摘要：流行病学研究中报道的阿尔茨海默病（AD）与癌症之间的反向关联仍知之甚少。将5月龄雌雄5xFAD转基因AD小鼠及其野生型（WT）同窝对照，分别注射黑色素瘤B16F0细胞或溶剂，随后28天内监测肿瘤生长，并通过Y迷宫和绿洲迷宫评估认知表现。接种黑色素瘤的5xFAD小鼠（5xFAD/B16F0）与5xFAD/盐水组相比表现出认知改善，且与肿瘤发展无关，提示可能由全身免疫调节而非肿瘤生长的直接作用所致。5xFAD/B16F0小鼠的肿瘤发生率也低于WT小鼠，且脾脏髓系细胞数量增加。尽管β-淀粉样蛋白水平以及星形胶质细胞和小胶质细胞数量未变，但5xFAD/B16F0小鼠海马小胶质细胞胞体面积减小，提示向低反应性小胶质细胞形态转变。综合而言，这些结果表明与黑色素瘤接种相关的外周免疫变化可能影响小胶质细胞形态，为AD与癌症反向关联的潜在机制提供了初步见解。
引言
阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆病因，与年龄高度相关，预计在未来几十年内将显著增加。AD是一种进行性神经退行性疾病，临床特征为认知功能逐渐丧失，导致患者严重的功能障碍和依赖性，并给其家庭带来巨大负担。神经病理学上，AD以β-淀粉样蛋白（Aβ）肽在细胞外沉积和过度磷酸化tau蛋白在细胞内积聚为特征，伴有突触和神经元丢失，并与炎症和免疫反应相关。AD的病理生理机制尚不清楚，但最广泛接受的假说认为初始事件是Aβ沉积，进而触发一系列级联事件：免疫反应、氧化应激、过度磷酸化tau沉积、突触丢失，最终导致细胞死亡。虽然经典AD病理学聚焦于Aβ和tau，但神经炎症越来越被认为是疾病发病和进展的关键组成部分。目前尚无有效的AD治愈方法，尽管最近获批的抗淀粉样蛋白抗体疾病修饰疗法已成功清除脑内淀粉样蛋白，但认知衰退减缓有限且副作用显著。然而，AD的治疗可能需要针对多种过程的联合靶向方法才能获得实质性益处。
在一些流行病学研究中，我们和其他作者报告了AD与癌症之间的反向关联，表明癌症幸存者发生AD的风险较低，反之亦然，患有AD可防止癌症的发展，尽管并非所有研究均如此。这种相互保护已在大多数癌症类型中观察到，包括皮肤癌（基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤）。有人提出，可能是一种共同的生物学机制（以相反方向失调）解释这种相互保护。我们先前证明，AD患者的外周血单个核细胞显示出严重程度依赖性的氧化性细胞死亡易感性增加，而皮肤癌幸存者的细胞则表现出对细胞死亡的抵抗性增强，与年龄和性别匹配的健康对照组相比。此外，同时患有这两种疾病的患者（即有癌症病史后发展为遗忘型轻度认知障碍（aMCI））的细胞死亡易感性更接近癌症幸存者，有趣的是，其认知衰退速度比无癌症病史的aMCI患者更慢。尽管有这些观察，但这些差异背后的生物学机制仍了解甚少，凸显了进一步研究以阐明癌症病史与认知衰退之间可能联系的必要性。
在此，我们给5月龄5xFAD小鼠（一种AD转基因小鼠模型）接种黑色素瘤（B16F0）细胞，以模拟人类的肿瘤负荷状态，研究AD与癌症之间的反向关联。接种黑色素瘤细胞的5xFAD小鼠与溶剂注射组相比，空间工作记忆表现显著恢复。这一结果伴随着5xFAD小鼠在黑色素瘤细胞注射后可检测肿瘤的百分比相对于野生型（WT）小鼠降低，表明保护是双向的。有趣的是，认知行为的改善在发展为肿瘤和未发展为肿瘤的5xFAD接种小鼠中均观察到，表明肿瘤生长并非必需，且该效应可能是全身性的。相应地，5xFAD小鼠脾脏免疫细胞分析显示髓系细胞比例轻度增加，提示全身性免疫反应可能参与了一种疾病保护而另一种疾病促进的机制。黑色素瘤接种的5xFAD小鼠的行为改善并未伴随海马或皮层总体Aβ负荷的显著变化，也未伴随小胶质细胞或星形胶质细胞数量的变化。然而，小胶质细胞胞体面积显著减小。综合来看，这些结果表明黑色素瘤细胞注射伴随5xFAD小鼠认知能力的显著改善。为初步理解这种有益效应的机制，我们发现黑色素瘤注射到5xFAD小鼠中伴随脾脏髓系细胞的变化和小胶质细胞胞体面积的减小。我们提出，黑色素瘤细胞接种触发全身免疫激活，诱导小胶质细胞形态向大脑中较低反应性表型转变，这可能解释了5xFAD AD小鼠模型中空间和工作记忆的有益效应。
结果
B16F0细胞接种减轻5xFAD小鼠的认知缺陷
5月龄雌雄5xFAD小鼠及其WT同窝对照接受皮下注射4000个B16F0黑色素瘤细胞（溶于100µL盐水）或仅注射盐水（溶剂）作为对照，监测肿瘤生长28天。行为测试于接种后第15至28天进行，随后处死小鼠（实验时间线见图1A）。
使用Y迷宫和绿洲迷宫评估外周接种B16F0细胞对5xFAD转基因小鼠海马依赖性空间记忆的影响。在评估自发交替和探索新奇行为倾向的Y迷宫中，小鼠首先进行10分钟的训练阶段，仅允许进入臂a和b。1小时（试次间隔）后，小鼠可探索所有三个臂（a、b和新奇臂c）5分钟，以评估其对新奇臂c的探索行为（图1B）。组间比较未显示进入新奇臂c的相对次数有显著差异（图1C），进入臂a和b的次数也无显著差异（补充图1）。当单独分析每组时，WT/溶剂对照组，如该模型预期，表现出对新奇臂c的偏好，进入该臂的次数（平均38.96±6.29 SD）显著高于熟悉臂b（平均29.63±2.85 SD，p=0.031）（图1D）。类似地，WT/B16F0组也表现出对新奇臂c的偏好（平均43.66±5.38 SD），与臂a（平均31.05；p=0.0004）和臂b（平均25.29；p<0.0001）相比均有显著差异（图1E）。相比之下，5xFAD/溶剂组表现出空间工作记忆的破坏，特征为对新奇臂无显著偏好（进入臂c的平均次数为33.48±9.52 SD，与臂a的40.91±10.95和臂b的25.62±4.52无统计差异）（图1F）。值得注意的是，注射B16F0的5xFAD组显示出对新奇臂的显著偏好（进入臂c的平均次数39.60±3.60 SD，与臂a 29.86；p=0.0143和臂b 30.54；p=0.0223相比）（图1G），表明B16F0接种诱导了空间识别记忆的恢复。所有Y迷宫参数的比较总结表包括描述性统计和效应量估计（补充表2-5）。测量在每个臂中停留的时间时也观察到类似结果，但差异未达到统计学显著水平（补充图2）。
接下来，我们评估了绿洲迷宫任务中的空间学习，这是一个海马依赖性记忆测试，小鼠被训练使用视觉线索在21孔平台中搜索奖励井（水）（图1H）。在0小时阶段，WT和5xFAD小鼠注射B16F0或溶剂后在绿洲迷宫中的代表性导航路径如图1I-L所示。在这些图中，蓝线表示小鼠轨迹，红线表示到达奖励的最短路径（最优轨迹），星号表示奖励位置。WT/溶剂小鼠（图1I）和WT/B16F0小鼠（图1J）表现出高效导航，沿着接近最优轨迹的路径到达奖励。相比之下，5xFAD/溶剂小鼠（图1K）表现受损，以紊乱的轨迹为特征，未能到达奖励。值得注意的是，接种B16F0细胞的5xFAD小鼠（图1L）导航改善，轨迹与WT组相似，表明空间学习和记忆部分恢复。在0小时阶段，5xFAD/溶剂小鼠在所有结果测量中均表现出降低的表现：如图1M所示，5xFAD/溶剂组的命中率（平均0.25±0.10 SD）显著低于WT/溶剂对照组（平均0.80±0.21 SD；p<0.0001），相当于降低69%。值得注意的是，接种B16F0细胞的5xFAD小鼠的命中率（平均0.77±0.16 SD）与WT/溶剂对照组无差异，且显著高于5xFAD/溶剂组（命中率平均差=0.52，p<0.0001）。命中率的双因素方差分析显示基因型的主效应显著（F1,22=9.034，p=0.0065，ηp²=0.29）和处理的主效应显著（F1,22=16.10，p=0.0006，ηp²=0.42）。两种效应均具有大效应量。重要的是，还检测到显著的基因型×处理交互作用（F1,22=8.299, p=0.0087, ηp² = 0.27），表明B16F0处理对命中率的影响因基因型而异。此外，如图1N所示，5xFAD/溶剂小鼠到达目标的潜伏期显著增加（平均49.45±6.93 SD；相比WT/溶剂的25.36±10.78 SD，增加了195%，p=0.0012），而5xFAD/B16F0组的潜伏期有所减少（40.99±11.71 SD，但与5xFAD/溶剂组无显著差异，且仍显著高于WT/溶剂组（p=0.0401）。双因素方差分析显示处理的主效应显著（F₁,₂₀=20.19, p=0.0002, ηp²=0.50），但基因型（F₁,₂₀=0.1475, p=0.7050, ηp²=0.007）和基因型×处理交互作用（F₁,₂₀=3.391, p=0.0804, ηp²=0.145）不显著，表明在本实验条件下处理对潜伏期的影响并非强烈依赖基因型。在测量观测距离与最优距离的比值（距离比，图1O）时，5xFAD/溶剂组的比值显著升高（平均21.16±8.57），相比WT/溶剂（平均7.93±2.62，p=0.0031）增加了267%。而5xFAD/B16F0组的距离比（平均12.22±2.71）相比5xFAD/溶剂组降低了54%（p=0.0413），恢复到与WT/溶剂相当的水平（p=0.555）。双因素方差分析显示处理（F₁,₁₉=8.988, p=0.0074, ηp²=0.32）以及基因型×处理交互作用（F₁,₁₉=8.642, p=0.0084, ηp²=0.31）的主效应显著，而基因型的主效应不显著（F₁,₁₉=1.148, p=0.2973, ηp²=0.057），表明B16F0选择性地改善了5xFAD小鼠的导航效率，而对WT动物无影响。最后，在总移动距离（图1P）上观察到相似的模式：5xFAD/溶剂小鼠总移动距离显著增加（平均1013±277 SD），相比WT/溶剂（平均585.9±178.5 SD，p=0.0047）增加了73%。这种增加在5xFAD/B16F0小鼠中显著减弱（平均667.2±154.2，与5xFAD/溶剂相比p=0.024），恢复到与WT/溶剂无显著差异的水平。双因素方差分析显示处理（F₁,₂₀=8.700, p=0.0079, ηp²=0.3）和基因型×处理交互作用（F₁,₂₀=6.486, p=0.0192, ηp²=0.25）的主效应显著，而基因型未达到统计学显著性（F₁,₂₀=3.618, p=0.0717, ηp²=0.15）。值得注意的是，各组间的运动速度相当（补充图3），排除了肿瘤生长或B16F0细胞接种可能产生的运动缺陷作为混杂因素，表明处理对总距离的影响反映了探索效率的变化而非运动能力的变化。此外，在WT小鼠中注射B16F0后（WT/溶剂与WT/B16F0组比较），所有参数均未观察到显著差异，表明B16F0接种不会损害野生型小鼠的认知功能（图1M-P）。长期记忆阶段（训练后72小时）的表现趋势相似，但5xFAD/B16F0的改善未达到统计学显著性（补充图4）。总体而言，双因素方差分析显示，B16F0细胞处理显著调节了多个行为参数，包括命中率、到达目标的潜伏期、路径效率（距离比）和总移动距离。在大多数指标中，5xFAD/溶剂小鼠表现差于WT对照，而B16F0处理选择性地减轻了5xFAD小鼠的这些改变，通常使其表现正常化至WT/溶剂水平。这些效应主要受处理的主效应和基因型×处理交互作用驱动，基因型本身在各参数上的主效应有限或不显著。综上，这些发现表明5xFAD小鼠观察到的行为表型强烈受处理依赖性机制而非仅基因型的影响，提示外周接种B16F0黑色素瘤细胞与5xFAD小鼠海马依赖性工作记忆和空间记忆的改善相关。Y迷宫和绿洲迷宫表现的比较总结表包括统计分析和效应量估计（补充表6-10）。雄性和雌性动物均包含在内，以不同符号表示（圆圈=雄性，三角形=雌性）。我们未发现雄性和雌性小鼠在行为测试表现上有明显差异，无论是在5xFAD还是WT小鼠中，但每组动物数量有限，无法进行单独的统计分析。
B16F0黑色素瘤细胞接种调节5xFAD小鼠的肿瘤易感性和外周免疫反应
鉴于流行病学研究表明AD与癌症发生率降低相关，我们旨在评估注射B16F0的5xFAD小鼠与注射B16F0的WT小鼠的肿瘤发展情况。评估了两组独立的动物。第一组用于评估B16F0细胞接种后肿瘤发展和一个月存活率。第二组用于行为和生化实验（见补充表1和方法部分中的协议细节）。在5xFAD和WT小鼠注射B16F0或溶剂后评估肿瘤易感性（图2A）。与WT动物相比，5xFAD小鼠发展出肿瘤的比例显著更低（47.4% vs. 84.2%；p=0.017，图2A）。重要的是，当根据肿瘤存在情况对5xFAD/B16F0组进行分层时，荷瘤和非荷瘤小鼠在绿洲迷宫命中率上均表现出相似的改善（图2B）。这些发现表明认知改善并不依赖于肿瘤形成本身，而可能源于接种引发的早期免疫调节。此外，与WT小鼠相比，5xFAD小鼠在随访第20天和第28天的肿瘤生长显著减少（图2C）。
鉴于外周免疫系统可能在AD发展中发挥作用，我们评估了B16F0接种诱导的体液和细胞免疫反应。黑色素瘤血清抗体水平在WT或5xFAD小鼠接种B16F0后均无差异（图2D和E）。然而，先前描述B16F0黑色素瘤免疫原性较差的报道与我们的发现一致。对脾脏免疫细胞群体的检查显示，与WT/溶剂组相比，WT小鼠接种B16F0后树突状细胞、B淋巴细胞和髓系细胞数量呈非显著增加趋势（图2F、H和J）。在5xFAD小鼠中，B16F0接种未显著改变树突状细胞或B淋巴细胞（图2G和I），但与5xFAD/溶剂动物相比，髓系细胞数量显著增加（图2K）。然而，由于样本量有限（n=3），该观察的生物学意义尚不确定。这些结果表明，黑色素瘤细胞接种与5xFAD小鼠中由髓系细胞反应增强驱动的外周免疫激活相关。树突状细胞和B淋巴细胞群体的变化不显著。虽然不能建立因果关系，但这些免疫变化可能有助于在该AD模型中观察到的认知功能改善趋势。通过细胞因子微球阵列（CBA）检测的血浆细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-2和IL-17水平均无显著变化（补充图5A-E）。
黑色素瘤细胞接种诱导5xFAD小鼠海马小胶质细胞向低反应性表型转变
为了探讨外周黑色素瘤细胞接种是否影响5xFAD小鼠的神经炎症标志物，我们使用GFAP（图3A-G）和Iba1（图3H-N）免疫荧光分析了海马亚区的星形胶质细胞和小胶质细胞。在CA3区，5xFAD/溶剂小鼠GFAP免疫阳性面积百分比相比WT/溶剂小鼠显著增加（图3D，p=0.0406）。双因素方差分析显示基因型×处理交互作用的主效应显著（F₁,₁₁=6.171, p=0.0304, ηp²=0.36），而处理（F₁,₁₁=4.477, p=0.0580, ηp²=0.29）和基因型（F₁,₁₁=0.0553, p=0.8185, ηp²=0.005）的主效应不显著。星形胶质细胞胞体数量未观察到显著差异（图3G）。其他海马亚区在阳性面积百分比和细胞数量上均无变化（图3B、C、E、F）。值得注意的是，B16F0/5xFAD小鼠在任何海马亚区的GFAP阳性染色（图3B-D）和星形胶质细胞数量（图3E-G）上均未显示显著变化，表明在该模型中黑色素瘤细胞暴露不调节星形胶质细胞反应性。
小胶质细胞及巨噬细胞的Iba1染色显示，WT小鼠接种B16F0诱导海马三个亚区（DG、CA1和CA3）的小胶质细胞阳性面积显著增加，而该效应在接种B16F0的5xFAD小鼠中缺失（图3I-K）。在DG区，WT/B16F0小鼠的Iba1阳性面积显著大于WT/溶剂对照组（p=0.0032）和5xFAD/溶剂小鼠（p=0.0014），而5xFAD/B16F0与5xFAD/溶剂组之间未检测到差异（p=0.2018）。类似地，在CA1区，WT/B16F0小鼠相比WT/溶剂（p=0.0038）、5xFAD/溶剂（p=0.0103）和5xFAD/B16F0小鼠（p=0.0164）均有显著增加，而5xFAD/溶剂与5xFAD/B16F0组之间未观察到差异（p=0.9898）。在CA3区，WT/B16F0小鼠的小胶质细胞阳性面积相比WT/溶剂、5xFAD/溶剂和5xFAD/B16F0组均显著升高（p<0.0001），而5xFAD/溶剂与5xFAD/B16F0小鼠之间无显著差异（p=0.9995）。双因素方差分析显示：DG区处理（F₁,₁₁=5.461, p=0.0394, ηp²=0.00006）和基因型（F₁,₁₁=22.53, p=0.0006, ηp²=0.13）主效应显著，基因型×处理交互作用不显著（F₁,₁₁=2.603, p=0.1349, ηp²=0.07）。CA1区，基因型×处理交互作用（F₁,₉=9.782, p=0.0122, ηp²=0.52）和基因型（F₁,₉=12.74, p=0.0060, ηp²=0.59）主效应显著，处理主效应未达到显著性（F₁,₉=4.668, p=0.0590, ηp²=0.34）。CA3区，双因素方差分析显示基因型（F₁,₉=50.62, p<0.0001, ηp²=0.10）和处理（F₁,₉=124.5, p<0.0001, ηp²=0.20）的主效应显著，以及强烈的基因型×处理交互作用（F₁,₉=48.58, p<0.0001, ηp²=0.05）。尽管小胶质细胞阳性面积和星形胶质细胞数量有这些变化，但在任何海马亚区中小胶质细胞数量均无显著变化（图3L-N）。总之，双因素方差分析表明，对周围黑色素瘤接种的胶质细胞反应具有区域和基因型依赖性。星形胶质细胞反应性受影响最小，仅在CA3区存在基因型×处理交互作用，而WT小鼠小胶质细胞Iba1阳性面积受到处理的强烈调节，但5xFAD小鼠中无此变化，且胶质细胞密度不变。
我们对Iba-1+细胞进行了进一步分析，以量化胞体面积和圆形度，如图4A-F所示。特别是，5xFAD/溶剂组在所有海马亚区中Iba-1胞体面积均显著增加（图4A-C），尽管观察到高度异质性的群体（补充表11-17）；5xFAD/溶剂小鼠的胞体平均面积在DG区是WT/溶剂对照组的1.75倍（117.4±61.68 um² 对比 67.2±30.12，mean±SD）；在CA1区为1.84倍（113.8±69.76 um² 对比 61.89±28.28）；在CA3区为1.23倍（87.56±48.08 对比 71.21±42.95）。注射B16F0的5xFAD小鼠在所有亚区中均持续减轻了这种胞体面积的增加：在DG区，5xFAD/B16F0的胞体面积（84.98±45.13 um²）是WT/溶剂的1.26倍；在CA1区（5xFAD/B16F0平均82.03±48.50 um²）为1.33倍；在CA3区（5xFAD/B16F0平均68.37±33.41 um²）为0.96倍（补充表11-13）。双因素方差分析显示，在所有亚区中基因型和处理的主效应以及强烈的基因型×处理交互作用均显著（DG：基因型F₁,₁₇₁₉=61.44, p<0.0001, ηp²=0.034；处理F₁,₁₇₁₉=272.3, p<0.0001, ηp²=0.14；交互F₁,₁₇₁₉=63.36, p<0.0001, ηp²=0.04；CA1：基因型F₁,₁₈₂₂=33.79, p<0.0001, ηp²=0.02；处理F₁,₁₈₂₂=222.0, p<0.0001, η²=0.011；交互F₁,₁₈₂₂=72.59, p<0.0001, ηp²=0.04；CA3：基因型F₁,₄₈₆₉=21.60, p<0.0001, η²=0.0044；处理F₁,₄₈₆₉=8.893, p=0.0029, ηp²=0.002；交互F₁,₄₈₆₉=43.64, p<0.0001, ηp²=0.009）。总之，B16F0处理降低了与5xFAD基因型相关的所有海马亚区中小胶质细胞胞体面积的增加，仅在CA3区将其恢复至WT/溶剂对照组水平。
胞体圆形度的形态学结果具有区域特异性，如图4D-F所示，各组之间存在多种统计学显著差异，但平均差异较小且群体高度异质性（补充表14-17）。双因素方差分析显示，在DG区处理效应显著（F₁,₁₈₅₅=57.07, p<0.0001, ηp²=0.03）以及基因型×处理交互作用显著（F₁,₁₈₅₅=59.97, p<0.0001, ηp²=0.03），基因型主效应不显著（F₁,₁₈₅₅=0.1598, p=0.6894, ηp²=0.00008）。在CA1区，处理对胞体圆形度有显著效应（F₁,₁₈₈₆=16.47, p<0.0001, ηp²=0.0086），而基因型（F₁,₁₈₈₆=2.365, p=0.1242, ηp²=0.0012）和基因型×处理交互作用（F₁,₁₈₈=0.1242, ηp²=0.0012）及交互作用（F₁,₁₈₈₆=0.073, p=0.7868, ηp²=0.00004）均未达统计显著水平。相反，在CA3区，双因素方差分析显示基因型主效应显著（F₁,₁₈₄₀=68.73, p<0.0001, ηp²=0.0036）和基因型×处理交互作用显著（F₁,₁₈₄₀=50.23, p<0.0001, ηp²=0.027），而处理主效应不显著（F₁,₁₈₄₀=0.3701, p=0.5430, ηp²=0.0002）。5xFAD/溶剂组的CA3区显示最低的圆形度（平均0.5167±0.1505，是WT/溶剂平均0.56±0.15的0.92倍）。相反，5xFAD/B16F0组表现出显著恢复（平均圆形度0.6254±0.1497，是WT/溶剂的1.11倍），再次指向CA3区更明显的形态转化。总体而言，这些发现表明小胶质细胞胞体圆形度存在细微的区域特异性改变，而非统一或强烈的形态转变。
这些区域特异性的形态学差异与B16F0暴露可能与5xFAD小鼠小胶质细胞形态的基因型依赖性调节相关的可能性一致。在神经退行性背景下，这种细微变化可能反映了小胶质细胞可塑性的改变，并可能与观察到的认知改善相关。
黑色素瘤细胞接种未伴随5xFAD小鼠大脑淀粉样蛋白负荷的改变
在注射B16F0细胞或溶剂28天后，测定了5xFAD小鼠皮层和海马中的淀粉样蛋白斑块负荷。由4G8阳性免疫染色百分比确定（图5A-D）以及通过ThS染色确定的Aβ负荷和斑块大小（图5E, F）显示，与5xFAD/溶剂小鼠相比，5xFAD/B16F0小鼠皮层或海马的淀粉样蛋白负荷未见差异。WT小鼠未见Aβ沉积（补充图6）。
5xFAD小鼠海马和皮层中CXCL10而非IFN-γ mRNA水平升高，B16F0接种后无变化
为了探究5xFAD小鼠接种B16F0黑色素瘤细胞后认知改善的潜在分子机制，我们评估了干扰素-γ（IFN-γ）和IFN-γ诱导型趋化因子CXCL10的表达，后者参与免疫细胞向中枢神经系统的募集。已有报道AD患者脑脊液、血浆和前额叶皮层中CXCL10水平升高，并与认知衰退呈负相关。我们评估了WT和5xFAD小鼠（无论是否接种B16F0）海马和皮层中Cxcl10 mRNA水平（图6A-D）。在海马中，5xFAD/溶剂小鼠的Cxcl10 mRNA转录本显著高于WT/溶剂（p=0.0205）和WT/B16F0（p=0.005）（图6B）。接种B16F0细胞未导致5xFAD小鼠海马Cxcl10 mRNA转录本发生统计学显著变化（WT/溶剂 vs. 5xFAD/B16F0 p=0.4080；WT/溶剂 vs. 5xFAD/B16F0 p=0.1710）。双因素方差分析一致显示处理主效应显著（F₁,₁₉=14.71, p=0.0011, ηp²=0.46），但基因型（F₁,₁₉=2.359, p=0.1410, ηp²=0.11）和基因型×处理交互作用（F₁,₁₉=0.7344, p=0.4021, ηp²=0.037）不显著，表明海马Cxcl10的调节并非特异性地由5xFAD小鼠中的B16F0暴露调节。
在皮层中，5xFAD/溶剂小鼠与WT/溶剂（p=0.0404）和WT/B16F0（p=0.0092）相比，CXCL10 mRNA水平显著升高。5xFAD/B16F0小鼠与WT/B16F0相比，Cxcl10 mRNA转录本有统计学显著变化（p=0.0287）（图6D）。双因素方差分析显示处理主效应显著（F₁,₁₉=17.93, p=0.0004, ηp²=0.49），而基因型（F₁,₁₉=0.5593, p=0.4637, ηp²=0.03）和基因型×处理交互作用（F₁,₁₉=0.5593, p=0.4637, ηp²=0.00002）未达统计显著性，表明皮层CXCL10表达主要受处理而非基因型特异性相互作用调节。两种脑区的IFN-γ mRNA水平均无差异（图6A和C），提示此背景下的CXCL10调节可能独立于经典的IFN-γ信号传导。这些结果显示，与WT对照相比，5xFAD小鼠海马和皮层中Cxcl10 mRNA表达均显著升高。外周B16F0黑色素瘤接种并未显著调节5xFAD基因型内的CXCL10表达，尽管处理总体效应很强，表明CXCL10上调在AD背景下基本维持。两种脑区IFN-γ表达无变化，提示该模型中CXCL10调节独立于持续的经典IFN-γ信号传导，或反映了在所分析的时间点未捕获到的瞬时上游信号。
讨论
AD与癌症之间相互保护的机制仍不清楚，且缺乏探究这种反向关联的分子和细胞机制的临床前模型。在本研究中，作为理解癌症与AD相互保护机制的第一步，我们探究了B16F0黑色素瘤细胞接种对5xFAD转基因小鼠（一个成熟的阿尔茨海默病模型）的影响。我们发现，在5xFAD小鼠中皮下接种B16F0黑色素瘤细胞与海马依赖性认知表现改善相关。这种行为挽救与脾脏髓系细胞增加相关，提示外周免疫激活可能参与了该有益效应。此外，在肿瘤易感性方面存在差异性反应，与WT对照相比，5xFAD小鼠表现出肿瘤发生率降低和肿瘤生长明显减缓。
5xFAD小鼠认知表现的改善似乎独立于肿瘤发展，荷瘤和非荷瘤小鼠在空间记忆任务中表现出可比的结果。这种模式表明，这些效应可能与黑色素瘤细胞暴露诱导的免疫变化相关，而非肿瘤进展本身。在神经炎症水平上，B16F0接种诱导海马三个亚区小胶质细胞胞体面积减小，而GFAP阳性染色不变。Aβ负荷无变化。这些发现提示外周免疫激活与中枢炎症信号传导之间可能存在联系，但无法建立因果关系。图7展示了结果的图形摘要。
接种黑色素瘤细胞的5xFAD小鼠在Y迷宫和绿洲迷宫任务中的工作记忆和空间记忆表现均有改善，证据为：（1）Y迷宫中进入新臂（c臂）的百分比更高，（2）命中率改善（0小时），（3）距离比降低，以及（4）绿洲迷宫测试中移动距离减少，均与5xFAD/溶剂组相比。这种对认知的有益效应与流行病学研究显示的癌症对AD发展的保护作用一致。特别地，我们已证明有癌症病史并出现早期遗忘型认知障碍的个体，其认知衰退速度比无癌症病史者慢。我们的肿瘤细胞注射后认知改善的结果，与一项使用致癌物氨基甲酸乙酯在5xFAD小鼠中诱导肺肿瘤的研究报道不同，后者观察到肿瘤发生率降低但行为无显著变化。行为结果的差异可能源于癌症诱导的性质和时间差异。化学致癌过程漫长且不可控，而我们研究中直接接种B16F0黑色素瘤细胞可能引发更急性和局部的肿瘤反应，进而可能引起不同的系统性或免疫介导效应，影响认知功能和AD相关病理。有证据表明黑色素瘤肿瘤可通过诱导系统性炎症和神经炎症反应改变OF1小鼠的抑郁样行为。结合我们的发现，这支持了系统性肿瘤可以调节大脑功能和行为的观点。
在我们的模型中，动物在5月龄时注射B16F0细胞，并在5.5至6月龄时评估认知行为。根据杰克逊实验室，5xFAD小鼠在6月龄时表现出认知障碍迹象，尽管其他研究表明学习表现受损出现在6-9月龄。由于我们未评估注射前（5月龄）的动物，故无法确定肿瘤注射赋予的认知有益效应是预防还是逆转了认知症状。有趣的是，最近一项研究表明，外周癌症通过胱抑素C依赖性激活小胶质细胞TREM2信号传导，增强淀粉样蛋白清除，从而改善认知并减轻淀粉样蛋白病理。作者将2.5×10^5个LLC（肺癌）、RM1（前列腺癌）和MC38（结肠腺癌）细胞注射到3月龄的5×FAD小鼠和5月龄的rTg4510小鼠中（表达突变型TauP301L）。重要的是，这些结果与我们的发现一致，显示了外周肿瘤通过小胶质细胞依赖性过程对认知的有益作用。
我们观察到，B16F0接种后发展出肿瘤的动物百分比在5xFAD小鼠中显著低于WT小鼠，且肿瘤生长似乎更慢（接种后第20和28天体积更小）。这与上述研究显示氨基甲酸乙酯处理5xFAD小鼠肺肿瘤发生率显著降低的结果一致。我们的结果也与最近一项研究相符，该研究显示在6月龄5xFAD和AD样SAMP8小鼠中，由氧化偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠诱导的结直肠癌发生率降低，这由肠道微生物群通过诱导炎症耐受介导。此外，另一项近期研究显示，暴露于致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物的老龄3xTg小鼠均未发展出口腔肿瘤。值得注意的是，该研究还报道了皮下接种B16黑色素瘤细胞的老龄3xTg小鼠表现出对外源性肿瘤生长的保护作用，这一发现与我们在5xFAD模型中的观察非常相似。所有这些结果均与流行病学报告中AD患者对癌症发展具有保护作用的发现一致。AD转基因小鼠中肿瘤较少的这一结果也与使用肿瘤细胞系（包括MDA-MB231乳腺癌、B16F鼠黑色素瘤和U87-L胶质母细胞瘤细胞）的体外研究一致，这些研究表明与过表达APP（尤其是家族性AD相关的瑞典突变）的SH-SY5Y或HEK293细胞的条件培养基孵育可显著抑制肿瘤细胞增殖，这归因于条件培养基中存在Aβ肽，而非可溶性APP。
我们在研究中选择黑色素瘤细胞是因为B16F0细胞系是一种特征明确的肿瘤株，与C57BL/6小鼠同基因，且不发生转移。该细胞易于皮下植入并可目视监测。此外，包括黑色素瘤在内的皮肤癌在多项研究中与AD呈反向相关。最近一项研究揭示了脑转移性黑色素瘤细胞分泌Aβ，可抑制小胶质细胞对癌细胞的吞噬作用，从而促进其生长。我们在研究中验证了无转移（包括脑转移）发生。尽管如此，本研究的一个局限性是缺乏非肿瘤性黑色素细胞（如Melan-A）注射的对照。Melan-A细胞与B16黑色素瘤及其亚系同基因，为研究黑色素瘤恶性的细胞和分子基础提供了极好的平行非致瘤性系。虽然Melan-A细胞作为体外机制比较的非致瘤性黑色素细胞参考，但将其用作体内注射对照在同基因B16黑色素瘤模型中并非标准做法。然而，未来研究中纳入此类对照将有助于进一步区分肿瘤特异性效应与对黑色素细胞植入的更普遍反应。此外，上文提到的最新研究中，外周注射肺癌、前列腺癌和结肠癌细胞引发了免疫-小胶质细胞串扰，而未注射非肿瘤细胞对照，这支持了肿瘤相关生物学信号（而非普通细胞植入）足以在AD模型中驱动疾病修饰性免疫效应的概念。
将5xFAD小鼠分为荷瘤和非荷瘤亚组显示，两组在绿洲迷宫中均表现出改善的表现。这表明肿瘤生长并非认知获益所必需，并提示仅黑色素瘤细胞接种就足以诱导神经行为变化，可能通过外周免疫调节实现。我们研究了黑色素瘤细胞接种对免疫系统的影响。与先前报道一致，黑色素瘤未在血清中诱导可检测的抗体产生。对脾脏中与免疫反应相关的细胞免疫群体的分析显示，与5xFAD/溶剂小鼠相比，接种B16F0的5xFAD小鼠髓系细胞群显著增加，提示以髓系扩增为特征的外周免疫反应。与这一结论相符，新兴的AD疗法正在探索免疫系统调节作为延缓疾病进展的策略。Schwartz团队提出AD涉及免疫监视受损。他们已证明，在5xFAD小鼠中清除调节性T细胞或阻断免疫检查点（如PD-1/PD-L1）可诱导IFN-γ驱动的外周免疫反应，将有益髓系免疫细胞募集到大脑，减少Aβ斑块和神经炎症，并改善认知。基于此，新型抗PD-L1抗体（如IBC-Ab002）正在开发中。遵循这一思路，我们在实验中观察到的黑色素瘤接种诱导的系统性髓系扩增可能与更多髓系细胞被募集到大脑有关，从而与小胶质细胞协作解决AD病理。有证据表明，在AD中髓系细胞可穿过血脑屏障，在轻度系统性炎症或辐照后，外周单核细胞进入中枢神经系统并采用小胶质细胞样表型。此外，缺乏CCL2受体（该受体介导单核细胞和巨噬细胞向大脑的募集）的APP/PS1小鼠表现出更早且更严重的认知缺陷，提示外周免疫细胞的系统性募集具有有益效应。
未来研究可以探究重新引入肿瘤接种后观察到的免疫变化是否足以重现对AD相关结果的影响。同时，探索免疫调节干预对疾病进展的影响是另一个有趣的机制实验，尽管超出了本研究的范围。其他有趣的研究可能包括在免疫缺陷的AD小鼠中引入肿瘤相关免疫变化，在免疫受控环境下评估结果是否仅由免疫变化引起，还是由代谢物、肠道微生物组等其他因素共同作用所致。
关于星形胶质细胞的变化，我们发现5xFAD小鼠海马CA3区GFAP阳性面积增加，这与该年龄段5xFAD小鼠区域特异性星形胶质细胞增生的报道一致。然而，我们未观察到星形胶质细胞数量的变化。其他海马亚区的GFAP+增加不显著。这与文献中关于5xFAD小鼠星形胶质细胞增生起始年龄的差异一致。黑色素瘤接种未改变GFAP染色，表明在我们的模型中肿瘤的存在不影响星形胶质细胞反应性。这与某些肿瘤模型（如乳腺腺癌）的结果形成对比，后者显示癌症降低了几个脑区的GFAP免疫反应性。同样，在涉及67NR乳腺肿瘤的模型中，肿瘤减少了CA1区的GFAP阳性面积，特别是在接受脂多糖刺激的动物中。这些差异可能反映了肿瘤类型、神经炎症背景或脑区特异性反应的不同。我们未观察到5xFAD小鼠注射溶剂后小胶质细胞染色的增加，此前在4-5月龄时有报道。这可能是由于免疫荧光技术或定量方法、测量的具体区域或性别与基因型所致变异性的差异。
我们的结果未显示小胶质细胞数量或Iba1+面积的显著变化。然而，对这些细胞形态的分析显示5xFAD/溶剂小鼠的胞体面积显著增加，表明小胶质细胞激活。有趣的是，B16F0注射显著降低了5xFAD/溶剂小鼠在海马所有3个区域观察到的胞体面积增加，表明肿瘤注射诱导了小胶质细胞激活的减弱。这些结果与一项关于AD患者小胶质细胞形态的研究一致，该研究显示分枝状小胶质细胞减少，呈现更反应性/阿米巴样形态，但不影响其数量。此外，他们还显示免疫疗法清除Aβ后，小胶质细胞分枝增加。
小胶质细胞胞体圆形度的分析显示，肿瘤注射诱导了区域特异性变化：DG区圆形度降低，CA3区圆形度增加，而CA1区无变化。我们对此区域特异性变化无明确解释。所有这些结果表明大脑对黑色素瘤细胞接种诱导的外周免疫调节产生了反应。然而，尽管达到了统计学显著性，但个体数据点的高度分散性表明存在显著的异质性，且某些观察到的差异可能细微且具有区域特异性，但突出了区域调制和趋势一致性（而非仅效应大小）的生物学意义。有证据表明，外周肿瘤可以改变大脑的免疫环境。具体而言，肿瘤已被证明可调节脂多糖诱导的神经炎症，反映在细胞因子谱和包括DG和CA1在内的海马区小胶质细胞激活状态的变化上。这种效应在肿瘤切除后逆转，突显了潜在的肿瘤介导的免疫调节机制，该机制影响中枢神经炎症反应。将癌症与AD联系起来的系统性免疫机制证据来自对膀胱癌患者的报告，与未接受治疗者相比，接受卡介苗（BCG）治疗者患AD的风险降低。此外，流感、肺炎球菌和带状疱疹疫苗接种也与AD风险降低相关。
我们未观察到黑色素瘤细胞接种后5xFAD小鼠淀粉样蛋白负荷的变化，尽管认知表现有所改善。这一发现与先前的研究一致，即行为改善可以在不伴随淀粉样蛋白减少的情况下发生。例如，在3xTg-AD小鼠中鼻内给予抗CD3抗体逆转了认知缺陷，而未影响Aβ斑块沉积。类似地，对6-7月龄APP/PS1小鼠进行BCG疫苗免疫改善了行为表现并减轻了神经炎症反应，但未改变β-淀粉样蛋白负荷。此外，给予5xFAD小鼠抗淀粉样蛋白单克隆抗体aducanumab对斑块负荷影响较弱，但显著减少了神经突营养不良，表明治疗获益可能超出Aβ本身的清除。然而，我们不能排除可测量的斑块负荷减少可能需要超过一个月的更长作用时间，或者可能存在我们研究中未检测到的斑块大小或形态的变化。未来可进行量化分割的进一步研究。
尽管我们的数据未显示5xFAD小鼠海马或皮层Ifn-γ mRNA水平有显著变化，但我们发现5xFAD/溶剂小鼠海马和皮层Cxcl10 mRNA（续前句）水平相比WT小鼠（无论注射溶剂还是B16F0）升高。这一观察与先前发现AD患者血浆、脑脊液和前额叶皮层中CXCL10水平升高的结果一致，提示该趋化因子在AD相关神经炎症中的作用。然而，我们未观察到B16F0注射后Cxcl10 mRNA水平的变化。任何条件下IFN-γ mRNA转录本水平均无变化。这可能表明IFN-γ未参与该过程，或者IFN-γ测定的时机未捕捉到更早的变化，突显了炎症信号传导中时间动态的重要性。已有报道CXCL10同时具有促肿瘤和抗肿瘤功能，强调时间和背景因素在其调节和生物学影响中的重要性。CXCL10已被认为与Aβ积累和认知衰退有关，并可促进CD8+ T细胞浸润和胶质细胞激活，这些效应可被CXCL10阻断所减轻。未来采用无偏见的分子筛选方法（如批量RNA测序和单细胞RNA测序）的研究，对于识别参与这些过程的其他炎症介质将十分重要。
本研究存在若干局限性。首先，部分实验（特别是脾脏免疫细胞测量实验）中动物数量较少。组织固定不足导致部分动物无法纳入GFAP和Iba1染色分析。另一个局限性是使用了转基因小鼠模型，特别是已知病程侵袭性较强、发病年龄很低的5xFAD模型。尽管如此，该模型具有研究周期较短的优点，并已在众多其他报告中使用。未来研究应探究在更温和的转基因小鼠模型（如APP/PS1）中接种黑色素细胞的效果。此外，研究其他癌细胞类型接种对转基因小鼠认知行为的影响也将很有意义。另一个局限性是绿洲迷宫作为小鼠行为测试的验证有限；不过，我们先前已展示过该行为测试的结果。最后，如前所述，本研究的另一个局限性是缺乏非肿瘤性黑色素细胞（如Melan-A）注射的对照实验。我们未检测到血浆炎症细胞因子水平的变化，可能是由于技术或方法学问题，尽管这在5xFAD小鼠中并非一致的发现。尽管如此，尽管本研究未观察到经典的炎症信号（如IFN-γ或血浆细胞因子），但存在提示性的功能性免疫效应，这可能归因于替代机制，如髓系重编程。
最后，本研究的一个主要局限性是缺乏肿瘤接种后认知获益的潜在机制解释。然而，我们在动物模型中再现了一些流行病学研究观察到的癌症与AD反向关联的现象，并尝试了理解这种相互保护机制的第一种近似方法。尽管如此，我们的发现有助于理解癌症与AD之间的反向关联，并为未来探索神经免疫串扰作为阿尔茨海默病潜在治疗策略的研究提供了基础。
方法
（译者注：方法部分为详细的实验步骤描述，遵循与前文相同的翻译原则，在保持科学准确性的前提下进行翻译。因篇幅限制，此处将方法部分的核心内容概括翻译如下）
动物与实验设计：使用5xFAD转基因小鼠（携带APP和PS1突变）及其C57BL/6野生型同窝对照。将5月龄小鼠分为四组：WT/溶剂、5xFAD/溶剂、WT/B16F0、5xFAD/B16F0。B16F0组皮下注射4000个B16F0黑色素瘤细胞（悬浮于100μL盐水），溶剂组注射等量盐水。监测肿瘤生长28天，随后进行行为测试和组织学分析。所有动物程序均经智利大学医学院动物研究生物伦理委员会批准。
黑色素瘤细胞B16F0：B16-F0细胞在添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基中培养，于37°C和5% CO2条件下维持。
行为测试：实验动物在注射后两周开始进行Y迷宫和绿洲迷宫任务。Y迷宫评估空间工作记忆，记录进入新异臂的百分比。绿洲迷宫评估空间学习和记忆，记录命中率、潜伏期、路径效率和总移动距离。
神经病理学分析：脑组织经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，进行ThS、4G8、Iba-1和GFAP染色，分析淀粉样蛋白负荷、小胶质细胞和星形胶质细胞形态。
β淀粉样蛋白负荷：使用4G8抗体和ThS染色评估Aβ斑块负荷。
神经炎症标志物：通过免疫荧光染色检测星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba-1），并使用ImageJ软件进行形态学分析。
mRNA提取和RT-qPCR：使用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录后进行qPCR分析Cxcl10和Ifn-γ基因表达，以β-肌动蛋白作为参考基因。
脾脏免疫细胞分析：脾脏经机械解离和酶消化后，进行流式细胞术分析免疫细胞群。
血清黑色素瘤抗体测定：使用基于细胞的结合试验，通过流式细胞术检测血清中识别B16F0黑色素瘤抗原的抗体。
血浆细胞因子水平定量：使用BD™ Cytometric Bead Array试剂盒定量血浆IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-2和IL-17水平。
统计分析：结果以均值±标准误（SEM）表示，使用GraphPad软件进行统计分析，根据数据情况采用t检验、单因素或双因素方差分析（Tukey事后检验），或非参数Kruskal-Wallis检验。在双因素方差分析中计算偏η²（ηp²）作为效应量。
数据可用性：本研究生成和分析的数据集已存入智利大学研究数据存储库，可通过指定URL公开获取。
缩写：文章列出了4G8、5xFAD、Aβ、AD、aMCI、CA1、CA3、CNS、DG、GFAP、Iba1、Tg、ThS、WT等缩写的全称。
参考文献：文章列出了93篇参考文献，详细列出了引用的研究论文、综述和方法学文献。
补充信息：文章提供了补充材料（DOCX格式）的链接。
权利与许可：本文采用知识共享署名-非商业性-禁止演绎4.0国际许可协议。
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