摘要
背景 烟草行业越来越多地通过电子烟和加热烟草设备等产品针对青少年。在意大利，11-13岁儿童中有9.6%使用烟草和尼古丁产品，其中电子烟最为普遍，反映了全球趋势。世界卫生组织《烟草控制框架公约》第9条和第10条规定了对包括香料在内的成分进行测试和披露的要求，强调了标准化分析方法的必要性。
目标 开发并验证一种用于电子烟液成分评估的标准化非靶向分析（NTA）方法。
方法 基于气相色谱-质谱联用技术开发了一种NTA方法，并通过一项涉及全球21个实验室的实验室间研究进行了验证。该方法能够直接分析电子烟液并半定量评估检测到的化合物。
结果 该方法应用于来自不同世卫组织区域的23种商业电子烟液，识别出香料剂、过敏原以及潜在的皮肤、眼睛和呼吸道刺激物。主要风味谱包括糖果甜味、水果味和冷却化合物，并观察到区域差异。该方法在包括设备有限的实验室在内的各个实验室中展示了稳健性和可重复性。
结论 这种标准化的NTA方法已被采纳为世卫组织标准操作程序，为监管监测提供了可靠工具，支持合规性检查、检测未申报物质，并加强全球与风味相关的法规。
已知信息
- 电子烟广泛被年轻人使用，主要归因于其吸引人的风味。
- 许多香料化合物被普遍认为适合摄入是安全的，但它们吸入的毒性在很大程度上未知。
- 现有研究强调了标准化方法的必要性，以识别和量化香料剂，确保法规合规性并评估潜在的健康风险。
本研究的贡献
本研究提出了一种标准化、验证过的用于电子烟液的气相色谱-质谱联用非靶向分析方法，在全球21个实验室进行了验证。该方法识别了23种商业电子烟液中的挥发性化合物、过敏原和潜在刺激物，为全球风味成分监测提供了一种可重复的方法。
本研究对研究、实践或政策的影响
该方法使监管和研究实验室能够检测未申报或有害的风味化合物，支持与风味相关法规的执行，并允许监测旨在增加电子烟对青少年吸引力的新行业策略。
引言
2022年的烟草使用流行率估计表明，有3700万11至15岁的儿童是尼古丁使用者。烟草行业著名的备忘录中写道，"今天的青少年是明天的潜在客户"，反映了行业内至今仍存在的态度。
烟草行业通过销售对年轻消费者有吸引力的风味和包装的产品来吸引新客户。根据意大利卫生研究院进行的2022年调查，电子烟的使用在年龄较大的儿童和青少年中比其他烟草产品更为普遍。自2007年以来，电子烟在美国市场上获得了显著的普及，无论是在吸烟者还是非吸烟者中。尽管被宣传为传统香烟的替代品，但它们也创造了一个新的尼古丁用户群体，可能成为吸烟的入门途径。根据McCauley等人，"电子烟的流行与针对年轻人的营销活动、吸引人的风味以及对尼古丁水平、成瘾性和相关健康后果的误解有关"。
电子烟烟油含有丙二醇（PG）和甘油，包含尼古丁和风味以提供独特的香气/风味感受。香料成分是电子烟的主要吸引力因素，显著增强了对用户的吸引力。电子烟用户对风味电子烟液表达了更高的满意度，突显了风味在电子烟的开始使用和持续使用中的重要作用。研究表明，电子烟液中的吸引人风味降低了电子烟的感知危害，并可能增加非使用者的使用可能性。为了吸引年轻人并规避监管（例如，烟草产品的广告），市场上迅速推出了新产品的广泛风味、对青少年有吸引力的包装以及提高吸引力的化学成分。
许多用于电子烟的香料剂被归类为一般认为适合摄入是安全的；然而，它们通过吸入的安全性在很大程度上未经测试。一些研究表明，特定的香料化合物，如双乙酰和肉桂醛，吸入时可能引起呼吸道毒性，引发了对其潜在健康影响（如氧化应激、炎症、肺组织损伤）的担忧。
因此，必须加强对电子烟液的理解，以支持监管机构更好地评估其化学成分及其成分的潜在影响。世界卫生组织《烟草控制框架公约》（WHO FCTC）第9条和第10条规定，没有理由允许使用香料等吸引性物质。新产品和创新成分不断被引入全球市场，以规避当前法规。需要一种标准化的、经过验证的非靶向分析（NTA）方法来执行FCTC指南。NTA的主要优势在于它可以在不了解其成分的情况下识别复杂基质的成分。在靶向方法中，仅基于对其成分的假设测试特定目标化合物。NTA方法从组成角度提供了对基质的广泛理解，包括化合物的识别和分类。NTA方法的主要挑战是缺乏标准化方法来确保数据质量和可重复性，这导致了标准化NTA程序的缺乏。本研究描述了一种标准化和验证过的气相色谱分析耦合质谱（GC-MS）用于电子烟液的NTA。该研究作为欧盟"烟草控制联合行动2"（JATC 2）工作包5（WP5）的一部分进行，该工作包专注于开发标准化方法测试烟草和尼古丁相关产品并验证方法以加强产品测试实验室之间的合作。实验室通过使用其机构中可用的不同分析策略参与WP5来标准化该方法。一旦定义并使用原始标准测试了最适合研究目的的分析方法，所提出的方法在独立实验室中进行了验证。
验证过程是通过一项涉及WHO烟草实验室网络（TobLabNet）和独立大学实验室的协作研究进行的，共有21个参与者。为了证明其有效性，我们使用这种NTA GC-MS方法分析了23种商业电子烟液，这些电子烟液由WHO TobLabNet从四个不同的WHO区域收集，以识别世界各地市场上电子烟的风味。这些化合物通过固相微萃取（SPME）预浓缩耦合GC-MS以及GC-高分辨率MS（GC-HRMS）得到确认。这些分析提供了商业电子烟液全球成分的快照，说明了全球使用的风味，并使我们能够对这些产品进行化学危害识别。
本研究的主要目的不是对单个液体进行详尽的分析和表征，而是证明实施标准化NTA方法用于电子烟液分析的可行性。这里描述的参数使全球实验室能够一致可靠地识别化合物，包括由于预算限制可能只能使用较先进设备的低收入和中等收入国家。这种标准化可以加强监管监测框架，支持烟草产品指令要求的执行，并增强跨司法管辖区监测数据的可比性。
所提出的方法目前正在被WHO采纳为标准操作程序（SOP），作为确保合规性和评估电子烟毒性的关键工具。
材料与方法
化学品和试剂
用于制备标准品的溶剂是含有适当量内标的乙腈（ACN）。WHO SOP 16建议使用氘代苯或二甲苯。本研究使用的内标是o-二甲苯-d10，纯度为99原子%（CAS 56004-61-6），因为其挥发性较低，更容易操作且毒性低于苯。所有化学品均来自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。
样本
2023年，WHO无烟草单位从不同国家（英国、菲律宾、南非、迪拜和瑞士）收集了23种不同随机选择的带有不同宣称风味的电子烟液样本。有两类样本：电子烟烟弹和电子烟液补充瓶。所有样本包含不同浓度的尼古丁、PG和甘油。样本代表了12个不同品牌的不同风味类别（表1）。
方法
该方法基于最近发布的JATC和WHO TobLabNet SOP（TobLabNet SOP16）。TobLabNet SOP 16是一种WHO验证的标准方法，使用非靶向GC-MS分析来识别和半定量电子烟液中的香料剂，实现全球实验室间的一致监测和监管比较。如WHO TobLabNet SOP所述，该方法的特定参数可以根据个别实验室的要求和可用设备进行调整。本调查中使用的规定在以下各节中描述。
样本准备
样本准备取决于产品类型。电子烟液补充瓶中的电子烟液使用正位移移液器转移到1.5 mL小瓶中，并在4°C-8°C的黑暗中储存。对于电子烟烟弹或一次性电子烟，准备包括从烟弹中取出电子烟液。为避免电子烟液被烟弹部分或用于打开它的工具污染，使用离心机从烟弹中提取电子烟液。样本在15 mL试管中以2000 RCF离心5分钟。使用正位移移液器提取电子烟液并转移到1.5 mL小瓶中，然后按上述方式储存。对于分析，将100 μL每种电子烟液样本移入1.5 mL GC小瓶，与0.9 mL内标溶液（xylene D10，0.05 mg/mL in ACN）混合，并注入GC-MS仪器端口。
GC-MS分析
使用安捷伦6890系列GC系统耦合5973质量选择性检测器进行非靶向风味筛选。将1微升稀释样品以不分流模式注入GC-MS端口。使用安捷伦DB-ALC1，30 m × 0.32 mm柱，膜厚1.8 μm。炉温程序如下：初始温度设定为40°C并保持1分钟。温度以每分钟5°C的速率升高至120°C，在此保持5分钟。随后，温度以每分钟15°C的速率升高至250°C，在此保持10分钟。使用正离子电子电离。传输线温度≥220°C，溶剂延迟设定为4分钟。GC-MS仪器设定为在m/z范围40-300内进行全扫描采集。
可以通过总离子流色谱图（TIC）上分析物的信噪比（S/N）比来确定方法性能的识别限（LOI）。LOI定义为S/N比为10。通过将TIC峰面积与内标直接比较获得半定量数据，假设每个已识别分析物具有一对一的响应。如果不需要半定量分析，内标的使用仍允许验证每次单独分析的GC-MS仪器响应。
SPME GC-MS分析
SPME用于确认通过GC-MS检测到的化合物，并调查可能的低浓度污染物。由于SPME减少了由甘油和PG引起的干扰，这种方法对于检测这些载体可能存在的共洗脱成分很有用。使用三相DVB/CAR/PDMS SPME纤维（2 cm长度，55 μm直径）分析具有不同极性的化合物。
对于样本准备，将10 μL电子烟液移入10 mL样本瓶中，然后加入20 μL 1 μg/μL标准品（xylene D10 in methanol）。短暂涡旋混合物以确保均匀化。随后，SPME纤维暴露在瓶顶空——位于液面上方以避免直接接触。将瓶子在60°C孵育30分钟，以允许顶空平衡和分析物吸附到纤维上。提取后，SPME纤维缩回到保护针中，并转移到GC注入端口进行进一步分析。注入端口温度设定为225°C，GC-MS分析的操作条件与GC-MS分析部分中相同。
GC-HRMS分析
使用高分辨率GC-Orbitrap仪器（Thermo Scientific Trace 1310气相色谱耦合Orbitrap Exploris GC）来确认通过低分辨率GC-MS检测到的风味的经验公式。GC-HRMS仪器以60,000分辨率运行。样本准备如低分辨率方法部分所述。稀释样品涡旋混合，2.0 μL样品以分流模式（分流比1:100）注入GC-HRMS。使用BPX-DXN柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm膜厚）。该仪器的炉温斜坡如下：从50°C开始，保持1分钟，然后以10°C/分钟的速率升高至200°C，再以20°C/分钟的速率升高至280°C并保持5分钟。采集在m/z 50-550范围内以全扫描模式进行。
成分识别
成分识别基于库匹配，完全描述在WHO SOP中。它包括用于识别和验证（如果执行）成分的方法。简而言之，建议仅考虑S/N>10的峰，并使用仪器制造商推荐的库软件。对于在NTA分析方面有经验的实验室，可以采用内部实践。
方法验证
该方法通过WHO TobLabNet SOP中包含的实验室间协作研究进行了验证。21个实验室（包括欧洲JATC2成员实验室、WHO TobLabNet和不同大学）确定了电子烟液中的香料成分含量。向所有参与者发送了协议（副本可在在线补充材料中获得），提供了要使用方法的详细描述。制备了三种含有未公开香料成分的电子烟液样本，并分发给参与者。电子烟液使用分析纯化合物精心合成，以最小化所用单个成分的潜在污染物。这包括主要成分PG和植物甘油以及香料物质。每个实验室将其结果提交给WHO，WHO使用机密实验室标识符对数据进行编码。对于统计评估，使用了混淆矩阵，基于真阳性（TP）、真阴性（TN）、假阳性（FP）和假阴性（FN）。这里，TP是报告且存在的成分，而TN是不存在且未报告的，FP是报告但不存在的，FN是存在的但未报告的。
为了定义真阴性的总数，即样本中可能存在的香料化合物的总数，由于没有普遍接受的香料总数，使用了来自欧洲共同入口网的数据，包括146种香料化合物（在欧洲电子烟液中占1%以上的成分）。
方法的性能是通过混淆矩阵确定的，计算TP率、FP率、TN率、FN率、精确度、假发现率、准确性、F1分数和Matthews相关系数。
结果
方法验证
验证结果如表2所示。对于所有分析的液体，精确度>0.90，假发现率<0.12，准确性>0.99，表明方法性能良好。参与实验室未报告对SOP或研究协议的任何偏差。
商业电子烟液分析
通过与参考光谱库比较，在23个样本中总共识别出63种化合物。在这些63种已识别化合物中，28种在至少两个不同样本中检测到，并在表3中列出。其中，21种与水果、酸-柑橘或花香相关；4种贡献了薄荷或冷却感；3种表现出糖果甜味。该风味根据其主要化合物的化学类别进行分类，由香料提取制造商协会定义。其余35种化合物，每种在单个样本中检测到，在线补充表1中报告。
WHO区域AFRO
南非南非样本主要以水果、薄荷和凉爽水果风味为特征。果味电子烟液的主要成分，如1C电子烟液，包括内酯、香兰素和丁酸酯，与奶酪、花香、果香和绿色水果味相关。标为草莓冰淇淋风味的1D电子烟液也含有香兰素和内酯，类似于1C。1D含有硫酚，一种提供乳香味的化合物。1E电子烟液被描述为具有凉爽和薄荷风味，并包含薄荷醇、l-薄荷酮和香芹酮等化合物，有助于薄荷风味。冷却感可归因于乙基二异丙基乙酰胺（DIPEA），该化合物也在1F和1G电子烟液中检测到。除了DIPEA，葡萄冰风味电子烟液1F和1G还含有丁酸和甲基邻氨基苯甲酸酯，提供果香。
WHO区域EU
瑞士瑞士2C液体的组成与样本1C相似，两者都具有水果风味特征。被描述为"Blue Razz Lemonade"的样本2D呈现水果和花香的组合。其主要成分包括乙基丁酸酯、香兰素、内酯、覆盆子酮和α-萜品醇。被标记为"Energy Ice"的样本2E含有肉桂酸酯、香茅醇、香兰素和内酯以提供水果和甜香味，而DIPEA可能被添加以提供冷却感。
样本2F、2G和2H都被描述为具有"Coeur-poire"风味，但在尼古丁含量上有所不同。在这些样本中，1-己烯醇是所有三个样本中共享的唯一香料化合物，具有强烈的清新、绿色、草本香气。样本2F和2H显示出非常相似的组成，以果味和甜香成分如乙基丁酸酯、1-丁醇、乙酸甲酯、甲酸酯、香兰素和异香兰素为特征。它们还含有花香化合物如薰衣草乙酸酯、庚醇甲酸酯和橙花乙酸酯。相比之下，样本2G具有不同的组成，以香叶醇和庚醛为主要香料剂。此外，样本2I和2F共享相似的果味特征，并含有薄荷醇乙酸酯，可能有助于冷却感。
英国6A和6B英国电子烟液被标记为柠檬风味电子烟液，两者都含有α萜品醇，提供柑橘风味。顺式柠檬醛、α柠檬醛和香茅醇仅在样本6A中检测到。6C电子烟液被描述为荔枝风味电子烟液，它具有由p-薄荷-1-醇和DIPEA提供的薄荷-凉爽香气，而果味和甜味由香茅醇和乙基麦芽酚提供。其他三种英国电子烟液6D、6E、6F被标记为：橙子、百香果、番石榴、柠檬水（6D），草莓猕猴桃（6E）和草莓冰淇淋（6F）风味。在这三种电子烟液中检测到的主要风味化合物是丁酸-乙酯、2-己烯-1-醇、香兰素、反式甲基肉桂酸酯和内酯。
其他WHO区域：EMRO和WPRO
迪拜来自迪拜（EMRO区域）的4A、4B、4C电子烟液由同一生产商制造。这些电子烟液被宣称是原始草莓、深色樱桃和森林蓝莓风味。丁酸-乙酯和3-己烯醇在所有三个样本中检测到。提供甜味的香兰素以及其他如芳樟醇、甲基肉桂酸酯和4-癸内酯等提供水果、花香和芳香香气的化合物仅在样本4A中发现。液体4B由许多具有花香的成分组成，如α和β紫罗兰酮、顺式香叶醇和梅里托塔尔。4A电子烟液具有由香兰素、乙基香兰素、3-甲基、1-2 环戊二酮、香蕉油提供的甜味和果味，以及由p-薄荷醇提供的酸味。4C液体的特征是薄荷醇乙酸酯，它提供薄荷-凉爽风味，而芳樟醇和丙酸酯提供花香、果味。
菲律宾菲律宾样本5A（WPRO区域）被宣称是薄荷风味电子烟液。其组成涉及不同的成分，如新-异薄荷醇、p-薄荷-3-酮、l-薄荷酮、p-薄荷-3-酮以提供薄荷风味，而乙基麦芽酚和DIPEA使其味道更甜更新鲜。
标签与结果比较
大多数样本的标签仅表示电子烟液的主要成分。甘油、PG、尼古丁和天然或人工香料通常出现在产品标签上，如在线补充表2所示。1C-1F和6C产品的标签上未声明任何成分。样本4A-4B-4C的标签上列出了一些香料成分。4B样本标签声明存在大马酮，这通过分析得到确认，而另外两种成分，呋喃酮和反式己-2-烯醛，在标签上列出，但未通过GC-MS检测到。在6A和6B液体（同一品牌）的标签上，指定了风味成分。乙醇和乙基麦芽酚在分析中未检测到，尽管在6A标签上声明。样本6B只有α-萜品醇作为风味，而乙醇、柠檬酸和蔗糖未通过所述NTA方法或SPME和GC-HRMS分析检测到。
讨论与结论
本研究提出了第一种基于GC-MS的标准化和验证过的NTA方法，用于分析电子烟液的组成。该方法已验证可识别电子烟液中S/N比大于10的香料化合物，并允许对未知物进行半定量测定。虽然半定量方法不提供绝对准确性，但它显示出良好的精度，并允许对每次分析的仪器响应进行持续监测。更重要的是，它使得能够对从不同实验室获得的结果进行有意义的比较。在通过与WHO的协作研究验证后，该方法用于评估从全球不同地区采样的不同商业电子烟液，并通过SPME预浓缩确认其组成，以显示没有相关的次要成分未被检测到，以及通过GC-HRMS确认所识别香料化合物的分子量。结果显示在所有调查样本中总共存在63种不同的香料化合物，在线补充表3中报告。一些香料化合物在50%以上的样本中使用，如乙基麦芽酚。其他在25%-50%的样本中检测到的常见化合物包括丁酸-乙酯、3-己烯醇、丁酸、2-甲基-乙酯、乙基-二异丙基乙酰胺、香兰素和4-癸内酯。来自不同WHO区域的大多数样本以水果和甜味为特征，其次是薄荷和凉爽风味。
除了它们的吸引力增强特性外，另一个问题是某些香料是有毒的，或尚未测试其吸入毒性。目前，关于香料化合物的吸入毒性信息有限。迫切需要澄清成分的毒理学特性，以了解吸入这些化合物可能对人类健康产生的潜在不良影响。在23种电子烟液中检测到的63种香料化合物中，8种未获得欧洲食品安全局授权在欧盟用作香料：1-己醇、p-薄荷-1-醇、α萜品醇、l-薄荷酮、乙基麦芽酚、乙基-二异丙基乙酰胺、甲基肉桂酸酯和乙基肉桂酸酯。在分析的样本中发现的物质中，没有一种被国际癌症研究机构分类为可能致癌物质。像香茅醇、芳樟醇和顺式香叶醇这样的某些香料物质被欧洲药品管理局列为过敏原。该分类的完整表格在在线补充表4中报告。总共，样本中发现的15种物质被识别出具有健康危害分类（H302、H314、H315、H317、H318、H319），表明不同的特性：皮肤腐蚀、眼睛刺激和损伤、呼吸道刺激参考。大多数这些化合物有关于生殖毒性、单次或重复暴露的器官毒性的警告、急性口服/皮肤/吸入毒性、吸入危险、严重皮肤灼伤、眼睛损伤、皮肤刺激和敏感性、呼吸道刺激。有些疑似对生育能力或胎儿有害，有些可能具有麻醉作用。一些香料化合物具有细胞毒性。对电子烟补充液中细胞毒性香料化学物质进行了评估，CLP健康危害分类的完整描述在在线补充表5中报告。除丁酸-乙酯具有低细胞毒性潜力外，乙基麦芽酚、乙基香兰素、香兰素的浓度与电子烟液的毒性之间可能存在一些相关性。
标准方法是获得电子烟全球分析中可靠、一致和可复制结果的基础。近年来，烟草行业一直在开发不同类型吸引人和吸引人的尼古丁产品。因此，现在比以往任何时候都更需要一种标准化的、经过验证的NTA方法来监测新产品。这种标准化和验证的方法正在被采纳为WHO SOP（WHO TobLabNet SOP16）。这一变化将为监管机构提供一种工具，以追踪行业不断引入电子烟市场的新型化学物质，并使烟草产品测试实验室能够识别非法或有害物质。它还将支持法院结果的有效性和严谨性。
【全文结束】