAT MPS中与OCM一起持续4天；以及在经4天OCM预处理的WAT MPS中，在不含老年血清的普通HPLM中持续4天。对照条件设置为无药物的4天或8天OCM。所有处理均从第14天开始。
WAT MPS中的siRNA敲低
使用Lipofectamine RNAiMAX按照制造商方案对WAT MPS进行siRNA转染。简言之，将50 pmol的siRNA与Lipofectamine RNAiMAX在Opti-MEM中混合，室温孵育20分钟，然后稀释至500 µl，最终siRNA浓度为100 nM。转染培养基以20 µl/h的流速灌注到WAT MPS中过夜。在试验测试中，使用荧光素标记的对照siRNA验证了转染效率。对于实验条件，使用对照siRNA或CDKN2A/p16 siRNA对来自同一批次的WAT MPS进行平行转染。转染前，WAT MPS用Opti-MEM冲洗5分钟。第14天的WAT MPS用于衰减衰老诱导，而第12天的WAT MPS用于年轻化，以确保各条件的最终收集日期相同。
MPS中WAT和肝脏的功能检测
对于基础脂质积累检测，将含有2 µM荧光脂肪酸的低糖DMEM以2 µM的浓度在37°C下灌注到MPS中2小时。冲洗后，基于相应MPS的相对荧光单位定量MPS室内的脂肪酸。对于脂肪生成性葡萄糖摄取，WAT MPS在37°C下用低糖DMEM灌注2小时用于基础摄取，然后用1 µM胰岛素再灌注2小时用于胰岛素刺激的摄取。对于肝脏葡萄糖生成，肝脏MPS在37°C下用含有2 mM丙酮酸钠、10 mM乳酸钠的低糖DMEM灌注2小时用于基础生成，然后加入100 nM胰岛素再灌注2小时用于胰岛素抑制的生成。使用Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒测量灌注培养基中的葡萄糖含量。对于细胞因子TNF分泌，通过ELISA分析循环培养基，并相对于无血清对照条件进行评估，负值表示产量相对降低。对于DNA损伤和P16表达，在RIPA缓冲液中的细胞裂解物通过8-OHdG ELISA和P16 ELISA测量，然后归一化到蛋白质浓度。所有试剂盒均按照制造商说明使用。使用基于单色器的微孔板读数器分析检测溶液的吸光度和荧光。
免疫荧光、SA-β-gal染色和图像采集
MPS用4%多聚甲醛固定2小时。使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒标记衰老细胞，按照制造商说明，使用一致的最终pH 6.0。对于免疫染色，在含有1% BSA的PBS中封闭非特异性结合过夜。使用1%皂苷活化透化作用1小时，然后维持至最终冲洗。人类P16依次用1%人类抗p16抗体染色过夜，然后用0.2%抗兔IgG与Alexa Fluor 647偶联物染色2小时。使用300 nM DAPI和1 µM脂肪酸染料对细胞核和脂滴进行过夜染色。染色和冲洗后，使用Diamond Antifade封片剂封片。使用宽场荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜捕获明场和荧光图像。为了便于荧光比较，所有染色和成像程序保持一致。使用Zen和ImageJ软件，以一致的设置分析比色或荧光强度。成像分析基于整个细胞室。
从MPS中分离RNA和基因表达
通过切割并从设备上剥离细胞室板，然后在Trizol中裂解来暴露细胞。按照制造商说明进行RNA分离、cDNA合成和qPCR。用于qPCR的引物列于补充表3。所有基因组分析均在收集后2周内完成。
新生蛋白质组
来自MetRSL274G hiPSC WTC11系的WAT MPS按照相同方案进行分化和处理。在YCM和OCM处理开始时，将叠氮正亮氨酸添加到培养基中以标记新合成的蛋白质。在RIPA缓冲液中裂解细胞后，使用Click-iT蛋白质反应缓冲液试剂盒将ANL标记的蛋白质与炔基-Cy3偶联，随后根据制造商说明，在靶向507种血清蛋白的人类抗体阵列上进行分析。使用GenePix 4000B扫描仪在532 nm处扫描阵列，并使用GenePix Pro 6.1软件进行分析。分泌到流出培养基中的新生蛋白质也可通过透析检测，但信号在不同实验之间往往更不稳定。
数据处理包括使用阳性和阴性对照探针进行背景校正，以稳定低强度值，归一化到共同的参考阵列，以及适当平均技术和生物学重复。使用R中的limma包进行进一步的数据处理，并使用Python中的Pandas和Numpy进行辅助组织。
统计和可重复性
所有结果均在Prism 10中进行分析。每个实验组包含3个或更多生物学重复。使用具有等方差假设的配对双尾t检验来比较来自同一MPS的两组之间的差异。使用具有相同假设的非配对双尾t检验来比较不同MPS的结果。使用单因素方差分析比较三个或更多组（带一个测试变量），使用双因素方差分析比较三个或更多组（带两个测试变量），然后进行事后检验以进行多重比较校正，以确定显著性配对：使用Dunnett检验确定药物处理与老年对照之间的显著性差异，使用Šídák检验确定每个条件的跨组差异，使用Tukey检验确定所有显著性配对。所有结果的详细测试方法、P值、自由度、置信区间和精确样本量均在补充数据1中列出。P值≤0.1的精确P值在图中标注。结果表示为平均值，误差棒表示标准差。所有实验均通过独立重复至少3次并获得相似结果进行验证。
生物信息学分析方法
从MPS收集的批量RNA-seq RNA样本冷冻后用于RNA测序。文库在通过Qubit和qPCR进行质量控制后，在Illumina平台上进行测序。使用HISAT2软件由Novogene进行比对。后续的基因表达分析使用Python进行，方法如下所述。
差异表达分析RNA-seq基因计数首先使用DESeq2的默认归一化方法——比率中位数法进行归一化。对于4天血清处理样本，我们还执行了一个额外的“批内归一化”步骤，其中我们将每个样本的基因计数归一化到相应批次的对照样本，以减少WAT MPS的批次效应，然后再进行差异表达分析。
DEA使用pyDESeq2进行，这是DESeq2的Python实现。由于归一化已使用上述方法完成，因此省略了pyDESeq2流程中的内置归一化步骤。使用pyDESeq2的Wald检验鉴定差异表达基因，在通过Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正后，阈值设为FDR≤0.05且绝对log2倍数变化≥1。使用Matplotlib、Seaborn和Scipy进行DEG的可视化。基于HAGR公共数据库鉴定衰老相关基因。
基因表达的差异变异性分析基于DEA中使用的相同归一化数据集，我们使用Levene检验，以P<0.05为显著性阈值，识别了在GTEx脂肪皮下和肝脏数据库以及我们的WAT-MPS和肝脏-MPS RNA-seq数据中，随年龄增长变异性或生物学噪音显著增加的基因标记，即表达变异增加基因。使用CV来计算相对变异，以应对平均表达值。同样，基于HAGR选择衰老相关基因。测试了log2 (CVold/CVyoung) > 0.5的更高阈值，以进一步确定核心和大多失调的基因。使用Python软件包Pandas、Scikit-learn和SciPy进行数据分析和统计检验。
肝脏样本在GTEx中的门控阈值为了使用GTEx数据库与生理衰老进行交叉比较，我们最初旨在将年轻和老年队列的年龄范围与WAT分析中的血清捐赠者相匹配。然而，肝脏数据库存在局限性，包括样本量小、分布不均，以及重要的是，疾病偏倚的表型。为了平衡偏倚和统计效力，肝脏衰老的差异基因和差异变量调整为比较30-39岁与50-69岁年龄组，并降低了显著性阈值。为了补偿DEA中的性别相关方差，选择阈值降低至log2倍数变化≥0.5。
主成分分析使用Numpy和Scikit-learn对对数转换的归一化基因计数进行主成分分析，然后使用Matplotlib进行可视化。PCA图中的椭圆表示95%置信区间。
富集分析使用DAVID和SRplot基于差异基因和差异变量进行富集分析。这两个基于网络的工具产生了相似的富集术语，我们提取了在基因本体论和KEGG通路类别中富集的术语，用于进一步分析和可视化。在Benjamini-Hochberg校正后，选择调整后P≤0.05的富集术语和通路，基于生物学功能，在Python中使用Matplotlib和Seaborn绘图。
STRING网络分析使用STRING数据资源进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。应用0.4的中等置信度得分作为阈值来识别显著的相互作用。将STRING富集的术语整合到PPI可视化中。为了清晰起见，隐藏了远离PPI网络的孤立基因。在我们通过STRING进行的PPI预测中，我们观察到最新版本的结果与先前版本不一致，如补充表4所述。为了更高的置信度得分和与过去十年研究的一致性，在预测中使用了v.11.5。
基于转录组的年龄组预测模型为了评估我们的衰老诱导结果，我们从GTEx数据库获得了SAT和VAT的批量RNA-seq数据，并使用DESeq2的比率中位数法对每个储库的获取数据进行归一化。然后我们按性别分割归一化数据。对于每个性别和脂肪储库，过滤掉总计数少于100的基因。线粒体基因也被排除以降低模型复杂度。对剩余的基因进行对数转换。接下来，基于每个基因的方差-均值比和平均表达水平选择高度可变基因。使用Scikit-learn中的线性判别分析进一步降低维度。为了将每个样本分类为其捐赠者的年龄，使用Scikit-learn导入的基于kNN的分类器，在LDA转换的数据上进行训练，使用每个性别和储库的70%随机选择样本作为训练集，以6个年龄组作为预测结果。然后使用剩余30%的样本验证训练好的年龄组预测模型。在随后的迭代中，分类函数更新为包括三种算法选项：随机森林、KNN和支持向量机。在GTEx数据库上交叉验证期间表现最佳的模型是随机森林模型，该模型被选用于下游的MPS年龄预测，并共享在GitHub上。在原型阶段也测试了其他分类方法，多层感知器和XGBoost，但它们表现出过拟合的迹象，并且在交叉验证中表现不佳。
当将预测模型应用于我们的MPS时，我们首先使用与GTEx中相同的步骤预处理RNA-seq数据。接下来，我们提取在模型训练过程中识别出的高度可变基因，并应用相同的LDA模型来降低维度。LDA转换后的数据被用作预测的输入。为了可视化预测结果，我们使用LDA输出的LD1和LD2创建了一个散点图。
偏最小二乘判别分析偏最小二乘判别分析是一种多变量统计技术，用于根据基因表达对样本进行分类并揭示生物学机制。我们首先使用比率中位数法对样本进行归一化，然后应用标准缩放器以最小化对高表达基因的偏差。我们识别了最能够区分两种条件的潜在变量的主要贡献者，选择绝对权重阈值≥0.05的那些，这通常产生前1000个基因。然后根据它们在比较中跨两种条件的log2倍数变化对选定的主要贡献者基因进行排序。上调和下调的主要贡献者基因随后用于富集分析。
报告摘要
有关研究设计的更多信息，请参见本文链接的Nature Portfolio报告摘要。
数据可用性
血清捐赠者信息和qPCR引物序列见补充表2和3。样本量、统计方法和P值见补充数据1。转录组原始FASTQ数据可在基因表达综合数据库GSE280361（所有WAT MPS）和GSE309980（所有肝脏MPS）中获得。本文提供了源数据。
代码可用性
年龄预测模型代码共享在GitHub上。
参考文献
（参考文献列表省略，以保持简洁）
致谢
本研究由NIH拨款1UG3DK120004给A. Stahl，国家衰老研究所拨款R01AG071787给I.M.C.，Open Philanthropy奖项给I.M.C.，以及CDMRP/USAMRDC TX230133拨款给I.M.C.共同资助。L.Q.获得了Siebel干细胞研究所的奖学金。共聚焦图像在CRL分子成像中心拍摄，该中心由Gordon和Betty Moore基金会支持。
作者信息
作者和隶属关系
（作者列表和隶属关系省略）
贡献
I.M.C.和A. Stahl构思了这项工作的想法，规划并整合了这些研究，并解释了结果。L.Q.设计、执行并分析了主要实验。A. Sviercovich贡献了衰老特异性检测和芯片外收集样本的分析，以及芯片上BONCAT的开发。L.Q.、Y.H.和X.M.贡献了RNA-seq数据分析。Y.H.建立了WAT和肝脏年龄预测模型。X.M.进行了生物学噪音分析和STRING生物信息学分析。E.C.和Y.X.协助MPS制造和培养。L.Q.、A. Sviercovich、M.J.C.、I.M.C.和A. Stahl撰写了论文。Y.H.、A. Sviercovich和X.M.作为共同第二作者做出了同等贡献。I.M.C.和A. Stahl作为共同资深作者做出了同等贡献。L.Q.是唯一的第一作者。通讯作者为I.M.C.和A. Stahl。
通讯作者
通讯作者为Irina M. Conboy和Andreas Stahl。
伦理声明
竞争利益
I.M.C.是Generation Lab的创始人和首席科学官。本出版物中呈现的研究是独立于Generation Lab构思和进行的，未从该公司获得任何资助或投入。其他作者声明无竞争利益。
同行评审
同行评审信息
《自然生物医学工程》感谢Marco Demaria和另一位匿名审稿人对本工作的同行评审做出的贡献。同行评审报告可供查阅。
附加信息
出版商注 Springer Nature对已出版地图中的管辖权主张和机构隶属关系保持中立。
扩展数据
（扩展数据图标题和说明省略）
补充信息
（补充信息标题省略）
源数据
（源数据标题省略）
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关于本文
引用本文
Qi, L., He, Y., Sviercovich, A. 等. 人类衰老微生理系统重现体内过程，加速抗衰老策略评估. 《自然生物医学工程》 (2026).
【全文结束】