摘要
背景：肝细胞癌（HCC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因，凸显了对有效疗法的迫切需求。氯硝柳胺是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的驱虫药，可将HCC基因表达谱逆转至正常肝细胞水平，并在体外显示出有前景的抗HCC肿瘤活性；然而，其临床应用受限于极差的水溶性、低生物利用度和短暂的全身暴露，导致缺乏体内活性。我们此前使用已建立的磷酸盐前药策略提供了概念验证，证明提高口服生物利用度对于氯硝柳胺实现体内抗肿瘤活性至关重要。
方法：我们设计了一组新型氯硝柳胺前药，并筛选了八种候选药物，以评估其水溶性、化学稳定性以及对HCC细胞系的体外抗增殖活性。先导化合物SSL-0024在携带原位HCC患者来源异种移植瘤（PDX）的免疫缺陷小鼠中进一步评估了其药代动力学和抗肿瘤疗效。通过AKT-mTOR-STAT3、RAF、Wnt/β-catenin信号通路、血管相关蛋白（vasorin）相关通路和PD-L1的蛋白水平分析，评估了其观察到的活性背后的机制。
结果：SSL-0024在胃液和血浆条件下表现出显著改善的水溶性和稳定性，支持口服给药。药代动力学分析显示其血浆半衰期约为24小时，相对于原始氯硝柳胺显著延长。在原位HCC PDX小鼠中，每日一次口服SSL-0024（100 mg/kg）仅需阳性对照（氯硝柳胺乙醇胺）约46.8%的剂量，即可实现约60%的肿瘤生长抑制，且全身毒性最小。机制上，SSL-0024同时抑制AKT-mTOR-STAT3信号、RAF激酶、Wnt和VASN相关通路，并额外下调PD-L1，从而减少增殖、生存和免疫逃逸信号。
结论：通过理性设计和系统筛选，我们确定了一种先导氯硝柳胺前药候选物SSL-0024，其具有改善的水溶性和稳定性、延长的血浆半衰期、增强的口服生物利用度，并在体外和体内保留了生物活性。未来的研究将包括与标准治疗方案联合治疗，以及安全性和制剂研究，以推动其临床转化，用于治疗HCC和受氯硝柳胺调控的多种致癌通路影响的其他实体瘤。
引言
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，约占病例的75-90%，位居第五至第六大常见癌症之列，并且仍是全球癌症相关死亡的第三大原因，每年导致超过80万人死亡。大多数患者在慢性肝损伤背景下出现晚期疾病，尽管近期系统治疗取得进展，但由于分子异质性和平行致癌通路的代偿性激活，持续的治疗反应仍然有限。因此，迫切需要能够同时抑制汇聚性生存网络并维持可耐受全身暴露的治疗策略。
氯硝柳胺是一种FDA批准的驱虫药，由于其多靶点活性，已成为肿瘤药物再定位的候选药物。机制研究表明，它通过LRP6降解抑制Wnt/β-catenin信号传导、在癌症模型中抑制STAT3依赖性转录活性、以及抑制mTOR等多种信号通路。通过对生存和增殖通路的协调干扰，氯硝柳胺在HCC和其他类型癌症中显示出体外抗肿瘤效应。然而，尽管有强大的临床前疗效，氯硝柳胺在实体瘤中的临床转化因极差的水溶性和由此产生的低口服生物利用度以及快速的全身清除而受到限制。
特别是对于HCC，我们之前曾报道氯硝柳胺能有效逆转HCC基因表达谱至正常肝细胞水平，提示其抗HCC潜力。然而，仅在更易溶于水的形式——氯硝柳胺乙醇胺（NEN）（未获FDA批准用于人体）中观察到体内活性。为了促进氯硝柳胺的临床转化，我们报道了一项概念验证研究，使用氯硝柳胺的水溶性磷酸盐前药，验证了公认的假设，即改善水溶性和随之而来的口服生物利用度对于氯硝柳胺到达实体瘤发挥其多方面机制至关重要。磷酸盐方法已很成熟，因此缺乏知识产权潜力；此外，它导致血浆中游离氯硝柳胺快速达到峰值，随后快速清除，提示需要频繁给药以及组织中氯硝柳胺突然激增可能带来急性组织毒性。Hoelzen等人开发了一种缬氨酸-氯硝柳胺前药，具有增强的水溶性和口服生物利用度；然而，它在HCC细胞系的中空纤维测定中缺乏活性。还显示一种硬脂酸前药纳米颗粒平台用于氯硝柳胺可在静脉注射（而非口服给药）后增强生物利用度，用于治疗骨肉瘤。鉴于研究性氯硝柳胺前药的局限性，我们旨在设计和开发新型氯硝柳胺前药，这些前药可以增强口服生物利用度，维持更长的全身暴露，同时保留其先前验证的抗肿瘤机制。我们评估了先导化合物SSL-0024在原位HCC患者来源异种移植瘤（PDX）模型中的药代动力学特征、安全性和抗肿瘤疗效，并确认了其生物学作用机制。
材料和方法
新型氯硝柳胺前药候选物的设计、合成和理化性质表征
基于现有专利和氯硝柳胺的结构-活性关系研究，我们通过用各种硫酸酯和酯基团修饰2-羟基位置，设计了超过50种新型氯硝柳胺潜在前药。其中，八种最初由O2h Discovery（英国剑桥和印度）合成。通过1H-NMR光谱确认化学结构，并通过LC-MS/HPLC分析确定纯度。详细的合成程序和化学分析见补充材料。使用标准测定方案（O2h Discovery，印度剑桥）对所有八种前药候选物进行动力学和热力学水溶性、pH稳定性（pH 2.0和7.4）以及人血浆稳定性测试；方案见补充材料。氯硝柳胺和氯硝柳胺乙醇胺（NEN）作为参考对照。
HCC细胞系的培养
人肝细胞癌（HCC）细胞系HepG2、Hep3B和Huh7分别购自美国模式培养物集存库（ATCC）或由斯坦福大学Mark Kay博士提供。HepG2和Hep3B细胞在Eagle基础培养基中培养，Huh7细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中维持。所有培养基均补充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。细胞在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中维持。
细胞增殖测定
使用CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation assay评估氯硝柳胺前药候选物和氯硝柳胺乙醇胺（用作阳性对照）在HepG2、Huh7和Hep3B细胞中的抗增殖效应。以每孔3×10³个细胞的密度将细胞接种到96孔板中，使其贴壁过夜。每种化合物的浓度范围为0.033-50 µM，孵育72小时。处理后，向每孔加入15 μL MTS试剂，在室温下孵育4小时。通过加入100 μL终止液并在37°C孵育1小时溶解生成的甲臜产物，然后在570 nm处使用SYNERGY-LX微孔板读数器测量吸光度。使用GraphPad Prism 11.0通过非线性回归分析确定剂量-反应曲线和半数抑制浓度（IC₅₀）值。
原位HCC患者来源异种移植瘤模型中的药代动力学和组织分布分析
所有动物实验均按照ARRIVE指南进行，并获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC；协议APLAC-20167）的批准，符合美国农业部动物福利法案、PHS政策和AAALAC国际标准。使用卡尺监测肿瘤大小，不得超过最大允许直径1.70 cm，总肿瘤体积不得超过接种前体重的10%。人HCC组织是在机构审查委员会批准的方案下，经知情同意后从接受肝切除术的患者处获得的。将6至10周龄的雄性NOD-scid IL2Rgammamull小鼠（NSG小鼠，斯坦福大学转基因、敲除和肿瘤模型中心）饲养在受控环境条件下，可随意获取食物和水。
为了临床相关地评估我们的前药候选物给药后肿瘤和肝脏组织对氯硝柳胺的暴露，我们使用原位HCC患者来源异种移植瘤模型，按照先前报道的程序建立。简而言之，将来自切除患者样本的肿瘤碎片用萤光素酶报告基因标记，并在NSG小鼠肩部初始皮下植入后，通过手术植入NSG小鼠的肝脏。通过注射萤光素底物后进行生物发光成像监测肿瘤形成，并使用Lago-X进行监测。
在确认肿瘤植入后，给带有PDX的小鼠单次剂量SSL-0024（50 mg/kg）或氯硝柳胺（40 mg/kg）。在预设时间点，用异氟烷麻醉动物，通过隐静脉穿刺收集连续血样。立即将血样转移到EDTA包被的微量管中，离心获得血浆，并储存在-80°C直至进一步分析。由于预计SSL-0024会在体内释放游离氯硝柳胺；我们使用Medicilon（波士顿）进行的验证性LC-MS/MS方法评估了血浆、收获的肝脏和PDX组织中的氯硝柳胺水平。
原位PDX HCC模型中的体内疗效研究
按照上述程序，将带有PDX的小鼠随机分为三个治疗组：载体对照、SSL-0024（100 mg/kg；分子量相当于77.13 mg氯硝柳胺）或NEN（200 mg/kg，分子量相当于168.57 mg氯硝柳胺）。通过每日一次口服灌胃给药，持续25天。
每周通过生物发光成像监测肿瘤进展，每周三次记录体重。在研究结束时，收获PDX和相邻肝组织，用于通过LC-MS/MS分析进行氯硝柳胺定量和免疫组织化学分析。在终止点时收集血液进行分析，以确定对血液生化、肝肾功能和脂质代谢的影响。围手术期镇痛包括术前给予Ethiqa-XR，术后根据需要给予卡洛芬。定期监测动物的肿瘤负荷和总体健康状况。根据IACUC和AVMA指南应用人道终点。通过CO₂吸入或异氟烷麻醉后进行颈椎脱臼实施安乐死。
使用以下标准体积计算公式量化肿瘤体积。
免疫组织化学
将福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇溶液重新水化至水。使用柠檬酸盐缓冲液在热介导条件下进行抗原修复，然后冷却至室温。使用封闭缓冲液淬灭内源性过氧化物酶活性，并用磷酸盐缓冲液洗涤切片。
对增殖标志物Ki-67和凋亡标志物cleaved caspase-3进行免疫染色，按照针对Ki-67的单克隆一抗和针对caspase-3的多克隆抗体的制造商说明进行操作。简而言之，将载玻片与一抗在4°C下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。使用3,3′-二氨基联苯胺底物可视化免疫反应性，并用苏木精对细胞核进行复染。通过梯度乙醇脱水并在二甲苯中透明后，封片进行显微镜评估。
蛋白提取和免疫印迹
为了评估氯硝柳胺前药候选物对多种信号通路的影响，我们用10倍IC50剂量的SSL-0024处理Huh7细胞24小时，并通过免疫印迹测定蛋白水平。使用T-PER组织蛋白提取试剂从处理过的细胞中提取总蛋白，并通过BCA蛋白测定法进行定量。将等量蛋白在4-12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在含5%脱脂牛奶的TBST中室温封闭膜1小时，然后在4°C下与针对LRP6、β-catenin、STAT3、phospho-STAT3 （Tyr705）、Bcl-2、BCL-XL、Cyclin D1、AKT、phospho-AKT （Ser473）、mTOR、phospho-mTOR （Ser2448）、phospho-p70 S6 Kinase （Thr389）、phospho-4EBP1 （Thr37/46）、EGFR、A-Raf、B-Raf、phospho-B-Raf （Ser445）、C-Raf、phospho-C-Raf （Ser338）、Vasorin、PD-L1、ADAM17和GAPDH的一抗孵育过夜。洗涤后，与荧光二抗在室温下孵育1小时。使用Odyssey成像系统检测并记录信号。
统计分析
数据以平均值±标准误表示。使用GraphPad Prism 11.0软件进行统计分析。对于多组间的比较，采用单因素方差分析，当总体显著性达到且方差齐性假设满足时，随后进行Tukey事后检验。为减少实验间变异性，在适当情况下将数据标准化为匹配的基线或载体对照值。仅在通过Shapiro-Wilk检验结合Q-Q图评估确认正态性后进行参数分析。对于非高斯分布，应用对数转换，若转换后仍违反假设，则使用非参数检验。当标准化数据在参考组内出现零方差时，也采用非参数方法。双侧P值<0.05被认为具有统计学显著性。
结果
理化性质、体外活性分析和先导前药选择
为了克服氯硝柳胺水溶性差和生物利用度有限的缺点，我们设计并合成了八种结构修饰的氯硝柳胺前药候选物。对这些候选物进行了动力学和热力学溶解度、化学稳定性、血浆稳定性以及体外抗增殖活性的系统评估，以确定适合体内开发的先导化合物。氯硝柳胺和NEN用作这些评估的参考对照。
在所测试的八种候选物中，SSL-0024是唯一一种与氯硝柳胺相比，在动力学（增加2.2倍）和热力学（增加5倍）溶解度方面显示出显著增强的候选物。此外，SSL-0024在生理条件和胃条件下均表现出高化学稳定性，在2小时孵育期内转化为母体化合物的比例极小。在人体血浆中，85.6%的SSL-0024保持完整，表明有限过早水解，并提示具有受控全身释放的潜力。重要的是，SSL-0024在三个HCC细胞系中保留了抗增殖活性，证实了氯硝柳胺结构修饰后生物活性的保留。所有其他前药候选物要么缺乏水溶性增强，要么不稳定，要么在HCC细胞系中未能显示抗增殖效应。
总体而言，这些数据根据SSL-0024良好的溶解度、稳定性和生物活性特征，将其确定为用于进一步药代动力学和体内疗效评估的先导前药候选物。
SSL-0024显示出延长的药代动力学和良好的组织分布
在携带原位HCC PDX的NSG小鼠中，以50 mg/kg的单次口服剂量给药时，血浆浓度-时间曲线显示SSL-0024的全身暴露显著延长。具体而言，SSL-0024在24小时后仍保持可检测的血浆水平。氯硝柳胺在5分钟时达到最大血浆浓度，随后是一个以全身暴露急剧下降为特征的快速消除相；我们的概念验证氯硝柳胺磷酸盐前药也观察到相同的PK特征。此外，0-24小时的血浆浓度-时间曲线下面积显示，在共同的24小时观察窗口内，SSL-0024的暴露量是氯硝柳胺的6.6倍，表明与氯硝柳胺相比，口服生物利用度大大提高。
在24或48小时后，我们处死小鼠并收获肝脏和PDX组织以评估从SSL-0024释放的游离氯硝柳胺的量；组织分布分析显示肝脏和PDX肿瘤之间氯硝柳胺暴露存在显著差异。SSL-0024给药后24小时，肝脏氯硝柳胺浓度显著高于PDX组织。相比之下，在48小时，氯硝柳胺水平优先积累在PDX肿瘤中，而非肝脏。相比之下，氯硝柳胺治疗导致在指定时间点肝脏中的氯硝柳胺积累始终高于PDX肿瘤。剩余的候选物表现出有限的组织暴露。这些发现表明SSL-0024提供了显著改善的药代动力学特征，具有持续的血浆和组织暴露。
总之，这些结果表明SSL-0024实现了### 继续翻译
SSL-0024 抑制原位患者来源肝细胞癌异种移植瘤的体内生长
在体内疗效研究中，携带 PDX 的小鼠分别接受 100 mg/kg SSL-0024（分子量相当于 77.13 mg 氯硝柳胺）或 200 mg/kg NEN（分子量相当于 168.57 mg 氯硝柳胺）每日一次口服灌胃，持续四周。选用 NEN 而非氯硝柳胺作为参考对照，因为我们之前已证实氯硝柳胺缺乏体内活性。100 mg/kg SSL-0024 的剂量是基于我们先前对氯硝柳胺磷酸盐前药的研究，该研究在相当的分子量等效下显示出强烈的肿瘤抑制作用。与对照相比，SSL-0024 使肿瘤体积减小 59.5%，而 NEN 使肿瘤体积减小 43.7%。尽管 SSL-0024 与 NEN 之间的差异未达到统计学显著性，但 SSL-0024 显示出更强肿瘤生长抑制的趋势。值得注意的是，这一效果是在较低分子量等效氯硝柳胺（约为 NEN 组的 45.8%）下实现的。
对 PDX 肿瘤和肝脏中氯硝柳胺浓度的分析显示，与 NEN 相比，SSL-0024 的累积量显著更高。NEN 治疗组小鼠正常邻近肝脏中的氯硝柳胺水平约为 PDX 组织的 1.7 倍，而 SSL-0024 治疗组小鼠 PDX 肿瘤中的氯硝柳胺水平约为正常肝脏的 1.2 倍，表明具有优先肿瘤蓄积特性。此外，SSL-0024 给药后正常肝脏中的氯硝柳胺水平约为 NEN 组的 6 倍，进一步支持其增强的生物利用度和组织分布。我们还评估了肺组织中的氯硝柳胺分布，以确定肺毒性。肺部的氯硝柳胺暴露显著低于肝脏，SSL-0024 给药后约为肝脏水平的 0.48 倍，NEN 治疗后约为 0.34 倍。在分子水平上，SSL-0024 对 Ki-67 表达的抑制作用强于 NEN，表明其抗增殖活性增强，而两种化合物都诱导了可比的 cleaved caspase-3 增加，表明具有相似的促凋亡作用。总体而言，这些结果表明 SSL-0024 不仅提高了生物利用度和肿瘤靶向蓄积，还以良好的安全性实现了强效的肿瘤生长抑制，凸显了其强大的转化潜力。
整个治疗期间的体重测量显示，与对照组和 NEN 治疗组相比，SSL-0024 治疗组没有出现显著的体重减轻，表明其总体安全性良好。此前有报道称，200 mg/kg q.d. 的 NEN 因降解产物（包括乙醇胺）会诱导肺泡毒性；我们一致地观察到了 NEN 引起的肺部病理变化，但 SSL-0024 治疗组未见此现象。血液参数、肝肾功能和脂质代谢的生化分析表明，与对照组相比，SSL-0024 治疗显著增加了白细胞、中性粒细胞计数、碱性磷酸酶，并改变了脂质谱（胆固醇、HDL、LDL），而红细胞参数或肝酶 AST 无显著变化。NEN 治疗对 MCV、MCH、单核细胞百分比、AST 和碱性磷酸酶有适度影响。两种化合物均维持正常的红细胞形态和整体血液学稳态，表明在测试剂量下具有可耐受的全身效应。
SSL-0024 通过抑制 AKT–mTOR–STAT3、RAF 和 Wnt 信号通路调控 HCC 生长
为了阐明 SSL-0024 介导的 HCC 生长抑制机制，我们重点关注 AKT–mTOR–STAT3 信号轴，这是先前报道的受氯硝柳胺调控的关键通路。蛋白水平标准化为对照，并评估了 SSL-0024 和 NEN 组的相对变化。
SSL-0024 处理显著抑制了关键信号蛋白的磷酸化，包括 p-STAT3、p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1 和 p-p70S6K。总 STAT3 和总 AKT 也被 SSL-0024 显著降低，而 mTOR 与对照相比无统计学显著差异，表明 SSL-0024 主要抑制这些蛋白的活性磷酸化形式。相比之下，NEN 处理导致 STAT3 适度降低，而 BCL-XL 在 NEN 组中显著降低，但在 SSL-0024 处理的肿瘤中未发生变化。Cyclin D1，一种关键的增殖下游调控因子，在 SSL-0024 和 NEN 处理下均显著降低。
SSL-0024 处理显著降低了总 A-Raf、总 B-Raf 和总 C-Raf 以及磷酸化 C-Raf 的表达，而磷酸化 B-Raf 无统计学显著变化。这些结果表明 SSL-0024 有效抑制 RAF 信号传导，主要通过抑制 C-Raf 激活，它是 HCC 中上游 MAPK 信号传导的关键驱动因子。相比之下，NEN 处理对 A-Raf、B-Raf 或磷酸化 B-Raf 无统计学显著影响，而其他蛋白包括 C-Raf 和磷酸化 C-Raf 显著降低。作为 AKT 和 RAS 信号级联激活因子的 EGFR，在 SSL-0024 和 NEN 处理下均显著降低。
Wnt 信号通路的两个关键组分 LRP6 和 β-catenin 在 SSL-0024 和 NEN 处理下均显著下调。
总体而言，这些结果表明 SSL-0024 通过抑制多个关键信号通路来抑制 HCC 生长，并且与 NEN 相比，它对大多数磷酸化蛋白实现了更强的抑制作用，这与其增强的体内抗肿瘤效应相关。
SSL-0024 通过抑制 VASN 和 PD-L1 蛋白表达调控 HCC 生长
与之前使用氯硝柳胺磷酸盐前药的研究一致，我们观察到 SSL-0024 强烈抑制 VASN 和 PD-L1 表达。为了评估 VASN 的上游调控，我们测量了 ADAM17，即负责 VASN 切割并随后激活 TGFβ 信号传导的金属蛋白酶。SSL-0024 处理降低了 ADAM17 水平，表明 VASN 分泌减少，并抑制了 TGFβ 介导的促肿瘤信号传导。
除了已验证的致癌信号通路变化外，我们还显示 SSL-0024 还通过新靶点 VASN 及其相关蛋白以及 PD-L1 发挥作用，支持其多靶点机制和优越的抗肿瘤潜力。
讨论
通过理性设计并系统筛选八种新型氯硝柳胺前药候选物，我们确定了一种先导前药 SSL-0024（氯硝柳胺-O-硫酸铵盐），其显示出良好的水溶性、pH 稳定性、改善的药代动力学特征/口服生物利用度以及体外和体内抗肿瘤疗效。特别地，SSL-0024 在单次给药后可实现超过 24 小时的持续全身暴露，而原始氯硝柳胺的血浆半衰期平均为 4 至 5 小时。这种延长的半衰期增强了生物利用度，使得稳定水平的活性母体药物能够到达肿瘤；因此，我们观察到，在仅需 NEN 剂量约 45.8% 的情况下即可实现有效的肿瘤抑制，且未检测到全身毒性。通过降低所需剂量同时保持疗效，SSL-0024 展现了显著改善的治疗指数，支持每日一次口服给药，并凸显了其在 HCC 患者中临床应用的潜力。这一药代动力学改善直接解决了历史上限制氯硝柳胺临床转化的障碍，并可能实现对 HCC 生长和存活至关重要的多种致癌通路的持续抑制。
肝细胞中的芳基硫酸酯酶预计会切割 SSL-0024 释放游离氯硝柳胺。我们观察到硫酸铵盐前药在胃液和血浆 pH 条件下的稳定性、在 48 小时内游离氯硝柳胺向血浆的稳定释放，以及游离氯硝柳胺在肝脏和 PDX 组织中的蓄积。释放时同时释放的硫酸铵反离子被美国食品药品监督管理局标记为“公认安全”，是一种常用的食品添加剂，一般人类食用安全。拥有安全的反离子是前药设计中反离子选择的重要标准，这也是本研究实现的。相比之下，NEN 解离为游离氯硝柳胺和乙醇胺，乙醇胺是一种已知的肺刺激物，可能导致了我们在 NEN 治疗中观察到的肺肺泡病理变化。而 SSL-0024 治疗未出现 NEN 给药时观察到的肺毒性。因此，SSL-0024 比 NEN 更有效且毒性更小，且 NEN 尚未获 FDA 批准用于人体。
在机制上，我们确认 SSL-0024 抑制了 HCC 进展中至关重要的汇聚性致癌信号网络，与其母体药物氯硝柳胺的报告作用一致。我们观察到 mTOR–AKT–STAT3 轴的协调抑制，表现为 AKT、mTOR、4EBP1、p70S6K 和 STAT3 的磷酸化减少，以及 Cyclin D1、BCL2 和 BCL-XL 的下调。同时，RAF 亚型的减弱表明生长因子驱动的有丝分裂信号传导受到干扰。通过同时抑制 mTOR–AKT–STAT3 和 RAF–MEK–ERK 级联，SSL-0024 可能会阻止常导致单一疗法耐药的代偿性信号传导。这种网络水平的抑制具有临床相关性，因为索拉非尼等多激酶抑制剂依赖于类似通路，而耐药性常通过适应性 PI3K–AKT 或 RAF–MEK–ERK 激活而产生。持续的 STAT3 抑制尤其重要，因为它在肝癌中具有促进增殖、存活和免疫逃避的作用。同时多通路抑制可能限制常观察到的单靶点疗法出现的适应性耐药，为 HCC 中更持久的肿瘤控制提供了理论基础。
SSL-0024 将 LRP6 表达降低至与 NEN 相当的程度；然而，β-catenin 的抑制在 SSL-0024 处理后更为明显。由于 β-catenin 是 LRP6 介导的 Wnt 信号的关键下游效应器，并驱动增殖相关基因的转录，β-catenin 不成比例的减少提示 SSL-0024 可能通过超越受体水平抑制的机制来调节 β-catenin 的稳定性或活性。这些发现表明，经典 Wnt/β-catenin 信号传导的增强衰减可能至少部分地促成了 SSL-0024 卓越的抗增殖效应。在我们之前对氯硝柳胺磷酸盐前药的研究中，VASN 敲低模拟了药物治疗效果，而 VASN 拯救实验减弱了抗肿瘤效应，确立了 VASN 作为氯硝柳胺衍生活性的功能性介质。与此机制一致，SSL-0024 同样降低了 VASN 表达，这可能是通过释放游离氯硝柳胺实现的。总之，这些发现表明 SSL-0024 保留了先前验证的 VASN 依赖性信号轴，并且我们的理性结构修饰并未损害机制靶向，增强了对其抗肿瘤活性的信心。
除了肿瘤内在信号传导外，SSL-0024 还降低了 PD-L1 表达，PD-L1 是 HCC 中免疫逃逸的核心介质，也是临床可靶向的靶点。虽然 SSL-0024 下调 PD-L1 的确切调控机制尚待确定，一个可能的贡献机制是抑制 STAT3 信号传导，STAT3 是多种癌症（如肺癌、自然杀伤/T细胞淋巴瘤、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌和 HCC）中 PD-L1 的已知转录调控因子。这种对增殖和免疫逃避通路的双重抑制表明，SSL-0024 与免疫检查点抑制剂联合使用时可能产生相加或协同效应。未来的研究应评估 SSL-0024 与免疫检查点抑制剂或激酶抑制剂的联合使用，以探索潜在的协同疗效。其调节肿瘤生长和免疫逃避的能力凸显了与当前标准治疗方案进行合理联合策略的潜力。
从转化角度看，SSL-0024 还具有一个额外优势，即从易获得的化学前体进行一步简单合成，有利于规模化生产并可能降低成本。与现有疗法（包括索拉非尼、仑伐替尼或阿替利珠单抗等检查点抑制剂）相比，SSL-0024 在单一口服可用药物中结合了多通路肿瘤抑制与潜在的免疫调节。再加上延长的全身暴露、降低的有效剂量和最小的毒性，这些特性使 SSL-0024 成为药理学上优化的衍生物，相比早期的氯硝柳胺制剂具有更优的药物特性。
本研究存在若干局限性需要考虑。首先，虽然观察到 SSL-0024 抑制关键信号通路，但未进行正式的药代动力学-药效学相关性分析，这将加强全身暴露与靶点抑制之间的机制联系。其次，虽然观察到 PD-L1 降低，但肿瘤免疫微环境的全面表征和免疫细胞浸润的评估超出了本研究的范围。第三，与已批准的 HCC 疗法（包括索拉非尼、仑伐替尼或免疫检查点抑制剂）的联合疗效仍有待评估。第四，确定最大耐受剂量和治疗窗口的剂量递增研究（特别是在原位 PDX 模型中）将提供有价值的转化见解。最后，对其他潜在相关信号网络（如胰岛素样生长因子调控）的进一步研究可能会发现更多治疗协同的机会。
结论
总之，SSL-0024 展示了理性的前药优化如何将一个经过生物学验证但临床不实用的化合物转化为实体瘤治疗中具有治疗潜力的候选药物。增强且持续的全身暴露，加上协调的致癌通路抑制，表明 SSL-0024 作为易于转化的氯硝柳胺前药在 HCC 治疗中具有巨大潜力。我们的研究结果为更深入的机制探索、联合治疗研究以及向临床应用的转化开发奠定了坚实基础，为基于氯硝柳胺的 HCC 治疗策略提供了一条令人信服的前进道路。
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