SLAMF7定义了人类效应CD8 T细胞的亚群
长期控制病毒复制依赖于记忆T细胞在二次免疫反应中有效分化为效应T细胞。最近的研究发现了记忆T细胞和耗竭T细胞的前体，表明存在类似祖细胞的效应T细胞。这些细胞可以在没有抗原挑战的情况下持续存在，但在回忆免疫反应中会扩展并获得效应功能。在这项研究中，我们证明了SLAMF7与CD27或TCF-1的组合可以有效识别类似祖细胞的效应CD8 T细胞，而SLAMF7与GPR56或TOX的组合则定义了效应CD8 T细胞。这些标记物使得这些不同的细胞亚群可以清晰分离。SLAMF7+ CD8 T细胞在HIV、HCV、CMV和SARS-CoV-2病毒感染期间以及衰老过程中动态调节。我们进一步在表型和转录水平上描述了SLAMF7特征。值得注意的是，在衰老过程中，SLAMF7通路失调，导致STAT1的持续磷酸化。此外，在IL-15存在下SLAMF7结合可诱导TCF-1表达，从而促进类似祖细胞的效应CD8 T细胞的稳态增殖。
T细胞随着年龄的增长在转录和功能上进化为多种表型。持续感染、低级别炎症和胸腺退化的负担独立贡献于免疫细胞分化，导致异质性的T细胞表型发展。尽管在癌症和慢性感染中对T细胞耗竭的研究取得了很大进展，但T细胞“复制性衰老”在这些背景下的发展仍知之甚少。识别区分早期效应（或类似祖细胞的效应）与终末效应T细胞的标志物对于优化免疫疗法至关重要，特别是基于免疫检查点阻断或促进T细胞前体分化为功能性效应T细胞的疗法。
效应T细胞终末分化的因素是多方面的。胸腺萎缩与慢性感染（如CMV）中的持续T细胞受体（TCR）激活相结合，促进了T细胞的记忆膨胀。持续潜伏的CMV感染驱动外周血中CMV特异性T细胞的积累，表现出“效应”表型。类似于成纤维细胞的复制性衰老，终末分化的T细胞表现出特定特征，如端粒缩短、增殖能力降低、线粒体功能改变、p53和p38 MAPK表达升高以及活性氧（ROS）产生增加。然而，这些T细胞衰老的标志尚未与可靠的表型标志物一致联系起来。几项研究探索了T细胞衰老的潜在特征，包括细胞周期调节因子p16、p21和p27的检测。与终末分化相关的表面标志物包括CD27和CD28的丢失以及CD57和KLRG1表达的获得。最近，GPR56作为识别功能记忆、效应和终末分化T细胞的标志物出现。尽管有这些发现，但仍需进一步验证以可靠识别类似祖细胞的效应CD8 T细胞，这在本研究中进行了探讨。
终末分化CD8 T细胞和NK细胞共享一些共同的转录特征，包括T-bet、Eomes、ZEB2、RUNX3和HOBIT的表达。这些转录因子不仅调控这些细胞的分化，还调控其细胞毒性特性及其优先代谢途径。在这里，我们研究了效应CD8 T细胞和抗原特异性T细胞在衰老过程中的标志性转录特征。
通过单细胞蛋白质组学和RNA测序，我们确定了SLAMF7（也称为CRACC、CD319、CS1）作为效应CD8 T细胞的早期标志物。SLAMF7最初被证明调节NK细胞，以及髓系和浆细胞的活性。在系统性红斑狼疮（SLE）患者中，记忆和效应CD8 T细胞中观察到较低的SLAMF7表达水平。这种缺陷可以通过SLAMF7结合来逆转，增强抗原特异性CD8 T细胞的细胞毒性。在老年供体中，CMV特异性CD8 T细胞的扩增可能导致TCR库限制，从而导致疫苗接种反应差和肿瘤免疫力减弱。因此，我们调查了CMV特异性CD8 T细胞的特征是否随年龄变化，以及SLAMF7是否影响这些细胞的功能。受损的CD8 T细胞细胞毒性可能导致组织中终末分化细胞的积累，从而增加“炎症衰老”。我们评估了SLAMF7信号通路，以确定其调控机制。
SLAMF7作为早期效应标志物的鉴定可能有助于开发策略，以逆转终末分化带来的不利影响，这可能会阻碍对免疫疗法的反应，同时增强免疫细胞效应功能。在这里，我们描述了SLAMF7在衰老和慢性感染（如CMV或HIV感染者）个体中的表达变化。尽管SLAMF7+CD8 T细胞表现出异质性，但我们确定了两个主要亚群，其特征在于差异表达的CD27/TCF-1（与CD5/CD127共表达）和GPR56/TOX（与CX3CR1/SLAMF6共表达）。这些亚群的频率可能预测患者对检查点阻断疗法的反应和效应T细胞的功能能力。
SLAMF7 表达 T 细胞的异质性
我们首先使用包含26种抗体的高维流式细胞术面板，研究了SLAMF7在主要T细胞亚群中的表达模式。通过UMAP可视化，基于19种表面标记物的组合表达进行无监督聚类，鉴定了富含SLAMF7的簇。这些SLAMF7+簇存在于CD4和CD8 T细胞中，并与高表达的转录因子（如T-bet、RUNX3、HOBIT）、趋化因子受体（如CX3CR1、CCR5）和其他表面标记物（如GPR56、CD57、KLRG1、CD244）密切相关。这一发现与先前的RNAseq数据一致，我们现在将其扩展到CD8 T细胞亚群的蛋白质水平见解，包括干细胞记忆（SCM）、中央记忆（CM）和效应记忆（TEM）群体。为了评估SLAMF7表达与T细胞分化的关系，我们开发了一个线性蛋白模型，追踪标记物表达的动力学。SLAMF7表达与T-bet、RUNX3、HOBIT、KLRG1、CD57、CX3CR1和GPR56同步增加，并伴随CD27和CD45RO表达的丧失，证实SLAMF7是T细胞逐步分化的标志。
SLAMF7 表达 T 细胞的多组学特征
为了进一步研究SLAMF7表达的功能意义，我们分析了其与T细胞效应功能的关联。多克隆刺激的SLAMF7+ T细胞表现出高水平的IFN-γ、TNF-α、CD107a、颗粒酶B和Eomes表达，但CD154、IL-2和IL-17A的水平较低。使用SPICE分析，我们根据CD154表达将数据分类为CD4和CD8 T细胞。SLAMF7+ CD154- T细胞（主要是CD8）显示出比SLAMF7- T细胞更高的多功能性。值得注意的是，SLAMF7+ T细胞在IFN-γ（p<0.001）、CD107a（p<0.01）、颗粒酶B（p<0.01）和Eomes（p<0.01）的频率方面显著高于其SLAMF7- 对照组。
SLAMF7 在病毒特异性 T 细胞中的表达
然后我们探讨了SLAMF7在病毒特异性T细胞中的作用，特别是在衰老、疫苗接种和病毒感染（HIV、SARS-CoV-2）期间。SLAMF7主要表达于CMV、GAG、刺突或MNO特异性CD8 T细胞中。鉴于SLAMF7+ T细胞的异质性，我们结合其他标记物进一步定义这些病毒特异性T细胞。对于EBV特异性CD8 T细胞，SLAMF7与CXCR3或CXCR5相关，而CMV特异性CD8 T细胞则表达较高水平的CD45RA、KLRG1或CD160（p<0.01）。
SLAMF7 信号传导在衰老中的作用
我们专注于SLAMF7在SLAM通路中的信号传导，以确定该通路是否在衰老过程中发生改变。RNA测序用于评估CMV特异性CD8 T细胞中该通路成分的mRNA表达。在老年供体的CMV特异性CD8 T细胞中，ELF3、CSK、VAV1、LY9、PIK3CG和ZAP70 mRNA过表达。观察到LCK（p<0.05）、SAP（p<0.05）、ZAP70（p<0.01）或LY9（p<0.01）的显著上调。有趣的是，许多这些转录本不与其他SLAM信号成分相关，如SLAMF7、FYN或PTPN11，表明在CMV特异性CD8 T细胞衰老过程中存在非经典SLAM通路。
SLAMF7+ CD8 T细胞的稳态调控
接下来，我们试图阐明调控SLAMF7表达的机制。由于效应CD8 T细胞缺乏表面IL-7R，它们的长期存活依赖于IL-15。我们研究了IL-15是否可以在TCR刺激期间调节SLAMF7表达。SLAMF7上调与抑制性受体（如PD-1、Tim-3、LAG-3和CD85j）表达增加相关，但不与CD39、CD57、KLRG1、GPR56或CX3CR1相关。我们假设IL-15可能更有利于类似祖细胞的效应CD8 T细胞而非终末效应CD8 T细胞的扩展。为了测试这一点，我们测量了CellTrace™ Violet染色的CD8 T细胞在TCR刺激下，有无IL-15条件下的增殖情况。我们确认CD27+ CD8 T细胞增殖，而CD57+ KLRG1+ CD8 T细胞则不增殖。SLAMF7+CD57-表现出比SLAMF7+CD57+ CD8 T细胞更高的增殖率（p<0.0001），且IL-15增强了所有亚群的增殖（p<0.05）。进一步地，CD27+TCF-1+ CD8 T细胞在SLAMF7结合后的增殖明显高于IgG对照（p<0.05），表明SLAMF7+CD57- CD27+TCF-1+细胞代表一个能够响应TCR或SLAMF7结合和IL-15刺激而增殖的类似祖细胞的效应亚群。
讨论
本研究的主要目的是通过使用已建立的标记物（如CD27、CD57、GPR56、KLRG1）以及较少研究的SLAMF7，深入了解终末分化CD8 T细胞的起源，以阐明其异质性。CD8 T细胞的多样性与其免疫历史密切相关，我们在不同的队列中分析了它们的分化动力学，包括健康的年轻和老年人、慢性HIV感染者或潜伏感染（EBV和CMV）者以及患有合并症的人群。
我们的发现揭示了CD8 T细胞在分化过程中早期获得SLAMF7，挑战了仅基于CD27或CD28表达丢失将某些CD8 T细胞归类为“衰老”的分类方式。为了更精确地区分早期与晚期阶段的CD8 T细胞分化，我们建议使用SLAMF7、CD27和GPR56作为关键标记物，以区分类似祖细胞和终末效应T细胞，显示出几乎独有的表达，使分类更加精确。
这项研究的独特之处在于记录了表面标记物（CD5、CD28、CD127、KLRG1、CX3CR1和CD57）和细胞内转录因子（TCF-1、TOX、Eomes、T-bet、RUNX3和HOBIT），以提供CD8 T细胞亚群的全面表型特征。首次在衰老背景下，我们提供了人类T细胞中TF的详细特征。TCF-1表达与CD27+亚群相关，而TOX在GPR56+亚群中更为突出，表明其在启动和维持效应分化中的可能作用。TF表达在抗原特异性CD8 T细胞中受到严格调控，RUNX3和Eomes在早期出现，而T-bet和HOBIT则在后期出现。这表明RUNX3和Eomes可能启动分化，而T-bet和HOBIT则维持和锁定分化。这一假设需要在动物模型中验证，以确定诱导强大持久效应免疫反应的治疗窗口。其次，不同功能的CD8 T细胞亚群中TF表达具有优先性。终末效应CD8 T细胞确实表现为T-bethighEomeslow，而耗竭CD8 T细胞则表现为T-betlowEomeshigh，这与之前的研究一致。此外，TOX和TCF-1的共表达表明了专门功能，如在慢性感染和癌症中，CD8 T细胞作为耗竭前体（TPEX）细胞的前体。TPEX的干性特性使其能够在免疫检查点阻断后增殖并恢复强大的T细胞免疫。同样，在慢性病毒感染（包括HCV和HIV）和癌症中，幼稚和中央记忆CD8 T细胞表达TCF-1而不表达TOX，而效应和耗竭CD8 T细胞则为TCF-1-TOX+，这意味着持续的TCR激活因病毒或肿瘤抗原的存在而增强了T细胞分化和TOX的获得。在之前的报告中，TCF-1和TOX在人CMV、EBV、流感和HIV特异性CD8 T细胞中差异表达。我们确认了先前的观察结果，即CMV特异性CD8 T细胞中TCF-1表达频率随着年龄的增长而下降，这可能损害对潜伏感染的免疫力。
在老年供体的CMV特异性CD8 T细胞中，TOX蛋白表达仍然升高，与终末效应基因（如ZEB2、TBX21、GPR56和KLRG1）相关，但与效应功能基因（如GZMB、PRF1、GZMH）或效应TF（如RUNX3或ZNF683（HOBIT））无关。已知TOX自调控其转录，并控制其他转录因子，如Tcf7或Nr4a2。然而，TOX在衰老过程中对表观遗传和转录活性的调控仍不清楚，需要进一步研究以阐明其在衰老免疫功能中的作用。
SLAMF7亚型最初在NK细胞中描述，也被发现在T细胞中发挥重要作用。长SLAMF7变体与短SLAMF7变体的比例影响信号传导，已在自身免疫疾病如系统性红斑狼疮中描述，但其在衰老中的作用仍有待确定。需要进一步研究以调和体内系统性单核细胞激活（sCD14），这与CD8 T细胞上的SLAMF7表达相关，与SLAMF7结合对活化单核细胞促炎细胞因子分泌的抑制作用相矛盾。
在接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者中，我们观察到CD127（长期免疫记忆的标志物）增加，以及抑制性受体（Tim-3、Caecam-1）和与终末分化和耗竭相关的转录因子（T-bet/Eomes）减少。然而，CD8 T细胞上的SLAMF7表达，包括HIV特异性CD8 T细胞，仍然升高。HIV感染期间TOX表达的增加提示这些分子可能是恢复HIV感染者免疫活力的潜在治疗靶点。慢性感染史和衰老期间的持续炎症在免疫信号通路中留下了深刻印记，可能破坏Wnt/β-Catenin家族信号传导，包括TCF1，因此影响T细胞的干性。我们还在老年个体的CMV特异性CD8 T细胞中检测到与SLAM家族相关的基因调控。因此，单独阻断SLAMF7或TOX可能不足以恢复完整的通路功能。
我们还探讨了直接靶向SLAMF7是否可以增强免疫功能，特别是通过扩展或增强类似祖细胞的效应CD8 T细胞分化为有竞争力的效应T细胞。SLAMF7结合可能增强对持续抗原（如癌症或慢性感染）的免疫监测，正如在系统性红斑狼疮、多微生物败血症和慢性炎症（如克罗恩病、严重COVID-19）中所观察到的那样。此外，新型疗法如CAR T细胞或Elotuzumab已在多发性骨髓瘤（MM）中成功靶向SLAMF7。有趣的是，高频率SLAMF7+CD8 T细胞的MM患者表现出较差的抗肿瘤反应，这表明SLAMF7靶向疗法具有更广泛的应用潜力。SLAMF7衍生肽疫苗的概念验证仅在体外直接刺激抗肿瘤CD8 T细胞，从而诱导MM细胞的裂解。SLAMF7的激动剂结合可以直接增强肿瘤特异性CD4 T细胞的细胞毒性，但我们只观察到SLAMF7结合后健康供体中CMV特异性CD8 T细胞的细胞溶解潜能略有增加。
IL-15刺激已被证明能驱动SLAMF7+CD27+ CD8 T细胞的增殖，TCF-1表达指示类似祖细胞状态。鉴于IL-15在支持动物模型中幼稚和记忆CD8 T细胞的作用，它代表了另一条治疗途径，与SLAMF7结合一起，以促进人类强健的T细胞免疫。IL-15还增强了TSCM CD8的抗肿瘤活性。IL-15还可以驱动组织驻留CD8 T细胞的分化，扩展CX3CR1+CD57+ CD8 T细胞或颗粒酶B+ CD8 T细胞在HIV感染者中，并维持骨髓中终末分化的CD8 T细胞。
总之，我们确定SLAMF7作为CD57的替代标志物，与CD27、GPR56和转录因子（如TOX、TCF-1和Eomes）一起，作为识别效应T细胞亚群的强大工具。这些标记物及其相互作用在不同免疫史（如衰老、持续病毒感染和慢性炎症）中的精细调控可能成为恢复或增强衰老人群或慢性感染个体免疫功能的有希望的治疗靶点。
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